CC BY
51
Химия растительного сырья. 2011. №4. С. 65-70.
УДК 547.918:547.757:577.112.37:543.51:581.142
МОЛЕКУЛЯРНОЕ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ САПОНИНОВ ПЛЮЩА С L-ТРИПТОФАНОМ
© Л.А. Яковишин1, A.B. Лекарь2, С.Н. Борисенко3, Е.В. Ветрова3, Н.И. Борисенко2, В.И. Гришковец4
1 Севастопольский национальный технический университет, ул. Университетская, 33, Севастополь, 99053 (Украина), e-mail: [email protected]
2Эколого-аналитический центр Южного федерального университета, ул. Зорге, 7, Ростов-на-Дону, 344090 (Россия)
3НИИ физической и органической химии Южного федерального университета, пр. Стачки, 194/2, Ростов-на-Дону, 344090 (Россия)
4Таврический национальныйуниверситет им. В.И. Вернадского, пр. Вернадского, 4, Симферополь, 95007 (Украина)
Впервые методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением исследовано молекулярное комплексооб-разование L-триптофана с 3-0-а-Ь-рамнопиранозил-(1^2)-0-а-Ь-арабинопиранозидом хедерагенина (а-хедерином) и его 28-0-а-Ь-рамнопиранозил-(1^4)-0-Р-Б-глюкопиранозил-(1^6)-С>-Р-В-глюкопиранозиловым эфиром (хедерасапонином С), Показано, что наиболее устойчивый комплекс дает а-хедерин, Изучено влияние гликозидов, L-триптофана и их смесей на всхожесть семян Avena sativa L,
Ключевые слова: плющ, тритерпеновые сапонины, а-хедерин, хедерасапонин С, L-триптофан, молекулярное ком-плексообразование, масс-спектрометрия, ионизация электрораспылением, всхожесть семян, Avena sativa L,
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ П-03-12141-офи-м-2011, гранта президента РФ МК-4425.2011, гранта РНП 2.2.2.2.12560 и ФЦП «Научные и педагогические кадры инновационной России», г/к 16.740.11.060.
Введение
В последние годы значительно возрос интерес к получению молекулярных комплексов сапонинов и изучению их свойств. Гликозидное клатрирование биологически актив ных веществ является перспектив -ным методом создания новых низкодозных лекарственных препаратов [1]. В связи с этим были получены комплексы сапонинов с протеиногенными аминокислотами, в частности с Z-триптофаном (Trp). Trp - это незаменимая аминокислота, входящая в состав многих белков. В организме она превращается в серотонин, триптамин, гетероауксин и другие физиологически активные вещества [2].
Рассмотрена возможность комплексообразования Trp с гликозидами неотигогенина и гитогенина. На основе времяпролетной плазменно-десорбционной масс-спектрометрии с ионизацией осколками деления 252Cf было установлено, что биозид и триозид неотигогенина не образуют комплексов с Trp [3, 4]. Однако комплекс биозида гитогенина (петуниозида D) был найден [5, 6].
Получены комплексы сердечных гликозидов дигоксина и К-строфантина-ß с Trp и тройные комплексы, содержащие дополнительно катионы Ca2+ и Mg2+ [7]. Соединения были охарактеризованы методами ЯМР- и УФ-спектроскопии. Показано, что комплекс дигоксина является более устойчивым.
В качестве новых комплексообразователей биологически активных молекул нами предложены тритерпеновые сапонины различных видов плюща Hedera L. (Araliaceae) [8]. Это гликозиды а-хедерин (3-0-а-£-рамнопиранозил-(1^-2)-0-а-£-арабинопиранозид хедерагенина, гликозид 1) и хедерасапонин С (3-0-
* Автор, с которым следует вести переписку,
а-£-рамнопиранозил-(1 ^2)-0-а-£-арабинопиранозил-28-0-а-£-рамнопиранозил-(1 ^-4)-0-р-£>-глюкопирано-зил-(1^-6)-0-р-0-глюкопиранозид хедерагенина, гликозид 2), обусловливающие фармакологическую активность лекарственных препаратов на основе плюща.
Гликозид 1: Ri=Rhapa-(1^2)-Arapa^, R2=H Триптофан (Tip)
Гликозид 2: R1=Rhapa-(1^2)-Arapa^, R2=^P Glcp-(6^1 )-PGlcp-(4^ 1 )-aRhap
Были синтезированы комплексы некоторых протеиногенных аминокислот с гликозидами 1 [9-12] и
2 [11, 12]. Комплексообразование подтверждено методами ИК-, УФ- и масс-спектроскопии. При этом масс-спектрометрическое исследование молекулярного комплексообразования гликозидов 1 и 2 с Trp еще не проводилось.
Экспериментальная часть
Гликозиды 1 и 2 выделяли из листьев плющей H. taurica Cari. и H. canariensis Willd. и подтверждали их строение по методикам, приведенным в работах [13, 14]. Комплексы 1 получали путем смешивания растворов, содержащих по 1 ммоль гликозида и 1 ммоль Trp, а 2 - в молярном соотношении 1 : 2 (растворитель - смесь 70%-ного водного раствора C2H5OH и CHCl3 в соотношении 3 : 1 по объему). Растворы выдерживали при 50 °C в течение 1,5 ч при постоянном перемешивании. Органические растворители отгоняли в вакууме, а полученные смеси использовали для съемки масс-спектров.
Измерения проведены с помощью масс-спектрометра «Bruker Daltonics micrOTOF-Q» с прямым вводом пробы, ионизация электрораспылением, детектирование отрицательных и положительных ионов в интервале от 50 до 3000 Да с точностью не менее 1<10-2 Да. Напряжение на капилляре распылителя ±4200 В, параметры газа-осушителя (азот «осч», 5 л/мин, 180 °С) и энергия ионов на квадруполе (5,0 эВ) оптимизированы для детектирования пиков псевдомолекулярных и ассоциатных ионов. Для прямого ввода взяты растворы веществ в ацетонитриле (фирма «Merck», квалификация HPLC/MS) в концентрации до 1 мг/мл, скорость ввода не превышала 0,05 мкл/с. Результаты приведены в таблице 1.
Всхожесть семян Avena sativa L. (Poaceae) проверяли в лабораторных условиях при комнатной температуре (23-25 °C). Для биоиспытаний смеси водных растворов Trp и гликозидов 1 и 2 предварительно перемешивали 60 мин при комнатной температуре. Концентрации индивидуальных гликозидов 1, 2 и Trp, а также веществ в смесях составляли по 10-4 М. К семенам в количестве 25 шт. добавляли 5 мл исследуемого раствора и выдерживали их в нем 24 ч. Растворы сливали, семена промывали дистиллированной водой и помещали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой. Всхожесть семян определяли через 24, 48 и 72 ч (табл. 2). Доверительный интервал вычисляли со степенью надежности а=0,95.
Обсуждениерезультатов
Масс-спектр положительных ионов смеси Trp с гликозидом 1 (табл. 1) содержит как пики протониро-ванных компонентов смеси, так и малоинтенсивные пики ионов, включающих катионы натрия и калия. Наиболее интенсивным является пик [MTrp+H]+. Интенсивности пиков [MTrp+H]+ и [М1+Н]+ отличаются в 28 раз. В спектре найдены протонированные димеры Trp и гликозида 1. Причем интенсивность пика [2MTrp+H]+ в 71
раз больше интенсивности пика [2М1+Н]+. В спектре также обнаружены пики комплексов [M1+MTrp+H]+, [4M1+2MTrp+2H] 2+ и [3 M1+MTrp+2H] 2+, интенсивности которых соотносятся между собой как 115 : 4 : 1.
В спектре смеси гликозида 1 и Trp в режиме отрицательных ионов присутствуют пики ионов самоассоциатов 1, а также [MTrp-H]- И [М1-Н]-. Наряду с данными частицами, идентифицирован ион [M1+MTrp-H]-. Интенсивность его пика 5,87%, что в 11 раз меньше главного пика [MTrp-H]-.
Образование комплексов гликозида 2 с Trp на основе масс-спектра положительных ионов не установлено. В спектре присутствуют только пики протонированной молекулы Trp и аддуктов с Na+ и К+. Однако в режиме отрицательных ионов отмечен малоинтенсивный пик комплекса [M2+MTrp-H]-. Гликозид 1 образует комплекс с таким же молярным соотношением, но интенсивность его пика в 15 раз больше.
В молекуле гликозида 1 присутствует карбоксильная группа, которая, очевидно, участвует в формировании комплекса и, возможно, в наибольшей степени стабилизирует его. Аминокислоты в растворах и в твердом виде существуют преимущественно в цвитгер-ионной форме RCH(NH3+)COO-. Ранее было установлено, что комплексообразование аминокислот с макроциклическими лигандами происходит путем образования водородных связей и ион-дипольных взаимодействий группы NH3+ с до-норными атомами кислорода [15]. На основе ИК-спектроскопии было показано, что в меж-молекулярном взаимодействии в основном уча -ствуют карбоксильная группа агликона хедерагенина гликозида 1 и цвиттер-ион аминокислот [9, 10]. С учетом этого можно предположить, что группа NH3+ Trp образует водородную связь с группой СО кар -боксила гликозида 1 NH3+---O=C. Trp относится к аминокислотам с неполярным боковым радикалом. Поэтому при комплексообразовании возможны гидрофобные взаимодействия индольного радикала Trp с неполярным агликоном гликозида 1.
Молекулы 1 склонны к самоассоциации [16], поэтому в масс-спектре зафиксированы пики комплексов, содержащие по три и четыре молекулы данного гликозида. Такие комплексы менее устойчивы, что можно объяснить вовлечением группы СООН в процесс самоассоциации с формированием полости, в которой располагаются одна или две молекулы Trp. В данных комплексах связывание Trp с гликозидом 1 может происходить за счет образования водородных связей цвитгер-иона с ОН-группами моносахаридных остатков, а также ион-дипольных и гидрофобных взаимодействий.
В молекуле гликозида 2 отсутствует карбоксильная группа. Причем увеличение числа моносахаридных остатков в гликозиде 2, а, следовательно, и количества ОН-групп, не вызывает усиления комплексооб-разования. Известно, что одна молекула гликозида может образовать структуру с внутренней полостью, что было показано на примере глицирризиновой кислоты, преобладающего сапонина солодок [1]. Благода-ря такой особенности они дают клатратные комплексы. Возможно, что и молекула гликозида 2 формирует подобную полость (рис.). Однако молекула Trp имеет наибольший размер среди других протеиногенных ароматических аминокислот и не может эффективно занять эту полость. Поэтому комплекс гликозида 2 оказался наименее устойчивым по сравнению с комплексами других ароматических аминокислот анало-
Таблица 1. Масс-спектры смесей Trp с гликозидами 1 и 2
Ион Соотношение m/z (/0TH, %)
Смесь Trp и гликозида 1
[MTrp-H]- 203,1 (66,67)
[М‘-Н]- 749,4 (27,15)
[M‘+MTrp-H]- 953,5 (5,87)
[М1.. .(М'-Н).. .М1.. .(М‘-Н)]2- 1499,8 (0,73)
или [М1.(М1-2Н).2М1]2-
[(М1-Н).М1 .. .(М‘-Н)]2- или 1125,1 (0,80)
[М1.(М1-2Н).М1]2-
[MTrp+H]+ 205,0 (100)
[MTrp+Na]+ 227,0 (0,65)
[MTrp+K]+ 242,9 (0,19)
[2MTrp+H]+ 409,0 (11,40)
[M‘+MTrp+H]+ 955,3 (9,16)
[M‘+H]+ 751,3 (3,58)
[M*+Na]+ 773,3 (0,65)
[2M*+Na+K]2+ 770,2 (0,59)
[M‘+K]+ 789,2 (0,12)
[3M*+H+K]2+ 1145,4 (0,14)
[3M1+MTrp+2H] 2+ 1330,6 (0,08)
[2M*+H]+ 1501,7 (0,16)
[4M1+2MTrp+2H] 2+ 1705,8 (0,31)
Смесь Trp и гликозида 2
[MTrp-H]- 203,1 (19,85)
[2M2-2H]2- 1219,7 (2,37)
[M2+MTrp-H]- 1423,8 (0,40)
[M2-2H]2- 609,3 (3,16)
[MTrp+H]+ 205,0 (6,53)
[MTrp+Na]+ 227,0 (18,11)
[M2+Na]+ 1243,3 (2,01)
[M2+2Na]2+ 633,1 (9,02)
[M2+K+H]2+ 630,1 (1,03)
[M2+Na+K]2+ 641,1 (0,93)
гичного состава [11]. Гликозид 2 связывается с Trp посредством водородных связей с ОН-группами моно-сахаридных остатков и ион-дипольных взаимодействий.
Rha
Glc
Rha
Формирование полости молекулой гликозида 2
Известно, что тритерпеновые гликозиды являются факторами аллелопатического взаимодействия в фитоценозах [17, 18], что связано с их токсическим действием, приводящим к подавлению роста и развития растений. Для предварительной оценки токсичности комплексов гликозидов 1 и 2 с Trp нами рассмотрено их действие на всхожесть семян A. sativa (табл. 2). Влияние гликозидов на всхожесть и развитие ростка оценивали в течение 72 ч.
Бисдесмозидные гликозиды проявляют низкую токсичность, что объясняется отсутствием свободной карбоксильной группы в их агликонах. Наоборот, гликозиды со свободной (негликозилированной) карбоксильной группой высокоактивны [17]. Действительно, монодесмозидный гликозид 1 подавлял всхожесть семян. Бисдесмозидный гликозид 2 оказался практически неактивным.
На протяжении всего эксперимента всхожесть семян постепенно возрастала. Через 72 ч были получены следующие результаты. Наибольшая всхожесть оказалась у семян в контрольной группе (92%). Всхожесть семян после предварительной обработки раствором гликозида 1 и раствором Trp была близкой и составила 60 и 68% соответственно. Наименьшая всхожесть была отмечена у семян после выдерживания в смесях растворов Trp с гликозидами 1 и 2. Смесь Trp с гликозидом 1 в наибольшей степени подавляет всхожесть. По сравнению с контролем она оказалась в 2 раза меньше. Следовательно, комплексообразова-ние приводит к получению соединений, наиболее активно подавляющих всхожесть.
Таблица 2. Прорастание семян Avena sativa в лабораторных условиях (концентрации индивидуальных веществ и веществ в смесях по 10-4 М)
Соединение
Параметр H2O (контроль) 1 2 Trp Смесь 1-Trp Смесь 2-Trp
Через 24 ч
Всхожесть, % 0 0 0 0 0 0
Длина проростка, мм - - - - - -
Количество с корнем, % 92 92 84 100 80 88
Длина корня, мм 2,6±0,6 3,0±1,4 3,3±0,7 3,0±1,4 2,9±0,9 3,2±0,8
Через 48 ч
Всхожесть, % 56 28 40 48 40 16
Длина проростка, мм 1,0±0,6 0,6±0,9 0,5±1,3 2,7±1,2 1,3±1,1 1,0±0,8
Количество с корнем, % 94 100 88 100 92 88
Длина корня, мм 4,6±0,5 3,3±0,8 3,5±1,2 5,1±1,3 3,0±0,7 3,5±0,7
Через 72 ч
Всхожесть, % 92 60 86 68 44 48
Длина проростка, мм 4,2±0,6 3,5±1,3 3,7±0,6 8,3±0,7 3,9±0,3 1,7±0,6
Количество с корнем, % 96 100 96 100 92 92
Длина корня, мм 7,1±0,6 5,5±1,1 6,4±0,8 10,3±0,8 3,6±0,8 3,7±0,7
Кроме того, смеси гликозидов 1 и 2 с Trp подавляют рост корня по сравнению с индивидуальным Trp примерно в 3 раза, а по сравнению с контролем - примерно в 2 раза. Наименьшая длина проростка была зафиксирована при действии смеси гликозида 2 с Trp. Хотя всхожесть семян после вымачивания в растворе Trp оказалась меньше, чем в контроле, длина корня и проростков при его использовании была максимальной. Так, под действием Trp длина проростка примерно в 2 раза больше, чем под действием индивидуальных гликозидов и по сравнению с контролем.
Ранее было установлено, что комплексы Z-фенилаланина с гликозидами 1 и 2, наоборот, являются менее токсичными, чем индивидуальные гликозиды [12]. Они увеличивали всхожесть семян A. sativa и активно влияли на рост их корня и ростка.
Выводы
1. Методом масс-спекрометрии определен состав молекулярных комплексов тритерпеновых гликозидов плюща с Trp.
2. Установлено, что преобладают комплексы с молярным соотношением компонентов 1:1, среди которых наиболее устойчивым оказался комплекс гликозида 1.
3. Показано, что смеси Trp с гликозидами 1 и 2 подавляют всхожесть семян и дальнейшее развитие проростков A. sativa L.
Список литературы
1. Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Гранкина В.П., Кондратенко P.M., Толстикова Т.Г. Солодка: биоразнообразие, химия, применение в медицине. Новосибирск, 2007. 311 с.
2. Химическая энциклопедия / под ред. Н.С. Зефирова. М., 1998. Т. 5. С. 5.
3. Пилипенко В.В., Аксьонов С.О., Калінкевич О.М., Суходуб Л.Ф. Взаємодія стероїдних глікозидів з амінокислотами: дослідження методом плазменно-десорбційної мас-спектрометрії // Biopolymers and Cell. 2000. T. 16, №3. С. 212-219.
4. Pilipenko V.V., Sukhodub L.F., Aksyonov S.A., Kalinkevich A.N., Kintia P.K. 252Cf Plasma desorption mass spectrometric study of interactions of steroid glycosides with amino acids // Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2000. V. 14. Pp. 819-823.
5. Пилипенко B.B., Суходуб Л.Ф. Мас-спектрометричні дослідження комплексоутворення стероїдних глікозидів
з амінокислотами // Вестник Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина: Биофизический вестник. 2004. №637, вып. 1-2. С. 131-137.
6. Суходуб Л.Ф., Калінкевич О.М. Стероїдні глікозиди рослинного походження та їх комплексоутворення з біо-молекулами (за даними мас-спектрометрії) // Журнал Академії медичних наук України. 2009. Т. 15, №2. С. 225-245.
7. Горчакова H.A., Самарская Т.Г., Самарский В.А., Лезина Г.Г., Грищенко Л.И., Бабак В.В. Комплексообразование сердечных гликозидов с аминокислотами и щелочноземельными металлами // Фармакология и токсикология. 1992. №27. С. 106-109.
8. Yakovishin L.A., Grishkovets V.I., Schroeder G., Borisenko N.I. Molecular complexation of ivy saponins with some drugs and biologically active substances // Functionalized molecules - synthesis, properties and application / ed. V.I. Rybachenko. Donetsk, 2010. Chapter 4. Pp. 85-103.
9. Яковишин Л.А., Гришковец В.И., Рубинсон М.А., Корж Е.Н. Комплексообразование тритерпенового гликозида а-хедерина с гидрофильными протеиногенными аминокислотами // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Сер. «Биология, химия». 2009. Т. 22, №1. С. 208-213.
10. Яковішин Л.О., Рубінсон М.А. Молекулярні комплекси тритерпенового глікозиду а-хедерину з аліфатичними протеїногенними амінокислотами // Ukrainica Bioorganica Acta. 2009. T. 7, №1. C. 32-35.
11. Ветрова В.В., Лекарь A.B., Яковишин Л.А., Борисенко Н.И. Масс-спекгрометрическое исследование комплексов тритерпеновых гликозидов (хедерозидов) с аминокислотами // X Междунар. семинар по магнитному резонансу (спектроскопия, томография и экология). Ростов н/Д, 2010. С. 30.
12. Яковишин Л.А., Гришковец В.И., Сергиенко Ю.И., Корж Е.Н. Молекулярное комплексообразование тритерпеновых гликозидов с L-фенилаланином в водных растворах // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Сер. «Биология, химия». 2010. Т. 23, №3. С. 255-261.
13. Шашков A.C., Гришковец В.И., Лолойко A.A., Чирва В.Я. Тритерпеновые гликозиды Hedera taurica I. Строение таурозида Е из листьев Hedera taurica // Химия природных соединений. 1987. №3. С. 363-366.
14. Гришковец В.И., Сидоров Д.Ю., Яковишин Л.А., Арнаутов H.H., Шашков A.C., Чирва В.Я. Тритерпеновые гликозиды Hedera canariensis I. Строение гликозидов L-A, L-B1, L-B2, L-C, L-D, L-E1, L-G1, L-G2, L-G3, L-G4, L-H1, L-H2 и L-I1 из листьев Hedera canariensis // Химия природных соединений. 1996. №3. C. 377-383.
15. Куликов О.В. Термодинамика образования молекулярных комплексов в водных растворах аминокислот, пептидов, нуклеиновых оснований и макроциклических соединений : автореф. дис. ... д-ра хим. наук. Иваново, 2005. 36 с.
16. Яковишин Л.А., Борисенко Н.И., Руднев М.И., Ветрова Е.В., Гришковец В.И. Самоассоциация и комплексообразование тритерпеновых гликозидов и холестерина // Химия природных соединений. 2010. №1. С. 45-48.
17. Анисимов М.М., Чирва В.Я. О биологической роли тритерпеновых гликозидов // Успехи современной биологии. 1980. Т. 6, №3. С. 351-364.
18. Waller G.R., Jurzysta M., Trohne R.L.Z. Root saponins from alfalfa (Medicago sativa L.) and their allelopathic activity on weeds and wheat // Allelopathy Journal. 1995. V. 2, N1. Pp. 21-30.
Поступило в редакцию 21 февраля 2011 г.
После переработки 14 июня 2011 г.
