CC BY
52
© М. В. Шевченко, А. Н. Сукач, А. Ю. Семенченко удК 577. 112. 5:57. 085. 2
М. В. Шевченко, А. Н. Сукач, А. Ю. Семенченко
молекулярно-массовое распределение пептидов в экстрактах тканей крыс в зависимости от стадии их развития
Институт проблем криобиологии и криомедицины нан Украины (г. Харьков)
Исследование выполнено в соответствии с планом научно-исследовательских работ отдела криобиохимии ИПКиК НАН Украины в рамках темы: «Изучение влияния криоконсервирования на биологические свойства стволовых клеток различного происхождения при монослойном и объемном культивировании и экспериментальной трансплантации», № гос. регистрации 2. 2. 6. 71.
вступление. В последнее время большие надежды возлагаются на использование тканевой и клеточной терапии в лечении ряда различных заболеваний. При этом трансплантацию клеток и тканей предполагается использовать как в качестве замены поврежденных клеток, так и для стимуляции процессов восстановления в организме реципиента. Существует достаточно большое количество данных, свидетельствующих как о положительном влиянии трансплантации клеток и тканей, так и об отсутствии клинического эффекта при их использовании [5]. Причина таких противоречивых результатов не вполне ясна. Известно, что процессы регенерации, как правило, являются функцией стволовых/ прогениторных клеток (как трансплантированных, так и собственных) [7, 8]. Механизмы регуляции пролиферации и дифференциации стволовых/про-гениторных клеток не достаточно ясны. Однако известно, что на функционирование стволовых/про-гениторных клеток оказывает влияние достаточно большое количество растворимых регуляторных факторов, выделяемых как стволовыми клетками, так и клетками их микроокружения [3]. Для понимания условий, при которых возможно появление клинического эффекта в результате использования клеточной/тканевой терапии необходимо определить природу данных факторов, механизм их действия, зависимость их состава от возраста и тканевую специфичность. Одним из подходов проведения таких исследований является изучения влияние действия экстрактов, полученных из разных тканей как на организменном уровне in vivo, так и клеточном in vitro. При этом для адекватной оценки механизмов действия этих экстрактов важно знать их качественный и количественный состав. Наиболее часто регуляторными молекулами являются пептиды с м. м. до 10 кДа, которые проявляют
физиологическую активность в ультрамалых дозах [2, 4].
целью исследования было определение содержания пептидов в экстрактах различных тканей крыс в зависимости от стадии их развития.
Объект и методы исследования. В работе были использованы экстракты тканей головного мозга (ЭМ) и печени (ЭП) новорожденных и 3-месячных крыс, а также экстракты тканей головного мозга эмбрионов и тотальные экстракты (ТЭЭ) целых эмбрионов крыс 15 суток гестации.
Для получения экстрактов ткани мозга, печени, и целого эмбриона гомогенизировали в равном объеме среды DMEM/F12 (Sigma, США). Полученные гомогенаты центрифугировали при 7000 g в течение 10-ти минут, после чего отбирали супернатант и стерилизовали фильтрованием через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм (Millipor, США). Все манипуляции по получению экстрактов проводили в стерильных условиях при температуре +4 °С.
Определение молекулярно-массового распределения фракций экстрактов проводили с помощью гель-проникающей хроматографии [1]. Для этого использовали колонку (400 х 16 мм), заполненную поливиниловым гелем TSK-Gel Toyopearl HW-40 Fine (Toyo Soda Manufacturing Co, Япония), в котором по-липептидные молекулы распределяются линейно в диапазоне от 12000 до 200 Да. В колонку вводили 200 мкл экстракта; в качестве элюента использовали фосфатно-солевой буфер (Na2HPO4 - 18 мМ, NaH2PO4 - 12 мМ, NaCl - 100 мМ, рН - 7,4). Элюент подавался в колонку через петлевый инжектор (0,2 мл) со скоростью потока 100 мл/час. Хроматограммы регистрировали ультрафиолетовым детектором 2238-Uvicord S II, LKB (Швеция) при длине волны 254 нм. Анализ времени удерживания и количественного распределения отдельных фракций в экстрактах проводили при помощи интегратора Waters-746. Колонку калибровали стандартными пептидами с известной молекулярной массой.
Результаты статистически обрабатывали по методу Стьюдента.
Эксперименты проводили согласно правилам «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, которые используются в экспериментальных и других исследовательских целях»
Рис. Типичные хроматограммы экстрактов, тканей мозга (ЭМЭ - эмбрионов; ЭМн - новорожденных; ЭМ-3м - 3-х месячных), печени (ЭПн - новорожденных; ЭП-3м - 3-х месячных) и тотального экстракта
эмбрионов (ТЭЭ) крыс.
(Страсбург, 1986), и в соответствии с «Общими принципами экспериментов на животных», одобренными III Национальным конгрессом по биоэтике (Киев, 2007).
Результаты исследований и их обсуждение. В работе исследовали молекулярно-массовое распределение веществ в экстрактах головного мозга и печени крыс различного возраста, а также целого эмбриона крысы 15 суток гестации. На хроматограммах экстрактов (рис.) одинаковыми буквенными символами обозначены пики, которые соответствуют веществам с одинаковой молекулярной массой. При этом вещества с молекулярной массой (м. м.) < 5000 Да идентифицировали как низкомолекулярные пептиды, а вещества, м. м. которых превышала 12000 Да - как белки.
Хроматограммы экстрактов отличаются качественным и количественным содержанием разделенных компонентов. Распределение пиков зависит от типа ткани и стадии развития животного. При этом на всех хроматограммах (табл.) присутствуют пик Р, который соответствует веществам белковой природы с молекулярной массой > 12000 Да, пик В (м. м ~1700 Да), и пик С (м. м. ~1200). Также во всех экстрактах, исключая печень 3-х месячных животных, присутствуют пики В, и й (м. м. 1400 Да и 900
Да). 1
ЭМ эмбрионов и новорожденных крыс, а также ТЭЭ характеризуются присутствием фракций со сходными молекулярными массами за исключением фракции с м. м. ~ 3500 Да, которая отсутствует в мозге новорожденных и фракции с м. м. ~ 3800 Да, которая присутствует в ТЭЭ и отсутствует в ЭМ. ЭМ 3-х месячных крыс значительно отличается от ЭМ эмбрионов и новорожденных. В нем отсутствуют
пики А,, А2, А3, А3 г А4 А4 1 и Р с м. м. ~ 5800, 5300, 4500, 3800, 3300, 2500 и 550 Да соответственно и присутствуют пики А и А5 с м. м. ~ 6800 и 2000 Да.
ЭП новорожденных и 3-х месячных крыс значительно отличаются по содержанию фракций как от ЭМ, так и между собой. В них значительно выше содержание белковой фракции. ЭП новорожденных имеет лишь одну пептидную фракцию, которая присутствует в ЭМ эмбрионов и новорожденных крыс, а также в ТЭЭ (фракция Р с м. м. 550 Да). ЭП 3-х месячных крыс содержит наибольшее количество белков из всех исследованных экстрактов (75,8 %) и минимальное количество пептидных фракций по количественному и процентному содержанию. Он содержит 4 фракции, из которых только 2 (В и С) являются общими для всех исследованных экстрактов, две (А и А5) - общими с экстрактом мозга 3-х месячных крыс и одна (А) - общая с экстрактом печени новорожденных крыс.
Как видно из рис. и табл., количественное распределение пептидов по фракциям также сильно различается в исследованных экстрактах и зависит как от ткани, так и от стадии развития животных. При этом наиболее сходным оно является у ЭМ эмбрионов и целого эмбриона, что можно объяснить активной пролиферацией и дифференциацией, которыми характеризуются все ткани в процессе эмбрионального развития. В ЭМ 3-х месячных крыс часть фракций исчезает, а остальные перераспределяются в сторону увеличения общей для всех экстрактов фракции й. В ЭП также наблюдается количественное перераспределение фракций в сторону увеличения фракции й у новорожденных и фракции С - у 3-х месячных крыс.
Таблица
Процентное содержание пептидных фракций в экстрактах тканей мозга и печени крыс различных стадий развития, а также в ТЭЭ крысы
фракция Мол. масса, Да Относительное содержание фракций, %
ЭМ эмбр. ЭМ новор. ЭМ 3-мес. ТЭЭ ЭП новор. ЭП 3-мес.
Р >12000 42,1 ± 3,0 42,7 ± 2,7 50,2 ± 2,9 41,8 ± 3,1 62,2 ± 4,5 75,8 ± 5,0
А 6800 2,3 ± 0,4 0,9 ± 0,1 1,2 ± 0,1
А, 5800 13,9 ± 0,8 7,4 ± 0,8 8,8 ± 0,9
А, 5300 0,8± 0,2
А, 4500 16,6 ± 0,9 9,3 ±0,7 14,7 ± 0,8
А,, 3800 11,3 ± 0,6
А,, 3600 7,1 ±0,7 13,5 ± 0,5 5,5 ± 0,6
А„ 3300 1,8 ± 0,2
А„ 1 2500 1,1 ± 0,2 0,37 ± 0,09
А, 1960 2,0 ± 0,2 1,0±0,2
в 1700 6,4 ± 0,8 5,9 ± 0,7 2,0 ± 0,15 7,6 ± 0,9 5,0± 0,4 1,4±0,3
В, 1400 4,7 ± 0,5 8,1 ±0,8 8,2 ± 0,9 3,7 ± 0,4 3,2 ± 0,5
с 1200 2,2 ± 0,3 0,6±0,09 2,6 ± 0,4 2,5 ± 0,4 5,3 ± 0,6 16,2 ± 0,7
й 900 5,5 ± 0,5 11,6 ± 0,2 27,2 ± 0,3 8,9 ± 0,15 19,9 ± 0,2
Е 680 0,5 ± 0,07
Р 550 0,4 ± 0,1 1,0 ± 0,2 0,2 ± 0,05 0,4 ± 0,08
При помощи гель-проникающей хроматографии определяют распределение веществ в зависимости от их массы и количества. Вещества эти, как правило, относятся к пептидам, которые представляют собой последовательность аминокислот, соединённых между собой амидной связью. Пептиды, обладая высокой физиологической активностью, регулируют большое количество процессов организма человека и животных. Такие пептиды называют регуляторными. Очевидно, для правильной работы клеток и тканей необходимым является их адекватное количество. Регуляторные пептиды представляют собой небольшие молекулы, состоящие из аминокислотных остатков (обычно от 2 до 55), которые вырабатываются практически во всех органах. Они могут выполнять функции медиаторов, модуляторов и функционировать в качестве гормонов [6]. При этом один и тот же пептид может выступать во всех трех ролях.
Как видно из полученных результатов, фракции веществ, которые содержатся в исследуемых экстрактах, могут представлять собой регуляторные пептиды, содержащие в своем составе от 4 до 50 аминокислотных остатков, исходя из того, что вес одной аминокислоты примерно равен 140 Да. Наибольшее количество таких пептидов содержится в экстрактах, полученных из эмбрионального мозга и целого эмбриона крысы - около 58 %. Практически такое же количество пептидных фракций содержится в экстракте мозга новорожденных крыс.
В экстракте мозга 3-х месячных крыс количество пептидных фракций падает на 10 % и составляет 49,8 ± 5,0 %, их качественный состав также претерпевает изменения. Наименьшее количество пептидных фракций содержится в экстрактах печени крыс: 37,8 % - в ЭП новорожденных, и 24,2 % - в ЭП 3-х месячных животных.
Выводы. Таким образом, в исследованных экстрактах тканей мозга и печени присутствуют вещества с молекулярными массами, соответствующими массам регуляторных пептидов, содержащих от 5 до 55 аминокислот. При этом качественно и количественно состав этих веществ очень сильно отличается в зависимости от типа ткани, из которой получен экстракт и стадии развития животных.
Наибольшее количество пептидной фракции присутствует в нервной ткани различных стадий развития и тканях эмбрионов.
С увеличением возраста животных в экстрактах наблюдается увеличение количества высокомолекулярных веществ (белков) и уменьшение низкомолекулярных (регуляторных пептидов).
Перспективы дальнейших исследований. Перспективным направлением исследований является изучение качественного и количественного состава низкомолекулярных регуляторных пептидов экстрактов тканей мозга и эмбрионов, а также выяснение их биологической активности на моделях in vivo и in vitro.
Литература
1. Бидлингмейер Б. Препаративная жидкостная хроматография / Б. Бидлингмейер, Б. Фрайд, Г. Хегнауер; под ред. Б. Бидлингмейера. - М. : Мир, 1990. - 360 с.
2. Шатаева Л. К. Пептидная саморегуляция живых систем (факты и гипотезы) / Л. К. Шатаева, В. X. Хавинсон, И. Ю. Ряднова. - СПб. : Наука, 2003. - 222 с.
3. Discher D. E. Growth Factors, matrices, and forces combine and control stem cells / D. E. Discher, D. J. Mooney, P. W. Zand-stra // Science. - 2009. - Vol. 324. - P. 1673 - 1677.
4. Karelin A. A. A novel system of peptidergic regulation / A. A. Karelin, E. Yu. Blishchenko, V. T. Ivanov // FEBS Lett. - 1998. -Vol. 428, № 1 - 2. - P. 7 - 12.
5. Nielsen T. H. What happened to the stem cells? / T. H. Nielsen // J. Med. Ethics. - 2008. - Vol. 34. - P. 852 - 857.
6. Polak J. M. Regulatory peptides: key factors in the control of bodily functions / J. M. Polak, S. R. Bloom // British Medical Journal. - 1983. - Vol. 286. - P. 1461 - 1466.
7. Simons B. D. Strategies for homeostatic stem cell self-renewal in adult / B. D. Simons, H. Clevers // Tissues Cell. - 2011. -Vol. 145. - P. 851 - 862.
8. Wagers A. J. The stem cell niche in regenerative medicine / A. J. Wagers // Stem Cell. - 2012. - Vol. 10. - P. 362 - 369.
УДК 577. 112. 5:57. 085. 2
МОЛЕКУЛЯРНО-МАСОВИЙ РОЗПОДІЛ ПЕПТИДІВ В ЕКСТРАКТАХ ТКАНИН ЩУРІВ В ЗАЛЕЖНОСТІ ВІД СТАДІЇ ЇХ РОЗВИТКУ
Шевченко М. В, Сукач О. М., Семенченко О. Ю.
Резюме. Хроматографічним методом досліджений молекулярно-масовий розподіл білків і пептидів в екстрактах, отриманих з тканин цілого ембріону, а також мозку і печінки щурів різних стадій розвитку. Встановлено, що пептидно-білковий спектр екстрактів залежить від стадії розвитку тварин і типу тканини, з якої був отриманий екстракт. Найбільша кількість пептидних фракцій наявні у нервовій тканині різних стадій розвитку і в тканинах ембріонів. При збільшенні віку тварин в екстрактах зростає кількість високомолекулярних речовин (білків) і зменшується кількість низькомолекулярних (регуляторних пептидів).
Ключові слова: екстракт, хроматографія, пептиди, печінка, головний мозок, щур, стадії розвитку.
УДК 577. 112. 5:57. 085. 2
МОЛЕКУЛЯРНО-МАССОВОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕПТИДОВ В ЭКСТРАКТАХ ТКАНЕЙ КРЫС В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СТАДИИ ИХ РАЗВИТИЯ
Шевченко М. В., Сукач А. Н., Семенченко А. Ю.
Резюме. Хроматографическим методом исследовано молекулярно-массовое распределение белков и пептидов в экстрактах, полученных из тканей целого эмбриона, а также мозга и печени крыс различных стадий развития. Установлено, что пептидно-белковый спектр экстрактов зависит от стадии развития животного и типа ткани, из которого был получен экстракт. Наибольшее количество пептидной фракции присутствует в нервной ткани различных стадий развития и тканях эмбрионов. С увеличением возраста животных в экстрактах повышается количество высокомолекулярных веществ (белков) и уменьшается количество низкомолекулярных (регуляторных пептидов).
Ключевые слова: экстракт, хроматография, пептиды, печень, головной мозг, крыса, стадии развития.
UDC 577. 112. 5:57. 085. 2
Molecular-Mass Distribution of Peptides in Rats’ Tissues Extracts Depending on their Development Stage
Shevchenko M. V., Sukach A. N., Semenchenko A. Yu.
Summary. The molecular-mass distribution of proteins and peptides in extracts, obtained from the tissues of brain (BE) and liver (LE) of new-born and 3-month rats, rats’ embryo brain, and the whole rats’ embryo (the total embryonic extract, TEE) was determined by gel-penetrating chromatography method.
Chromatograms of extracts varied by qualitative and quantitative contain of partitioned components. The distribution of peaks depended on the type of tissue and developmental stage of animals. All chromatograms characterized by the presence of peak P, that corresponded with proteic substances with m. m. > 12000 Da, peak В (m. m ~1700 Da), and peak С (m. m. ~1200 Da). In all extracts except the LE of 3-month rats, the peaks В, and D (m. m. 1400 Da and 900 Da) were identified.
BEs of embryo and new-born rats, and the TEE characterized by the presence of fractions with similar m. m., except the fractions with m. m. ~ 3500 and ~ 3800 Da, that were absent in BE of new-born rats. The BE of 3-month rats significantly differed from the BEs of embryos and new-born rats. It characterized by the absence of peaks А,, А2, А3, А3 г А4 А4 , and F with m. m. ~ 5800, 5300, 4500, 3800, 3300, 2500 and 550 Dа, and by the presence of peaks А and A5 with m. m. ~ 6800 and 2000 Dа.
LEs of new-born and 3-month rats significantly differed from the BEs by a considerably higher content of protein fraction. They also differed from each other by the content of fractions. So, the LE of 3-month rats contained the largest amount of proteins (75,8 %) and the lesser number of peptide fractions by quantitative and percentage contain.
Gel-penetrating chromatography is used to determine the distribution of substrates depending on their mass and the quantity. These substrates are generally attributed to peptides, which are characterized by a physiological activity and regulation of a large number of processes in organism. They are called regulatory, and represented by small molecules consisted of aminoacid residuals (usually from 2 to 55), which are being formed in most of the organs. The fractions of substrates in the analyzed extracts can be probably represented by the regulatory peptides with 4 to 50 of aminoacid residuals in their structure, according to that the weight of one aminoacid is approximately 140 Da. The greatest number of these peptides is observed in embryonic brain and the whole embryo extracts - approximately 58 %. The BE of new-born rats contains almost the same number of peptide fractions. In BE of 3-month rats the number of peptide fractions is down by 10 % and averages 49,8 ± 5,0 %, the qualitative composition of fractions changes as well. The least number of peptide fractions is observed in LEs of new-born rats - 37,8 %, and 3-month rats - 24,2 %.
The investigation of content of different rats’ tissues extracts showed that they contain the substrates with molecular masses, characteristic for regulatory peptides, containing from 5 to 55 aminoacids. At the same time the quantitative and qualitative composition of these substrates considerably varies depending on the type of tissue from which the extract was obtained and the development stage of animals. The greater number of peptide fractions are found in nerve tissue of different development stages and embryonic tissues. The aging is accompanied by the increase of number of high-molecular substances (proteins) and the decrease of number of low-molecular substances (regulatory peptides).
Key words: extract, chromatography, peptides, liver, brain, rat, developmental stages.
Рецензент - проф. Дуб'м'м С. I.
Стаття надшшла 21. 08. 2013 р.
