CC BY
12
Summary
EFFECT OF FULLERENES ON THE ALLERGIC INFLAMMATION DEVELOPMENT IN EXPERIMENT
Kutsenko N.L., Mikityuk M.V., Bobrova, N.A., Kaidashev I.P.
Key words: fullerenes, bronchial asthma, ovalbumin, allergic inflammation.
The influence of fullerene C60 (FC60) and modification of the fullerene (1,2 methanofulleren C60)-61 carboxilatsida on the development of allergic inflammation in a model of bronchial asthma was studied.
The experimental model of asthma has been replicated in mice of the Balb / c line, by intraperitoneal sensitization followed by inhalation of 1% solution of ovalbumin. The animals with bronchial asthma intraperitoneally introduction aqueous dispersion of FC60, aqueous dispersion of FC60 in a mixture with ovalbumin, an aqueous solution of the modified conjugated with ovalbumin.
Studies have shown that the different forms of fullerenes C60 led to intensity of allergic inflammation decrease. Therapeutic effect as for the fullerene conjugated with ovalbumin, as not conjugated was observed. Ukrainian Ministry of Health Public Service, Ukrainian Medical Stomatological Academy
Mamepian nadiurnoB do peda^iï 111.11.2009
УДК [543.645.6:616.748-092.9]:543.42
ДОСЛ1ДЖЕННЯ ХРОМАТОГРАФ1ЧНОГО СПЕКТРУ ПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСУ, ОТРИМАНОГО 13 СТЕГНОВИХ М'Я31В ЩУР1В
Весшна Л.Е., Солохша 1.Л.
Науково-дослщний шститут генетичних та iмунологiчних основ розвитку патологи та фармакогенетики,
Вищий державний навчальний заклад УкраТни
«УкраТнська медична стоматолопчна академiя», м. Полтава.
В работе представлены данные о получении комплекса пептидных веществ из бедренных мышц крыс и определении их характеристик с помощью обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Исследование хроматографического спектра комплекса пептидов бедренных мышц в сравнении с пептидным комплексом коркового вещества почек крыс позволило определить различия как в количестве фракций, их расположении вдоль хроматограммы, так и по их гидрофобности.
Ключевые слова: регуляторные пептиды, пептидный комплекс бедренных мышц, высокоэффективная жидкостная хроматография.
Одним ¡з найважливших та актуальних питань су-часноТ бюлоги та медицини полягае в дослщжены рол1 регуляторних пептид1в в мехаызмах регуляци гомеостазу в норм1 та при патологи. Останн досль дження свщчать, що головы системи, вщповщальы за пщтримку сталост1 внутршнього середовища - нерво-ва, ендокринна, 1мунна мають единий мехашзм х1м1ч-ноТ регуляци, який реал1зуеться опосередковано синтезом та секрец1ею кл1тинних мед1атор1в: пептидних гормоыв та циток1н1в [12].
Пептиды молекули виконують сигнальну роль та роль регулятор1в р1зноман1тних функцм оргашзму -вщ окремих функцм спец1ал1зованих кл1тин до склад-них поведшкових акт1в [7].
В основ! пептидерпчноТ регуляци знаходиться за-гальний тип отримання та переносу шформаци на субкл1тинному, кл1тинному та тканинному р1внях, що забезпечуеться поступовим переходом спектр1в бю-лопчноТ активност1 окремих пептид1в та спроможнютю адекватно реагувати на р1зноман1тн1 втручання [12].
На даний момент досягнутий значний прогрес в област1 створення лкарських препарат1в на основ! пептид1в, активно вивчаеться Тх клУчна ефективн1сть з метою обфунтування використання в комплексна терап1Т р1зноман1тних захворювань та патолопчних стан1в [11].
Так, зокрема, пщ кер1вництвом професора Кайда-шева 1.П. на баз1 ЦентральноТ науково-досл1дноТ ла-боратор1Т УкраТнськоТ медичноТ стоматолог1чноТ ака-дем1Т проводились досл1дження б1олог1чноТ активност1 низькомолекулярних пептидних комплекс1в нирок, печ1нки, селез1нки, тимусу, м1окарда, пародонта, л1м-фовузл1в, п1дшлунковоТ залози. Вивчалась терапевти-чна активн1сть окремих пептид1в при експерименталь-них патолог1чних станах (ауто1мунний панкреатит, алоксановий д1абет, гострий стрес, гостре отруення, тощо), Тх 1мунотропна д1я. Проводилась розробка фа-рмаколопчноТ речовини на основ! пептидних комплек-с1в [4,5,6].
Подальш1 досл1дження в ц1й актуальн1й област1, зокрема, видтення нових пептидних речовин, визна-чення Тх бюлопчноТ активност1, дали б змогу доповни-ти уяву про м1жкл1тинну пептидерг1чну взаемод1ю в цтюному орган1зм1, сприяти розвитку фармаколопч-ного аспекту даного питання, розширюючи спектр використання пептидних речовин в якост1 лкарських засоб1в. Тому метою роботи стало отримання пептидного комплексу стегнових м'яз1в щур1в та визначення його хроматограф1чного спектру.
Матерiали та методи дослщження
Для досл1дження використовували скелеты м'язи 6-ти мюячних щур1в л1н1Т В1стар, в якост1 контролю
Проблеми екологп та медицини
використовували пептидний комплекс гарковоТ речо-вини нирок. Полтептидш речовини екстрагували з тканин за методикою [1] в нашм модифкацп.
Тканини скелетних м'язiв очищували вщ судин, фасцiй та жировоТ тканини, подрiбнювали до консис-тенци фаршу у ступцi на холоду, заливали холодним ацетоном у стввщношены 1:10 та збер^али при +4 °С протягом 12-24 годин. По™ ацетон видаляли, тканини висушували при постiйному помiшуваннi при гамна-тнiй температурi. Висушенi тканини екстрагували 3% льодовою оцтовою кислотою з додаванням 0,1% хлориду цинку та 0,1% хлориду магню у стввщношенш 1:10 при +4 °С протягом 72 годин при постмному пе-ремiшуваннi.
Сумiш фiльтрували для видалення дисперсного осаду, фтьтрат обробляли ацетоном у стввщношен-нi 1:10 при +4 °С протягом 12-24 годин. Отриманий прециттат промивали сумшшю ацетону та ефiру у стввщношенш 1:1, висушували та розчиняли у пщки-сленiй дистильованiй водi. Для отримання пептидiв з молекулярною масою до 10 кДа розчин центрифугу-вали через фiльтр з дiаметром пор 10 кДа.
Полiпептиднi екстракти аналiзували в умовах обе-рнено-фазовоТ високоефективноТ рiдинноТ хроматог-рафiТ, яка дае можливiсть роздiлення складних сумь шей та дослiдження речовин тваринного походження, що мають мiнiмальнi вщмЫност у фiзико-хiмiчних властивостях. Дослiдження проводили у двох пара-лелях. Для щентифкаци отриманого пептидного комплексу 0,1 г дослщжуваного матерiалу розчиняли у 1,0 мл дистильованоТ води, центрифугували протягом 15 хвилин при 3000 об/хв. Отриманий розчин фтьт-рували через мембранний капроновий фтьтр ММК-0,20 з розмiром пор 0,2 мкм, першу порцю фтьтрату вiдкидали. Для аналiзу використовували проби об'емом 6 мкл.
На рщинному хроматографi «Мохром-4ВУФ» (Ро-сiя) використовували систему SMART tm SYSTEM (LKB, «Pharmacia», Шве^я). Дотримувалися наступ-них умов: колонка ц RCP-C2/C18-SC 2,1/10, дiаметр 10 мм, довжина 600 мм (Code No. 17-0704-0, «Pharmacia» (Шве^я); сорбент - Сефадекс G-25; рухома фаза: ацетоштрил - 1% розчин трифтороцтовоТ кис-лоти («Applied Biosystems», USA Analitical Grade) -вода дегазована через фтьтр ПОР-16 або шшим зру-чним способом.
Градiентне елюювання вiдбувалось за наступних
Швидкють рухомоТ фази - 80 мкл/хв, детекцiю проводили при довжинi хвилi 280 нм та температурi колонки 20°С.
Результати та 1х обговорення
Вперше пептиднi бiорегулятори багатоклiтинних систем було отримано з riпоталамiчноT област мозку, епiфiзу, тимусу та судинноТ стiнки за допомогою оцто-вокислоТ екстракцiT в присутностi iонiв 7п2+, з наступ-ним осаджуванням комплекав полiпептидiв ацетоном та очищуванням методом гель-фтьтрацп для видалення важкорозчинних фракцш [8,9,10]. Даний метод екстракцп пептидiв iз бiологiчних тканин дозволив позбавитись баластних та алергенних компонент [2].
Нами були внесет модифкаци в методику видь лення пептидних екстракпв, що базувались на вико-ристаннi бiльш активноТ галогенвмiсноT оргаычноТ кислоти та введення в систему екстракцп крiм iонiв цинку, юшв магнiю [1]. Це дозволило отримувати пептиды комплекси з бтьш значною бiологiчною активнь стю [3].
Хроматографiчний спектр екстракта стегнових м'язiв щурiв представлений на рис.1.
г = ES а__! ne- • 4 j -_j 1 t t —i :3t— -
ts tf 1 TS u * T, TT ""i \ я i iv P \s 4 « а - - Ян he
Рис 1. Хроматограма комплексу полiпептидiв стегнових м'язiв шурв
Тут та на рис. 2:
по oci ординат - оптична густина, опт. Од.;
по ос абсцис - час утримання, хв.
Аналiз хроматографiчного спектру пептидiв м'язiв стегна показав наявнють 5 фракцiй. Фракцií II та V включали додатк^ пiки (II, IIa та V,Va). Найбiльш питома вага припадала на фракцп II, Ill, IV та V. За обсягом фракци розподтилися наступним чином: IV, II, V, Ill, I. Враховуючи вщносну рiвномiрнiсть розподь лення фракцм по довжинi хроматограми, зроблено висновок про вмют пептидiв з рiзним ступенем гщро-фiльностi та гщрофобност у складi екстракту. Визна-чено, що основна маса речовини мютилася в бiльш гiдрофобнiй частин хроматограми з часом утримання вщ 20 до 50 хвилин та достатньо висош оптичнiй густини при 280 нм.
Для порiвняння було використано пептидний екст-ракт, отриманий за таким же методом з фково''' речовини нирок щурiв. Хроматограма пептидного комплексу фково''' речовини нирок представлена на рис.2.
умов:
№ Об'емне сглввщношення компонента ПФ, об % Об'ем ПФ,
ПФ Ацетоыт-рил 1 % ТФО кислота Вода мкл
1 0 1 9 400
2 0,5 1 8,5 50
3 1 1 8 50
4 2 1 7 100
5 4 1 5 400
6 8 1 1 400
7 8 1 1 50
8 10 1 0 500
Рис 2. Хроматограма комплексу полпептид/'в юрково! речовини нирок шур1в.
Згщно результатам, комплекс регуляторних пеп-т^в юрковоТ речовини нирок мютить 4 фракци та вiдрiзняeться за характером Тх розташування по дов-жинi хроматограми. Також, фракци II та Ill мали по два додаткових тки (II, IIa, IIб та Ша, III6, Ill). Основнi фракци з найбтьшою питомою вагою - II, Ill, розташо-вувалися у частит хроматограми з меншим часом утримання до 50 хвилин та характеризувалися бть-шою гiдрофiльнiстю. Характерним було також наяв-нiсть на хроматограмi пiку з часом утримання близько 50 хвилин та достатньо високою оптичною щiльнiстю при 280 нм. У цтому фракцiТ розподтилися (в порядку з6iльшення питомоТ ваги) в послiдовностi I, иб, II, На, Ша, III, IIIб, IV.
Таким чином, нами було отримано полтептидт екстракти стегнових м'язiв та кiрковоТ речовини нирок щурiв. При дослiдженнi хроматографiчного спектру отриманих речовин визначено вщмшност як за ктькь стю фракцiй, Тх розташуванням впродовж хроматограми, так i за Тх гiдрофо6нiстю.
Висока ефективнють пептидних препаратiв, яка неодноразово пщтверджена в експериментальних дослiдженнях та дослщом клiнiчного використання,
потребуе подальше вивчення Тх механ1зм1в ф1з1олог1-чноТ дм, розпод1лу в орган1зм1, оч1куван1 та поб1чн1 ефекти. А це, в свою чергу, окр1м р1шення важливших проблем б1олог1чноТ регуляц1Т орган1зму за фЫологм-них умов, дозволить нам1тити нов1 п1дходи до терапи та профтактики багатьох захворювань.
Лiтература
1. А.с. 10180А УкраТна. МК1 5 А61 К37/00. Спос1б одер-жання бюлопчно-активноТ речовини, що мае регенера-торну та модулюючу д1ю // Промислова власнють. -1996. - №3.- С. 3.1.76-3.1.77.
2. Изучение белковых компонентов пептидных регуляторов природного происхождения / Г.А. Рыжак, П.А. Некрасов, О.И. Киселев, В.Х. Хавинсон //Бюл. эксперим. биологии и медицины.- 2003.- Т. 135, № 1.- С.62-65.
3. Кайдашев И.П. Влияние почечных полипептидов на активность лимфоцитов при экспериментальном нефрите //Физиол. журн. - 1993.- Т. 39, № 5-6.- С. 52-56.
4. Кайдашев 1.П. Нова група бюлопчних регулятор1в бага-токл1тинних систем - пептиди головного комплексу пс-тосумюност // Журн. АМН УкраТни. - 2000. - Т. 6, №1. -С. 26-38.
5. Кайдашев 1.П., Весына Л.Е., Куценко Н.Л., Звягольська 1.Н. Вщтворення 1мунноТ в1дпов1д1 на Ало- та гетероанти-гени введенням екзогенних пептидних комплешв здо-рових тканин при вторинних 1мунодеф1цитах, виклика-них д1ею антицитохромоксидазноТ сироватки // Пробле-ми екологи та медицини. - 2004. - №1 -2. - Т. 5. - С. 3337.
6. Кайдашев 1.П., Куценко Л.О., Боброва Н.О., та Ы. Вивчення впливу пептидного екстракту пщшлунковоТ зало-зи // Л1ки. - 2005. - № 1-2. - С. 46-52.
7. Климов П.К., Барашкова Г.М. Эндогенные пептиды как единая система регуляторных веществ //Физиол. журн. им. И.М.Сеченова.- 1993.- Т.79, № 3.- С. 80-87.
8. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Влияние экстракта из тимуса на процессы заживления ожоговых ран в эксперименте //Эксперим. хирургия и анестезиология. - 1974.-№ 2. - С. 49-51.
9. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Выделение, очистка и идентификация иммуномодулирующего полипептида, содержащегося в тимусе телят и человека //Докл. АН СССР.- 1981.- Т. 261, № 1.- С. 235-239.
10. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Писарев О.А. Выделение из тимуса и изучение природы фактора, стимулирующего иммуногенез //Докл. АН СССР.- 1977.- Т. 233, № 3.- С. 491-494.
11. Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н. Физиологические аспекты пептидной регуляции старения // - 2009. - Т. 13, № 4. -С. 254-258.
12. Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Ашмарин И.П. Пептидер-гическая регуляция гомеостаза //Успехи соврем. биологии. - 2002.- Т. 122, № 2.- С. 190-203.
Summaru
THE INVESTIGATION OF CHROMATOGRAPHIC SPECTRUM OF PEPTIDE COMPLEX OBTAINED FROM THE RAT FEMORAL MUSCLES Vesnina L.E., Solohina I.L.
Key words: regulatory peptides, peptide complex femoral muscles, high-performance liquid chromatography.
Research Institute for Genetic and Immunological Grounds of Pathology and Pharmacogenetics, Ukrainian Medical Stomatological Academy, Poltava
This paper presents data on peptide complex substances from rat femoral muscles and determines their characteristics by using reverse-phase high-performance liquid chromatography. Chromatographic spectra of peptide complexes of femoral muscles and cortical substance of kidneys were compared. The differences in the number of fractions, their positions within chromatographic picture (hydrophobic properties) were found and described. Ukrainian Ministry of Health Public Service, Ukrainian Medical Stomatological Academy
Mamepian nadiurnoB do pedaKqit 117.12.2009
