CC BY
18
2-4 times increase. And in two children with galactosemia was observed a slight increase of the level or was close to the upper limit of succinylacetone reference values.
Conclusions. In this study succinylacetone concentration was determined in dry blood spots of 149 children from different regions of Ukraine aged from 7 days to 18 years by tandem mass spectrometry. As a result was shown that there was no statistically significant difference between the succinylacetone concentration in the age and gender groups of children by the Mann-Whitney criteria p>0,05. During the research were received the following reference values of 0,77 |imol/l and 3,87 |imol/l, which corresponded to 2,5 and 97,5 percentiles respectively. Based on the determined reference values we could affirm that succinylacetone concentration in dry blood spots of patients with tyrosinemia type 1 2-4 times exceeds the upper limit of the reference interval (RI), and in patients with galactosemia in most cases is at the upper limit of RI.
Keywords: succinylacetone, reference values, tyrosinemia, children, tandem mass spectrometry.
Рецензент — проф. Мщенко I. В. Стаття надшшла 01.02.2017 року
© Ольхович Н. В., Россоха З. I., ni4Kyp Н. О., Попова О. Ф., Горовенко Н. Г. УДК 616-056.7-07
1Ольхович Н. В., 2Россоха З. I., 34П1чкур Н. О., 2Попова О. Ф., 1,4Горовенко Н. Г.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧН1 ТА Б1ОХ1М1ЧН1 ФАКТОРИ
ФОРМУВАННЯ ФЕНОТИПУ ПАЦ1СНТ1В
З ХВОРОБОЮ ГОШЕ I ТИПУ
1ДУ 1нститут генетичноТ та регенеративно'!' медицини НАМН УкраГни (м. КиГв) 2ДЗ Референс-центр з молекулярно! д1агностики МОЗ Укра'Гни (м. КиГв) 3Центр орфанних захворювань НДСЛ «ОХМАТДИТ» МОЗ УкраГни (м. КиГв) 4Нацюнальна медична академ1я шслядипломно'Г осв1ти 1мен1 П. Л. Шупика (м. КиГв)
Представлена робота е фрагментом НДР «Оцш-ка ролi генетичних факторiв у формуванн та пере-б^ лiзосомних хвороб накопичення для оптимiзацiI ктмычно! та лабораторно! дiагностики цих захворювань» i виконана на базi ДУ «1ГРМ НАМН Укра!ни», № державно! реестраци 011511003006.
Вступ. Хвороба Гоше (ХГ) - це спадкове ауто-сомно-рецесивне захворювання, яке спричинене порушенням функци одые! з лiзосомних гидролаз -глюкоцереброзидази (ЕС 3.2.1.45) [19]. Недостатня активнють цього ферменту призводить до внутрш ньолiзосомного накопичення глюкозилцерамщу в клмтинах оргаызму, перш за все у вюцеральних макрофагах. Ктычно видтяють 3 типи ХГ на пiдставi наявност та ступеня прогресування невролопчних уражень. Ус три типи зазвичай маыфестують ге-патоспленомегалiею з накопиченням глкозилцера-мiду у макрофагах печшки, селезiнки, лiмфатично,i тканини та юсткового мозку [7].
Хвороба Гоше I типу (ненейронопатична) пред-ставляе собою найпоширеншу форму захворювання, яка не асо^юеться з неврологiчною маыфеста-цiею, але представлена широким спектром клмычно! презентаци, основними ознаками яко! е гепатоспле-номегалiя, цитопенiя та кiстковi ураження. Хвороба Гоше II типу - гостра нейронопатична - е найрщкю-ышою i характеризуемся тяжкими прогресуючими неврологiчними порушеннями, як можуть маыфес-тувати ранiше, ыж ураження вiсцеральних органiв,
i призводять до летального наслщку протягом перших двох роюв життя. До III-го хронiчного нейроно-патичного типу хвороби Гоше вщносять всi випадки захворювання з будь-якими невролопчними про-явами, якi не призвели до ранньо! смертi.
Характерною особливiстю спадкових метаболiч-них захворювань взагалi, i ХГ зокрема, е широкий кгл-нiчний полiморфiзм. Тяжкiсть клiнiчних проявiв симп-томiв та вiк початку захворювання широко варюють вiд практично асимптоматичних випадюв до тяжких Ывалщизуючих станiв, при яких вториннi гематоло-гiчнi та кiстковi змiни призводять до високо! частоти ускладнень, а нерщко i до смертi пащен™ [6]. Така широка варiабельнiсть кглычних проявiв захворювання i тяжкост перебiгу спостерiгаеться навiть серед пащен™ з однаковим генотипом [11]. Бтьше того, ю-нують клiнiчнi дефекти, якi представляють собою вто-ринн ураження, що можуть бути незалежн вiд ступеня внутрiшньолiзосомного накопичення метаболтв [7].
Зважаючи на те, що ктычна картина хвороби Гоше обумовлена цтим каскадом патогенетичних механiзмiв вщпов^ клiтини на накопичення глю-коцереброзиду, ключову роль серед яких в^гра-ють хронiчне запалення та оксидативний стрес, шдивщуальы особливостi тако! вщповд у кожного органiзму рiзнi, що обумовлено як генетичними, так i етгенетичними i середовищними факторами [12]. Так, вщомо, що ферменти родини глютатюн-S-тренсфераз (GST) являються важливою ланкою
антиоксидантного захисту клггинного рiвня через здатнiсть iнактивацiI вiльних радикалiв i активних похiдних кисню [14]. 1х наявнiсть та функцiональний стан можуть впливати на чутливiсть ктмтин до окси-дативного стресу i, як наслщок, вiдiгравати певну роль у патогенезi розвитку ктмычно! картини у конкретно! особи. Активован макрофаги, не дивлячись на накопичення глюкоцереброзиду, залишаються метаболiчно активними i продукують велику кiлькiсть про- та антизапальних медiаторiв, запускаючи вро-джену iмунну вiдповiдь i активуючи мехаызм хроыч-ного запалення [9]. Ктькють i функцiональний стан цих медiаторiв також впливають на iнтенсивнiсть запального процесу i, як наслщок, тяжкють переб^ гу захворювання. Таким чином, генетичн фактори, якi не е первинно детермiнуючими розвиток хворо-би Гоше у патента, але обумовлюють особливостi вторинно! вiдповiдi кJliтини на накопичення патоло-гiчного субстрату, можуть бути тими факторами, що спричинюють клiнiчний полiморфiзм захворювання.
Метою нашо! роботи було дослiдження бiохiмiч-них та молекулярно-генетичних маркерiв, якi можуть бути використан для оцiнки ризику пiдвищення тяж-костi перебiгу хвороби Гоше I типу, тому представля-ють собою потенцмы iнструменти для полтшення ю-нуючо! терапiI.
Об'ект i методи дослiджень. Матерiалом для дослiдження були зразки кровi пащен^в з хворобою Гоше, у яких було виявлено генотипи р.Ы4093/р. N409S, р.М4098/р.1483Р та р.Ы4093/р.Р159\^ в генi GBA. Дiагностика хвороби Гоше i визначення генотипу проводилась в лаборатори медично! генетики НДСЛ «Охматдит» МОЗ Укра!ни. Ступiнь тяжкостi прояву захворювання визначали згщно iндексу тяж-костi (SSI), запропонованому Zimran et al. [22].
Активнють глютатiон-S-трансферази загально! проводили в плазмi кровi за допомогою вщповщних комерцiйних наборiв реаген^в (вир-во Sigma) вщпо-вiдно до протоколу виробника.
Хгготриозидазну активнiсть в плазмi кровi оцЫю-вали за деградащею флуорогенного субстрату 22 мкМ 4-МУФ-трiацетилхiтотриозид (Sigma) в цитрат-фосфатному буферi рН 5,2 за стандартною методикою [1]. Результати наводили у нмоль/год/мл плазми.
Вмют неоптерину в плазмi кровi оцiнювали методом ВЕРХ за методом, описаним Blau et al. [8].
Рiвень оксидативно-модифкованих проте!ыв оцiнювали шляхом визначення карбонтьних груп за реак^ею з динiтрофенiлгiдразином (ДНФГ), як описано Mello et al. [20].
Видтення препара^в ДНК з кровi хворих та амп-лiфiкацiю здмснювали з використанням комерцй них наборiв реагентiв виробництва Неоген (Укра!на).
Алельний полiморфiзм GSTT1 та GSTM1 геыв GSTs визначали за допомогою мультиплексно! по-лiмеразно! ланцюгово! реакци [13]. Для визначення полiморфних варiантiв геыв IL-1ß C3953T(rs1143634 ) та IL-8 C781T (rs2227306) використовували моди-фiкованi протоколи з олiгонукJlеотидними прайме-рами iз застосуванням методу ПЛР та наступним аналiзом полiморфiзму довжини рестрикцмних фрагментiв (ПДРФ) [18].
Амплiфiкованi фрагменти розподiляли з використанням горизонтального електрофорезу в 1,5% агарозному гелi i3 забарвленням бромистим етид^ ем. Вiзуалiзацiю та подальше архiвування отрима-них амплiконiв здiйснювали за допомогою вщеосис-теми Vitran.
Статистичний аналiз одержаних результатiв проводили з використанням пакету статистичних про-грам Statistica 10.0. Розподiл значень бiохiмiчних доотджень аналiзували з використанням тесту Кол-могорова-Смiрнова, порiвняння середых значень здiйснювали за допомого одномiрного ANOVA тесту з використанням непараметричного критерт Мана-Уiтнi U. Аналiз впливу молекулярно-генетичних фак-торiв ризику на ктмычний фенотип оцiнювали з використанням стандартних критерпв хиквадрат (xl), Фiшера та показника вщношення шансiв Odds Ratio (OR) з 95% довiрчим iнтервалом.
Результати дослщження та Ух обговорення. Хвороба Гоше - це спадкове метаболiчне захворювання, при якому спостер^аються прогресуючi мультиорганнi клiнiчнi прояви. Показано, що клмыч-ний перебiг захворювання i, навiть, реакцiя на ФЗТ у пащен^в з ХГ мае достатньо широку варiабель-нiсть нав^ь у хворих з однаковим генотипом [3]. Це спостереження дозволяе припустити, що юнують хвороба-залежн змши, якi неможливо пояснити лише наслщками внутрiшньоклiтинного накопичення глюкоцереброзиду. Фундаментальн молекуляр-но-генетичнi дослiдження iстотно змЫили i конкре-тизували уявлення про структуру геыв, взаемини ген-бiлок, ген-ознака i генотип-фенотип, що мае не ттьки теоретичне, а i прикладне значення для трак-тування ключного, бiохiмiчного i морфологiчного фенотипу хворих. Таким чином, виявлення генетич-них маркерiв, якi ймовiрно призводять до виникнен-ня вторинних патологiчних змiн, е на сьогодн прю-ритетним напрямком наукових доотджень.
Ген глюкоцереброзидази (GBA) знаходиться на довгому плечi першо! хромосоми в локусi 1 q21 та мае довжину майже 7,5 т.п.н. [7]. За даними Human Genome Mutation Database (http://www.hgmd.cf.ac. uk), на сьогодн описано близько 300 мутацм в ген GBA, пов'язаних з розвитком хвороби Гоше. У пащен-^в з ХГ в европейському репоы найчастше (близько 70% випадюв) зустрiчаються мiсенс-мутацiI р.N409S та р.1_483Р [16]. У пацiентiв з хворобою Гоше з Укратни (63 особи) найчастше хвороба була викликана саме цими двома замшами, а також замшою р.R159W (су-марна частота 54,8%), що обумовило три найрозпо-всюдженш генотипи - р.N409S/р.N409S у 5 хворих, р.N409S/р._483P у 13 хворих та р.N409S/р.R159W у 5 хворих. Саме в цих трьох групах пащен™ було проведено нами дослщження ктмычноТ, бiохiмiчноI та ге-нетично! гетерогенностi фенотипу.
Як видно з даних, наведених у таблиц 1, кл i-ычы прояви захворювання та вк його маыфеста-L^iT у пацiентiв в межах груп з однаковим генотипом значно варивав. Так, у трьох пащетчв з генотипом р.N409S/р.N409S хвороба маыфестувала на пер-шому 10-рiччi життя i на момент встановлення дiа-гнозу мала середню ступЫь тяжкостi (SSI < 7), обу-мовлену, перш за все, наявнютю кiсткових болей i
Таблиця 1.
Ктшчна, бiохiмiчна та молекулярно-генетична характеристика пащен^в з хворобою Гоше
н I ш 'и СВ с Кл1н1чний фенотип Бюх1м1чний фенотип Молекулярно-генетич-ш маркери
В1к початку машфес-тацп, роки В1к встановлення д1агнозу, роки I X '.!£ * .— а нн вз оо н с О ББ! шдекс на момент встановлення д1агнозу Активнють глюкоце- реброзидази, нмоль/год/мг про-теУна Активнють х1тотри-озидази, нмоль/год/ мл плазми Р1вень неоптерину, ммоль/л О! СО Ч | хОсво5 ¿■¡= <с;св5 т § а - . 1 = 55 з * - ^ иабое кора но л -а — с 1= ниву £ д! & йБТТ1 (алель/де-лец1я) йБТМ1 (алель/де-лец1я) о 3 5 О) со С со 8
Генотип р.М4098/р.М409в
1 9 18 ГМ, СМ, ЦП, КБ 6 1,5 25196 7,23 16,9 26,7 + СС СТ
2 3 11 ГМ, СМ, ЦП, КБ 7 2,6 11052 8,82 8,4 34,9 + СТ СС
3 18 38 ГМ, СМ, ЦП 4 2,6 5467 4,98 11,1 19,5 + + СС СС
4 45 48 ГМ, СМ, ЦП 4 2,2 3182 5,79 12,8 15,0 + + СС СС
5 5 14 ГМ, СМ, ЦП, КБ 6 3,4 22100 9,95 15,6 27,8 + СТ СТ
Генотип р.М4098/р.Ь483Р
6 10 16 ГМ, СМ, ЦП, КБ 7 3 7404 9,90 9,2 28,6 + СС ТТ
7 2 3 ГМ, СМ, ЦП, КБ 7 3,7 15990 9,13 8,5 35,0 + СС СС
8 25 54 СЕ, ЦП, КБ 7 3,8 6984 7,45 13,2 31,2 + + СС СС
9 15 33 ГМ, СЕ, ЦП, КБ, АН 11 2,7 22652 12,98 15,1 39,6 СТ ТТ
10 20 40 СЕ, ЦП, КБ 7 2,2 12155 8,78 9,0 25,3 + СТ СТ
11 5 10 ГМ, СМ, ЦП, КБ 6 3,3 9061 9,43 9,5 21,0 + + СС СС
12 6 6 ГМ, СМ, ЦП, КБ 6 1,4 10431 7,19 13,7 20,6 СТ СТ
13 10 19 ГМ, СМ, ЦП 7 4,2 8840 6,38 16,9 23,1 + + СС СТ
14 3 5 ГМ, СМ, ЦП 5 2,4 11393 7,90 19,3 19,4 + + СС СТ
15 45 66 СМ, ЦП 5 3,7 9017 5,41 12,9 17,0 + + СТ СТ
16 6 8 ГМ, СМ, ЦП, КБ 8 2,2 15382 10,65 14,2 21,7 + + СТ СС
17 6 27 ГМ, СЕ, ЦП, КБ, АН 13 3,5 18619 13,25 11,6 34,8 СТ ТТ
18 4 6 ГМ, СМ, ЦП, КБ 8 4,7 18398 9,84 5,9 23,5 + СС СТ
Генотип р.N409S/р.R159W
19 55 57 ГМ, СМ, ЦП 6 2,1 6011 10,6 6,9 23,8 + СС СС
20 15 40 ГМ, СМ, ЦП, КБ 8 0,6 17901 13,1 17,5 35,0 + СТ ТТ
21 21 25 ГМ, СМ, ЦП 5 4,5 10409 4,66 14,7 21,9 + + СС СС
22 15 25 ГМ, СМ, ЦП 5 3,3 10343 7,0 20,9 17,5 + + СС СС
23 5 5 ГМ, СМ, ЦП, КБ 8 2,6 15116 15,2 15,2 32,1 СТ ТТ
Примiтка: *ГМ - гепатомегалiя, СМ-спленомегалiя, СЕ - спленектомия, ЦП - цитопенiя, КБ - кiстковi болi, АН - аваскулярний некроз.
вираженою органомегал1ею. Тод1 як у двох пац1ент1в (пац1енти 3 та 4) з таким же генотипом захворюван-ня маыфестувало значно п1знШе I на момент вста-новлення д1агнозу не супроводжувалось кютковими болями, внасл1док чого хвороба була класифкова-на як легка (881=4). Бтышють пац1ент1в з генотипом
р.Ы4098/р._483Р (9 1з 13-ти) мали середню ступ1ны тяжкост1 захворювання на момент встановлення д1а-гнозу (881 < 7), тод1 як четверо (пац1енти 9, 16, 17 I 18) демонстрували бтыш виражену органомегал1ю I тяжк ураження кютковоУ системи, в тому числ1 озна-ки аваскулярного некрозу, що спричинювали пато-
Рис. 1. Ревень протизапальних маркеров у пащен^в з разним типом перебегу хвороби Гоше: А — активность хгготриозидази в плазма кров^ Б — ревень неоптерину в плазма кровк
логiчнi переломи юсток. Серед пацieнтiв з генотипом р.Ы4093/р.Я159Ш також можна видiлити трьох оаб з легким перебiгом захворювання без залучення юст-кових порушень (331=5-6) та двох хворих (пащенти 20 i 23) з ранньою манiфестацiею та хворобою се-редньо!' тяжкостi з бiльш вираженою органомегалi-ею i перiодичними кiстковими болями (331=8). Це свщчить про те, що не дивлячись на однаковий генотип у цих пащен^в, кл^чний перебiг захворювання i ступшь II тяжкостi суттево рiзняться.
Для оценки факторiв, як1 можуть впливати на роз-виток клiнiчноi картини захворювання, нами було проведено дослщження рiвня вторинних бiохiмiчних маркерiв внутршньокл^инних патологiчних процесiв, що активуються у вщповщь на первинний бiохiмiчний дефект, а також генетичних чинниюв, як1 впливають на iнтенсивнiсть цiеi вщповд З цiею метою нами було сформовано двi групи хворих - перша група об'еднала пащетлв з «легшим» фенотипом незалежно вщ генотипу (14 оаб), а друга - з «тяжюшим» (9 оаб).
Первинним бiохiмiчним дефектом при хворобi Гоше е дефiцит активностi глюкоцереброзидази, який призводить до внутрiшньолiзосомного нако-пичення гюкоцереброзиду. Але не мехаычне на-копичення недеградованого субстрату обумовлюе розвиток захворювання, а той каскад патолопчних механiзмiв, який активуеться кл^инами у вiдповiдь на на-копичення. Ключову роль у патогенезi хвороби Гоше вi-дiграють хроычне запалення та оксидативний стрес [5].
Незважаючи на те, що активнють глюкоцереброзидази знижена у вах кл^инах органiзму хворого, нако-пичення глюкозилцерамщу вiдбуваеться перш за все у макрофагах, принаймн при I тип захворювання [7]. Незважаючи на вдаилення у архiтектурi i функцiональностi
перевантажених лiпiдами макрофагiв, як обумовлю-ють характерну морфологiю цих кл™н (Гоше-подiбнi клiтини), вони не е iнертними контейнерами для збе-рiгання, а являють собою метаболiчно активнi кл™-ни, що здатн виробляти i секретувати бiлки, яю ке-рують патофiзiологiчними процесами [9]. На пiдставi фенотипу i iмунних функцiй Гоше-подiбнi клiтини вщ-носять до альтернативно-активованих макрофапв, основна роль яких полягае в протизапальнм вщпо-вiдi i супроводжуеться секрецiею велико!' кшькост протизапальних медiаторiв. Однак в розгортанн па-тологiчного процесу при хворобi Гоше суттеву роль також в^грають прозапальнi фактори, такi як цитою-ни i гiдролази, що секретуються оточуючими класич-но активованими макрофагами.
Нами було проведено ощнку вiдмiнностi у рiвнi протизапальних маркерiв, хiтотриозидази та неоптер^у, в плазмi кровi па^ен^в з «легшим» та «тяжкiшим» пере-бiгом хвороби Гоше (рис. 1). Було показано, що рiвень зазначених показниюв у пацiентiв з «легшим» переби гом захворювання достовiрно нижчий, ыж у хворих з «тяжюшим» перебiгом (U=5, р<0,05 та U=14, р<0,05 вiдповiдно), що спiвпадае з опублкованими даними i пояснюеться ключовою роллю хронiчного запалення у патогенезi хвороби Гоше [10]. Але такий бiохiмiчний фенотип е вторинним i, скорее, вiдображае актив-
Таблиця 2.
Розподш алельних пол1морф1зм1в ген1в IL1b i IL8 у хворих з «легшим» та «тяжмшим» перебiгом хвороби Гоше
Групи дослщження n Частоти генотитв по гену IL1b Частоти генотитв по гену IL8
СС СТ СС СТ ТТ
n % n % n % n % n %
Пащенти з «легшим» переб^ом захворювання 14 11 85 3 30 8 80 5 63 1 20
Пащенти з «тяж-кiшим» переб^ом захворювання 9 2 15 7 70 2 20 3 37 4 80
нють патолопчних змн що робить до-цiльним використання цих маркерiв для оцiнки активностi патолопчного проце-су, проте обмежуе можливост прогнозу перебiгу захворювання.
З метою визначення певноУ можли-востi прогнозу переб^ хвороби Гоше, нами було проаналiзовано частоту по-лiморфних варiантiв генiв цитокiнiв IL1b та IL8. Зпдно з даними останнiх роюв, полiморфiзм генiв цитокiнiв обумовлюе ютотний вплив на схильнiсть до ряду захворювань [4]. В залежност вд Ыди-вiдуального ансамблю високо i низь-копродукуючих варiантiв генiв про та протизапальних цитоюыв, характер запальноУ вiдповiдi може значно вiдрiзнятися мiж iндивiдуумами, впливаючи на загальнi особливост протiкання цього процесу. Так, у оЫб, гомо або гетерозиготних за високопродукуючим алелем IL1b (+3953)C-T та IL8 (-781 C^T), продукуеться, вд-повiдно, в 4 або 2 рази бтьша кiлькiсть цих цитоюыв, нiж у осiб, гомозиготних за немутантним варiантом цих генiв [2]. Прозапальн цитокiни активують цитотоксичнi властивост NK-клiтин та фагоцитарну активнiсть ма-крофагiв. Таким чином, наслiдком пперактивацп цих генiв е аномальний переб^ запального процесу, що може впливати на кл^чну картину хвороби Гоше.
Нами було проаналiзовано розподiл алельних варiантiв генiв IL1b (3953C^T) та IL8 (-781 C^T) у па^енлв з «легшим» та «тяжкiшим» переб^ом хвороби Гоше (табл. 2). Було показано, що у пащенлв з «легшим» фенотипом частота алельного варiанта 3953CT гена IL1b достовiрно нижча, шж у па^ен-лв з «тяжкiшим» перебiгом захворювання (х2 =4,97, р<0,05). В той час, як носи -781T алеля гена IL8 ш в гомозиготному стаж, ш в поеднанш з гетерозигота-ми достовiрно не переважали серед хворих з «тяжю-шим» переб^ом хвороби Гоше (х2 =2,56, р>0,05 та х2 = 1,48, р>0,05 вщповщно).
Таким чином, достовiрно можна вважати, що па-^енти з хворобою Гоше, як мають алельний варiант 3953CT гена IL1b, мають пщвищений ризик розвитку «тяжкiшоï» форми хвороби (табл. 3).
Таблиця 3.
Показники ризику розвитку «тяжмшого» nepe6iry хвороби Гоше
з IL1b i IL8 генотипами та Ух поеднанням
Генотипи OR 95% CI xi P
3953CT алель в ген ILIb 12,83 1,69-97,20 4,97 < 0,05
-781T (ТТ+СТ) алель в reHi IL8 4,67 0,70-31,04 1,48 > 0,05
-781ТТ алель в reHi IL8 10,4 0,92-117,19 2,56 > 0,05
3953T/-781T 4,58 0,73-28,65 1,51 > 0,05
Активы форми кисню (ROS) е продуктами мета-болiзму клiтини, якi в HopMi пiдлягають детоксикацп як ензиматичним, так i неензиматичним шляхом [14]. В разi виникнення дисбалансу мiж прооксидантами та антиоксидантами в бк збтьшення рiвня проокси-дантiв, виникае оксидативний стрес, продукти якого спричинюють пошкодження мембранних лiпiдiв, ну-клеУнових кислот, протеiнiв i вуглеводiв. Таким чином, кл^ины детоксикацiйнi механiзми е одними з тих чин-никв, що обумовлюють ступiнь патологiчного ура-ження клiтини i, як наслщок, перебiг захворювання. Ключовою ланкою детоксикацмного механiзму кл™-ни е глутатюн^-трансферази (GSTs) - родина бага-тофункцюнальних дезiнтоксикацiйних ферментiв, якi захищають кл™ни вiд продуктiв оксидативного стре-су шляхом утворення кон'югалв з глютатюном [14].
Дослiдження, проведенi на культивованих фи бробластах пацiентiв з хворобою Гоше показали пд-вищення рiвня активних форм кисню (ROS) i вмюту оксидованого (карбонильного) бiлка порiвняно з фiбробластами здорових донорiв, що пдтверджуе важливу роль оксидативного стресу у патогене-зi цього захворювання [17]. Нами було проведено визначення рiвня карбонтьних груп - маркер, який широко використовуеться останнiм часом в якост показника окисного пошкодження бтюв внаслiдок оксидативного стресу [21]. Визначення рiвня кар-бонiльних груп у зразках плазми обстежених нами пащенлв показав достовiрну вiдмiннiсть цього по-
Рис. 2. Рiвень бiохiмiчних маpкеpiв оксидативного стресу у пацiентiв з piзним типом nepe6iry хвороби Гоше: А — piвeнь оксидативно-модифшованих пpотeïнiв (каpбонiльних груп) в плазмi кpовi; Б — активнiсть глютатюн-Б-трансфераз в сиpоватцi кpовi.
Групи дослщження п Частоти генотип1в по гену ввТЛ Частоти генотитв по гену ОБТМ1
ввТЛ»-» 03ТТ1»+» ОвТМ1»-» аэТМ1»+»
п % п % п % п %
Пац1енти з «легшим» переб1гом захворювання 14 4 57 10 63 2 20 12 92
Пац1енти з «тяжк1шим» переб1гом захворювання 9 3 43 6 37 8 80 1 8
казника м1ж групами з «легшими» Таблиця 4.
та «тяжюшими» проявами хвороби Розподт алельних полiморфiзмiв гешв 08ТТ1 i 08ТМ1
(и-21,5, р<0,05) (рис. 2А). Це ще у хворих з «легшим» та «тяжюшим» перебiгом хвороби
раз пщтверджуе внесок оксидатив- _
Гоше
ного стресу у патогенез захворю-вання I дозволяе припустити, що визначення цього показника може бути додатковим параметром оцшки ступеня патолог1чного ураження клГ тин I, як насл1док, розвитку ктмычно'! картини хвороби Гоше.
Кр1м того, було проведено визначення активной ОБТв в плазм1 кров1 пац1ент1в обох груп для встановлен-ня можливост1 використання цього маркеру для оцшки детоксикацмно! здатност1 клмтин I можливого II впли-ву на розвиток кл1н1чно'! картини за-хворювання (рис. 2Б).
Було показано, що достов1рно'! р1зниц1 м1ж активнютю ОБТз у пац1ен-т1в з «легшим» та «тяжюшим» пере-б1гом захворювання немае (и=73,5, р>0,05). Це скор1ше за все пов'язане з тим, що використаний нами метод визначення активност1 ОБТв дозволяе оцшити загальну активн1сть ц1е'!
велико! групи фермент1в, що не в Примггка: * розрахунки неможливi через вщсутнють випадкiв з таким поеднанням повнм м1р1 в1дображае внесок пев-них представник1в ц1е'! родини на
Таблиця 5.
Показники ризику розвитку «тяжкiшого» переб^у хвороби Гоше з 08ТТ1»-», 08ТМ1»-» генотипами та Ух поеднанням
Генотипи оя 95% С! XI Р
йвТЛ»-» 1,25 0,21-7,62 0,049 > 0,05
ОБТМЬ-» 48,0 3,70-622,03 9,56 < 0,01
азТТ1»-»/азТМ1»-» 6,5 0,56-76,18 1,11 > 0,05
азТТ1»+»/азТМ1»-» 16,25 1,44-183,10 4,39 < 0,05
азТТ1»-»/азТМ1»+» -*
детоксикац1йн1 властивост! кштин. В той же час, як показано багатьма досл1дженнями, алельний пол1мор-ф1зм ген1в вБТТ1, вБТМ1 глутатюн-8-трансфераз (ОБТз) може бути пов'язаний з порушенням процес1в детоксикаци та п1двищенням ризику розвитку р1зних патолог1чних стан1в [15].
Анал1зуючи частоту алельного по-л1морф1зму ген1в вБТТ1, вБТМ1 серед пац1ент1в з р1з-ним ступенем тяжкост1 хвороби Гоше, нами було показано наявнють асоц1ацИ певних пол1морфних вар1ант1в ген1в вБТТ1, вБТМ1 1з розвитком «тяжюшо!» кл1н1ч-но! картини захворювання (табл. 4). Так, у хворих з «легшим» переб1гом захворювання (табл. 5) частота алелю вБТМ1»-» була в1рогщно знижена у пор1внянн1 1з хворими з «тяжкшим» переб1гом (х2 =9,56, р<0,01). Наявнють цього алелю, навггь у поеднанн з функцю-нальним алелем вБТТ1»+», суттево п1двищуе ризик «тяжк1шого» переб1гу захворювання, тод1 як суттевих вщмшностей у частот! делец1йного алелю вБТТ1»-» в цих двох групах хворих не було виявлено.
Анал1зуючи вплив комплексу генотип1в по генам глютатюн-Б-трансфераз та штерлейкУв на тяжк1сть переб1гу хвороби Гоше сл1д зазначити, що поеднання мутантних вар1ант1в ген1в вБТМ1, И1Ьта 1Ивзначно пщ-вищувало ризик ускладнення захворювання (табл. 6).
Таким чином, нами було визначено, що вторинн модиф1куюч1 фактори, так1 як прозапальн1 мед1атори I фактори оксидативного стресу, а також гени спад-ково! схильност1 до розвитку аномально! реакцп ор-гаызму на первинне накопичення глюкоцереброзиду
Таблиця 6.
Показники ризику розвитку «тяжкшого» переб^у хвороби Гоше з поеднанням генотипiв по генам 08ТМ1, !МЬ та !Ь8
Генотипи оя 95% С! XI Р
ввТМИ»-»/И1Ь "3953СТ" 26,0 2,22-304,72 6,57 < 0,05
авТМ1»-»/Ив «-781Т" 49,0 3,76-637,82 9,80 < 0,01
ввТМИ»-»/И1Ь "3953СТ"/ Ив "-781Т" 17,5 1,56-196,33 4,8 < 0,05
впливають на розвиток фенотипу при хвороб! Гоше I можуть бути використан1 при оц1нц1 фактор1в ризику розвитку ускладнень для корегування патогенетич-них та симптоматичних терапевтичних заход1в.
Висновки
1. Визначено вщмшнють б1ох1м1чного фенотипу пац1ент1в з р1зним ступенем тяжкост1 хвороби Гоше при однаковому генотип!. Було показано, що актив-н1сть х1тотриозидази, р1вень неоптерину та оксидова-них протеУыв в плазм1 кров1 можуть бути критер1ями оц1нки активност1 патолог1чного процесу у пац1ент1в I в1дображати ступ1нь ураження орган1в I систем, тод1 як р1вень загальних глютат1он-Б-трансфераз з ц1ею метою використовувати недоц1льно.
2. Показано, що наявнють делецмного пол1мор-ф1зму гена ОБТМ1 та носмство алеля 3953Т в ген1 И1Ь можуть використовуватись як окремо, так I у поеднаны один з одним, для прогнозування ризику розвитку ускладнень при хвороб! Гоше I типу.
3. Найбтьший ризик ускладнень можна перед-бачити у ос1б з потр1йним поеднанням делец1йного пол1морф1зму гена ОБТМ1, нос1йства алеля 3953Т в ген1 И1Ь та носмства алеля -781Т в ген1 Ив.
4. Ц1 дан1 можуть бути використан1 при плануван-н1 патогенетичних та симптоматичних терапевтич-них заход1в для пац1ент1в з хворобою Гоше, яка обу-мовлена генотипами р.Ы4093/р.Ы4093, р.Ы4093/р. 1_483Р та р.Ы4093/р.Я159\М в ген1 ввЛ, з метою пщ-вищення ефективност1 л1кування та покращення якост1 життя пац1ент1в.
Перспективи подальших дослiджень. Надалi плануеться вивчити рiвень хiтортриозидази та нео-птершу у пацiентiв з хворобою Гоше, як мають iншi генотипи, для визначення ролi модифiкуючих фак-торiв у розвитку фенотипу хворих i розробки тдхо-дiв до iндивiдуалiзованого призначення патогене-тично! i симптоматично!терапи.
Лiтература
1. Горовенко Н.Г. Визначення х^отриозидазно! активностi в плазмi кровi як критерiй пщтверджуючо! дiагностики хворо-би Гоше / Н.Г. Горовенко, А.М. Недобой, Н.В. Ольхович, Т.П. 1ванова, О.М. Кочнева, Н.О. ГЛчкур, 1.С. Грегуль // Вюник Укратнського товариства генетикiв i селекцiонерiв. - 2006. - Т. 4, № 1. - С. 68-75.
2. Кузьмин В.Н. Значение полиморфизма и экспрессии генов цитокинов в прогнозировании риска преждевременных родов / В.Н. Кузьмин, Г.А. Мурриева // Лечащий врач. - 2013. - № 11. - C. 34-39.
3. Ольхович Н.В. Клшко-лабораторш показники ефективност ферментозамюно! терапи хвороби Гоше в Укратш / Н.В. Ольхович, О.М. Грищенко, Н.О. ^чкур, А.М. Недобой, Н.С. Трофiмова, Т.П. 1ванова, Н.Г. Горовенко // Лкарська справа. - 2011.
- № 1-2. - C. 95-104.
4. Ризванова Ф.Ф. Генетическая диагностика: полиморфизм генов цитокинов / Ф.Ф. Ризванова, О.И. Пикуза, Р. А. Файзулли-на, Р.Ф. Гайфуллина, А.А. Ризванов, О.А. Кравцова // Педиатрия. - 2010. - Вып. 06 (10). - C. 12-19.
5. Ballabio A. Lysosomal disorders: From storage to cellular damage / A. Ballabio, V. Gieselmann // Biochimica et Biophysica Acta.
- 2009. - Vol. 1793. - P. 684-696.
6. Baris H.N. Gaucher disease: the metabolic defect, pathophysiology, phenotypes and natural history / H.N. Baris, I.J. Cohen, P.K. Mistry // Pediatr Endocrinol Rev. - 2014. - Sep; 12 Suppl 1. - P. 72-81.
7. Beutler E. Gaucher disease. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 7th ed. / E. Beutler, G.A. Grabowski, C.R. Scriver, A._. Beaudet, W.S. Sly, D. Valle. - New York: McGraw-Hill, 1995. - Р. 2641-2670.
8. Blau N. Laboratory guide to the methods in biochemical genetics / N. Blau, M. Duran, K.M. Gibson. - Hidelberg: Springer, 2008. - P 860.
9. Bussink A.P. The Biology of the Gaucher Cell: The Cradle of Human Chitinases / A.P. Bussink, M. van Eijk, G.H. Renkema, J.M. Aerts, R.G. Boot // International Review of Cytology. - 2006. - Vol. 252. - P. 71-128.
10. Casal J.A. Relationships between Serum Markers of Monocyte/Macrophage Activation in Type 1 Gaucher's Disease / J.A. Casal, _. Lacerda, _.F. P^ez, R.A. Pinto, M.C. S6 Miranda, J.C. Tutor // Clin Chem Lab Med. - 2002. - Vol. 40 (1). - P. 52-55.
11. Fairley C. Phenotypic heterogeneity of N370S homozygotes with type I Gaucher disease: An analysis of 798 patients from the ICGG Gaucher Registry / C. Fairley, A. Zimran, M. Phillips, M. Cizmarik, J. Yee, N. Weinreb, S. Packman // J Inherit Metab Dis. -2008. - Vol. 31. - P. 738-744.
12. Gervas-Arruga J. The Influence of Genetic Variability and Proinflammatory Status on the Development of Bone Disease in Patients with Gaucher Disease / J. Gervas-Arruga, J.J. Cebolla, I. de Blas, M. Roca, M. Pocovi, P. Giraldo // PLoS ONE. - 2015. - Vol. 10 (5). - P 1-15.
13. Gorovenko N.G. The role of genetic determinant in the development of severe perinatal asphyxia / N.G. Gorovenko, Z.I. Rossokha, S.V. Podolskaya, V.I. Pokhylko, G.A. Lundberg // Cytology and Genetics. - 2010. - № 5. - Р. 41-46.
14. Hayes J.D. Glutathione transferases / J.D. Hayes, J.U. Flanagan, I.R. Jowsey // Annu Rev Pharmacol Toxicol. - 2005. - Vol. 45. - P 51-88.
15. Hayes J.D. Glutathione S-Transferase Polymorphisms and Their Biological Consequences / J.D. Hayes, R.C. Strange // Pharmacology. - 2000. - Vol. 61. - P. 154-166.
16. Hruska K.S. Gaucher Disease: Mutation and Polymorphism Spectrum in the Glucocerebrosidase Gene (GBA) / K.S. Hruska, M.E. LaMarca, C.R. Scott, E. Sidransky // Human Mutation. - 2008. - Vol. 29 (5). - P. 567-583.
17. Hughes D.A. The pathophysiology of GD - current understanding and rationale for existing and emerging therapeutic approaches / D.A. Hughes, G.M. Pastores // Wien Med Wochenschr. - 2010. - Vol. 160/23-24. - P. 594-599.
18. Lakhdar R. Relationship between glutathione S-transferase P1 polymorphisms and chronic obstructive pulmonary disease in a Tunisian population / R. Lakhdar, S. Denden, J. Knani, N. Leban // Genetics and Molecular Research. - 2010. - Vol. 9 (2). - P. 897-907.
19. Mehta A. Lysosomal storage disorders: a practical guide / A. Mehta, B. Winchester. - London: Wiley-Blackwell, 2012. - P. 38-46.
20. Mello A.S. Oxidative stress parameters of Gaucher disease type I patients / A.S. Mello, C. da Silva Garcia, F. de Souza Machado, N. da Silva Medeiros, M.F. Wohlenberg, J.P. Marinho, C. Dani, C. Funchal, J.C. Coelho // Molecular Genetics and Metabolism Reports. - 2015. - Vol. 4. - P. 1-5.
21. Urso M.L. Oxidative stress, exercise, and antioxidant supplementation / M.L. Urso, P.M. Clarkson // Toxicology. - 2003. - Vol. 189. - P. 41-54.
22. Zimran A. Gaucher disease. Clinical, laboratory, radiologic, and genetic features of 53 patients / A. Zimran, A. Kay, T. Gelbart // Medicine. - 1992. - Vol. 71. - P. 337-353.
УДК 616-056.7-07
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧН1 ТА Б1ОХ1М1ЧН1 ФАКТОРИ ФОРМУВАННЯ ФЕНОТИПУ ПАЦЮНТ1В З ХВОРОБОЮ ГОШЕ I ТИПУ
Ольхович Н. В., Россоха З. I., ^чкур Н. О., Попова О. Ф., Горовенко Н. Г.
Резюме. Хвороба Гоше (ХГ) - це спадкове аутосомно-рецесивне захворювання, яке спричинене пору-шенням функцп одые! з лiзосомних гидролаз - глюкоцереброзидази (ЕС 3.2.1.45). Хвороба Гоше l типу (не-нейронопатична) представляе собою найпоширеышу форму захворювання, яка не асоцтеться з невроло-пчною маыфеста^ею, але представлена широким спектром ктычно! презентацп, основними ознаками яко! е гепатоспленомегалiя, цитопеыя та кiстковi ураження. В нашнй робот було проведено доотдження бiохiмiч-них та молекулярно-генетичних маркерiв, як можуть бути використан для оцЫки ризику пщвищення тяжко-ст переб^у хвороби Гоше l типу, тому представляють собою потенцмы Ыструменти для полтшення юнуючо!
терапп. Було показано, що активнють хiтотриозидази, рiвень неоптерину та оксидованих проте!ыв в плазмi кровi можуть бути критерiями оцiнки активной патологiчного процесу у пацiентiв i вiдображати ступiнь ура-ження оргаыв i систем, тодi як рiвень загальних глютатiон-S-трансфераз з цiею метою використовувати не-доцiльно. Крiм того, було показано, що наявнють делецмного полiморфiзму гена GSTM1 та носмство алеля 3953T в генi IL1b можуть використовуватись як окремо, так i у поеднанн один з одним, для прогнозування ризику розвитку ускладнень при хворобi Гоше l типу.
Ключовi слова: хвороба Гоше, хгготриозидаза, неоптерiн, оксидованi проте!ни, гени GSTM1, GSTT1, IL1b, IL8.
УДК 616-056.7-07
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ФОРМИРОВАНИЯ ФЕНОТИПА ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЬЮ ГОШЕ I ТИПА
Ольхович Н. В., Россоха З. И., Пичкур Н. А., Попова Е. Ф., Горовенко Н. Г.
Резюме. Болезнь Гоше (ХГ) - это наследственное аутосомно-рецессивное заболевание, которое вызвано нарушением функции одной из лизосомных гидролаз - глюкоцереброзидазы (ЕС 3.2.1.45). Болезнь Гоше I типа (ненейронопатическая) представляет собой самую распространенную форму заболевания, которая не ассоциируется с неврологической манифестацией, но представлена широким спектром клинической презентации, основными признаками которой являются гепатоспленомегалия, цитопения и костные поражения. В нашей работе было проведено исследование биохимических и молекулярно-генетических маркеров, которые могут быть использованы для оценки риска повышения тяжести течения болезни Гоше I типа, поэтому представляют собой потенциальные инструменты для улучшения существующей терапии. Было показано, что активность хитотриозидазы, уровень неоптерина и оксидированных протеинов в плазме крови могут быть критериями оценки активности патологического процесса у пациентов и отражать степень поражения органов и систем, тогда как уровень общих глютатион-Б-трансфераз с этой целью использовать нецелесообразно. Кроме того, было показано, что наличие делеционного полиморфизма гена GSTM1 и носительство аллеля 3953T в гене IL1b могут использоваться как отдельно, так и в сочетании друг с другом, для прогнозирования риска развития осложнений при болезни Гоше I типа.
Ключевые слова: болезнь Гоше, хитотриозидаза, неоптерин, оксидированные протеины, гены GSTM1, GSTT1, IL1b, IL8.
UDC 616-056.7-07
MOLECULAR-GENETIC AND BIOCHEMICAL FACTORS INFLUENCING THE PHENOTYPE OF GAUCHER DISEASE PATIENTS
Olkhovych N. V., Rossoha Z. I., Pichkur N. A., Popova E. F., Gorovenko N. G.
Abstract. Gaucher disease (GD) is a hereditary autosomal-recessive disorder, caused by the functional deficiency of one of lysosomal hydrolases - glucocerebrosidase (EC 3.2.1.45). Type I Gaucher disease (non-neuronopathic) is the most common form, not associated with neurological manifestation, but present in a wide spectrum of clinical signs, the main ones being hepatosplenomegaly, cytopenia and bone system abnormalities. The severity of clinical signs of this disease and the age of the disease onset vary from practically asymptomatic cases to severe disabling conditions, when secondary hematological and bone changes lead to high prevalence of complications and often result in the death of patients. Taking into consideration the fact that the clinical course of Gaucher disease is conditioned by a whole number of pathogenic mechanisms of the cell response to the accumulation of glucocerebrosidase, the key role among which is played by chronic inflammation and oxidative stress, the individual specificities of such response are different for different organisms, which is caused by both genetic, epigenetic and environmental factors. The blood samples of patients, who are suffering from Gaucher disease and have been found to have genotypes р.М4098/р.Ы4093, р.N409S/р._483P and р.N409S/р.R159W in the GBA gene, served as the study material. To estimate the factors, which may influence the development of the clinical course of the disease, our study involved the investigation of the level of secondary biochemical markers of intracellular pathological processes, activated in response to the primary biochemical deficiency as well as genetic factors, impacting the intensity of this response.
It was established that there was a difference in the biochemical phenotype of patients with a different severity rate of Gaucher disease but the identical genotype. It was demonstrated that the activity of chitotriosidase, the level of neopterin and oxidized proteins in blood plasma may serve as criteria of evaluating the activity of the pathological process in patients and reflect the degree of damage of organs and systems, whereas it is unreasonable to use the level of general glutathione-S-transferases for this purpose. In addition, it was demonstrated that the availability of the deletion polymorphism of the GSTM1 gene and the presence of allele 3953T in the IL1b gene may be used both separately and in combination with one another to predict the risk of developing complications of type I Gaucher disease. But the highest risk of complications may be predicted in patients with the triple combination of the deletion polymorphism of the GSTM1gene, the presence of allele 3953T in the IL1b gene and the presence of allele 781Т in the IL8 gene. These data may be used while planning pathogenic and symptomatic therapeutic measures for patients, suffering from Gaucher disease, conditioned by genotypes р.М4098/р.Ы4093, р.N409S/р._483P and р.Ы4093/р. R159W in the GBA gene, with the purpose of enhancing treatment efficiency and improving the quality of patients' life.
Keywords: Gaucher disease, chitotriosidase, neopterin, oxidized proteins, genes GSTM1, GSTT1, IL1b, IL8.
Рецензент - проф. Островська С. С.
Стаття надшшла 27.01.2017 року
