CC BY
116
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.5-006.04-07:577.21.08
Молекулярно-генетическое определение Т-клеточной клональности лимфоидных клеток
В.А. Молочков14, А.М. Ковригина2, Ю.В. Сидорова3, Г.В. Меньщикова1, А.А. Грознова4, А.В. Федоровская1
1Отделение дерматовенерологии и дерматоонкологии (зав. — проф. В.А. Молочков) МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского; 2лаборатория патоморфологии (зав. — д-р мед. наук А.М. Ковригина) ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России; Лаборатория молекулярной гематологии (зав. — канд. биол. наук А. Б. Судариков); 4кафедра кожных и венерических болезней (зав. — проф. В.А. Молочков) ФППОВ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России
Статья посвящена совершенствованию ранней диагностики Т- и В-клеточных лимфом кожи, в том числе дифференциальной диагностики с крупнобляшечным парапсориазом, Т- и В-клеточными псев-долимфомами кожи, а также уточнению частоты их трансформации в злокачественные лимфомы кожи.
Ключевые слова: злокачественные лимфомы кожи, полимеразная цепная реакция, клональность, Т-клеточный рецептор
MOLECULAR GENETIC IDENTIFICATION OF T-CELL CLONALITY OF LYMPHOID CELLS V.A.Molochkov, A.M.Kovrigina, Yu. V.Sidorova, G. V.Menshchikova, A.A.Groznova, A. V.Fedorovskaya
1M.V.Vladimirsky Moscow Regional Research and Clinical Institute; ^Hematology Research Center, Moscow; 3I.M.Sechenov Moscow State Medical University
The authors discuss problems in improvement of early diagnosis of T- and B-cell cutaneous lymphomas and differentiatial diagnose from large-plaque parapsoriasis, T- and B-cell cutaneous pseudolymphomas, and evaluate the incidence of their transformation into malignant skin lymphomas.
Key words: malignant skin lymphomas, polymerase chain reaction, clonality, T-cell receptor
ДЕРМАТООНКОЛОГИЯ
Современная диагностика лимфом кожи осуществляется комплексно с использованием гистологического, иммунофенотипического и молекулярно-гене-тического методов исследования [1—3]. Последний не только повышает точность диагностики лимфом кожи на 5—10%, может применяться для их раннего выявления [1, 3], но и весьма удобен, так как не требует больших временных затрат и может проводиться с использованием микробиоптатов (пункционная биопсия диаметром не более 3 мм) кожи и ДНК из парафиновых блоков (архивный, а не только свежий биопсийный материал) [2, 3]. С другой стороны, следует учитывать, что выявляемая с его помощью моноклональность лимфоидных клеток еще не указывает на наличие у пациента лимфомы (как, например, это наблюдается при лимфоматоидном папуле-зе, красной волчанке или системной склеродермии) [2] и для установления такого диагноза обязательно нужна гистологическая верификация.
В более ранних работах мы продемонстрировали высокую информативность в диагностике и диф-
ференциальной диагностике Т-клеточных лимфом кожи (Т-КЛК) одного из методов полимеразной цепной реакции (PCR) — метода конформационного одноцепочечного полиморфизма (SSCP) на основе определения Т-клеточной клональности лимфоидных клеток по генам у-цепи Т-клеточного рецептора (TCRy) [2].
Цель исследования — сравнительная оценка результатов молекулярно-генетического определения Т-клеточной клональности лимфоидных клеток по генам TCRy с помощью методов SSCP и фраг-ментного анализа (FA) со стандартизированными PCR-праймерами по протоколу BIOMED-2 BMH4-CT98-3936 при дифференциальной диагностике Т-КЛК с В-клеточной лимфомой кожи (В-КЛК), клинически сходными с ними доброкачественными дерматозами (крупно- и мелкобляшечным парапсориазом — КБП и МБП), псевдолимфомой кожи (ПЛК) и хроническими доброкачественными дерматозами (ХДД), такими как атопический дерматит, экзема, псориаз.
Сведения об авторах:
Молочков Владимир Алексеевич — д-р мед. наук, проф.; Ковригина Алла Михайловна — д-р мед. наук, проф.; Сидорова Юлия Владимировна — канд. мед. наук, науч. сотр.; Меньщикова Галина Владимировна — канд. мед. наук, ассистент; Грознова Анна Александровна — аспирант (anna_groznova@list.ru); Федоровская Анастасия Владимировна — аспирант.
№ 2, 2013
Клинические признаки и предполагаемый диагноз у обследуемых больных (п = 131) Таблица 1
Клинические признаки, выявленные у обследуемых больных Количество пациентов Диагноз, предполагаемый на основании клинической картины
абс. % Т-КЛК В-КЛК парапсориаз ПЛК ХДД
Пятна эритематозно-сквамозные 72 55 53 2 15 0 15
Бляшки 42 35 45 2 15 4 14
Узлы 15 13 3 7 0 6 0
Пойкилодермия 49 3 11 0 1 0 1
Полилимфаденопатия 30 25 23 6 1 0 5
Зуд 81 68 45 8 5 7 11
Сухость кожи 48 39 38 3 3 0 7
Результаты молекулярно-генетического обследования при гистологически с ними заболеваниях Таблица 2 верифицированных Т-КЛК, В-КЛК и сравниваемых
Количество Диагноз по данным гистологического исследования РСЯ^СР-ТСЯу РСЯ-ФА-ТСЯу РСЯ-^И
больных (п = 131) моно поли моно поли моно
99 Т-КЛК (п = 49) КБП (п = 14) МБП (п = 5) ПЛК (п = 7) ХДД (п = 24) 49 (100%) 0 0 0 0 0 14 5 (100%) 7 (100%) 24 (100%) 49 (100%) 1(7%)* 0 0 0 0 13 5 (100%) 7 (100%) 24 (100%) -
9 В-КЛК (п = 9) 0 0 0 0 9 (100%)
23 Результат исследования не позволяет достоверно верифицировать диагноз 12 (52%) 0% 7 (31%) 4(17%) -
10 Группа контроля 0 10 (100%) 0 10 (100%) -
Примечание. *У 1 больного КБП через 3 мес после выявления моноклональности методом БА-ТСКу также выявлена Т-КЛК с помощью патоморфологического метода исследования.
Результаты обследования больных 1-й группы Таблица 3
№ наблюдения Пациент Возраст, годы Пол Клиническая картина Гистологический диагноз РСЯ^СР-ТСЯу* РСЯ-РА-ТСЯу**
1 С. 44 М. Эритродермия Т-КЛК 0 +
2 М. 56 М. Пятна Т-КЛК 0 +
3 П. 52 Ж. Эритродермия Т-КЛК 0 +
4 И. 57 М. Пятна Т-КЛК 0 +
5 Х. 37 М. Пятна, бляшки Т-КЛК 0 +
6 М. 72 М. Пятна, бляшки Т-КЛК 0 +
7 З. 55 М. Эритродермия Т-КЛК 0 +
8 М. 72 М. Эритродермия Т-КЛК 0 +
9 С. 55 Ж. Эритродермия Т-КЛК 0 +
10 Т. 36 Ж. Пятна Т-КЛК 0 +
11 В. 65 Ж. Пятна Дерматит 0 -
Примечание. Здесь и в табл. 4: *праймеры опубликованы в работе Т. Огетег [4]; **— праймеры по протоколу ВЮМЕБ-2 [5]; плюс — моноклональный результат, минус — поликлональный результат.
Таблица 4
Результаты обследования больных 2-й группы
№ наблюдения Больной Возраст, годы Пол Клиническая картина Гистологический диагноз PCR-SSCP-TCRy* PCR-FA-TCRy**
1 Ц. 56 М. Эритродермия Т-КЛК + +
2 З. 49 Ж. Пятна Т-КЛК + +
3 Т. 69 Ж. Эритродермия Т-КЛК + +
4 И. 55 М. Пятна Т-КЛК + +
5 И. 37 М. Пятна, бляшки Т-КЛК - +
6 Т. 48 М. Пятна, бляшки Т-КЛК - +
7 Л. 55 Ж. Эритродермия Дерматит - +
8 Т. 58 Ж. Эритродермия Дерматит - +
9 С. 77 Ж. Эритродермия Дерматит - -
10 Х. 56 Ж. Пятна Дерматит - -
11 Ж. 65 М. Пятна Дерматит - -
12 И. 66 Ж. Пятна Дерматит - -
Материалы и методы
Обследован 131 пациент (55 мужчин и 76 женщин) в возрасте от 27 до 87 лет (средний возраст 57 ± 4,9 года) с патологическим процессом, требующим отличия Т-КЛК от других, сходных по клиническим проявлениям заболеваний. Объектом исследования являлись биоптаты кожи из очагов поражения всех обледуемых пациентов. Контролем служили 10 биоптатов кожи здоровых лиц.
На выраженное клиническое сходство с Т-КЛК сравниваемых заболеваний, таких как В-КЛК, парапсориаз, ПЛК и ХДД, указывают данные табл. 1.
Сходство клинических признаков требовало для установления диагноза Т-КЛК проведения гистологического исследования биоптата пораженной кожи (см. табл. 1), на основании которого он был подтвержден у 49 больных, у 23 было высказано лишь подозрение на Т-КЛК, у 9 — диагностирована В-КЛК, у 14 — КБП, у 5 — МБП, у 7 — ПЛК, у 24 — ХДД.
Результаты и обсуждение
При исследования биоптатов кожи методами SSCP и FA по генам TCRy (FA-TCRy и SSCP-TCRy) у пациентов с гистологически верифицированным диагнозом получены статистически одинаковые результаты при Т-КЛК (срок заболевания варьировал от 3 до 25 лет, в среднем составил 6,3 ± 4,6 года), В-КЛК, ХДД и в группе контроля (табл. 2).
Оставшиеся 23 пациента с клиническим подозрением на Т-КЛК и без гистологической верификации диагноза были разделены на 2 группы (1-я группа — 11 пациентов, средний срок заболевания 8,3 ± 5,1 мес, 2-я группа — 12 пациентов, средний срок заболевания 10,7 ± 5,7 мес) и обследованы с помощью PCR-методов FA и SSCP по генам TCRy.
Результаты молекулярно-генетического исследования биоптатов кожибольных 1-й группы с помощью методов FA-TCRy и SSCP-TCRy представлены в табл. 3.
Как видно из табл. 3, при исследовании методом FA-TCRy моноклональность выявлена в наблюдениях № 1—10 в сроки заболевания от 6 до 18 мес (в среднем 11,1 ± 4,6 мес). Гистологическая верификация диагноза Т-КЛК была осуществлена в более поздние сроки болезни — от 7 до 24,5 мес (в среднем 14,6 ± 5,6 мес) соответственно.
Результаты молекулярно-генетического исследования биоптатов кожи больных 2-й группы с помо-
щью методов ЕА-ТСЯу и 88СР-ТСЯу представлены в табл. 4, из которой видно, что моноклональность лимфоидных клеток выявили в наблюдениях № 1—4 в сроки заболевания от 3,5 до 23 мес (в среднем 9,6 ± 7,9 мес; р > 0,05). Гистологический диагноз Т-КЛК во 2-й группе был установлен позже — в сроки болезни 9, 11, 17, 31 мес соответственно (в среднем 17 ± 8,6 мес).
Таким образом, в диагностике и дифференциальной диагностике Т-КЛК оба метода (РСЯ-88СР-ТСЯу и РСЯ-ФА-ТСЯу) оказались одинаково информативными в поздние (от 3 до 25 лет) сроки болезни; в более ранние сроки Т-КЛК метод БЛ с праймерами по протоколу Б10МББ-2 оказался существенно чувствительнее (64 и 33% соответственно), что позволяет с большой достоверностью рекомендовать метод РСЯ-ЕА-ТСЯу для проведения ранней диагностики лимфом кожи.
ЛИТЕРАТУРА
1. Никитин Е.А., Сидорова Ю.В., Рыжикова Н.В., Бидер-ман Б.В., Меликян А.Л., Виноградова Ю.Э. и др. Определение Т-клеточной клональности по гамма-цепи Т-клеточного рецептора: окончательные данные. Терапевтический архив. 2006; 7: 52—7.
2. Овсянникова Г.В. Современные методы комплексной диагностики злокачественных лимфом кожи: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М.; 2009.
3. Delabesse E., Burtin M.-L., Millien C., Madonik A., Arnulf B., Beldjord K., et al. Rapid, multifluorescent TCRG Vgamma and Jgamma typing: application to T cell acute lymphoblastic leukemia and to the detection of minor clonal populations. Leukemia. 2000; 14(6): 1143—52.
4. Greiner T.C., Rafeld M., Lutz C., Dick F., Jaffe E.S. Analysis of T-cell receptor-gamma gene rearrangements by denaturing gradient gel electrophoresis of GC-clamped polymerase chain reaction products: correlation with tumor-specific sequences. Am. J. Pathol. 1995; 146(1): 46—55.
5. van Dongen J.J., Langerak A.W., Bruggemann M., Evans P.A., Hummel M., Lavender F.L., et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobu-lin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphop-roliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4 CT98-3936. Leukemia. 2003; 17(12): 2257—317.
Поступила 28.11.12
