CC BY
93
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБСЛЕДОВАНИЕ БОЛЬНЫХ С НАРУШЕНИЕМ ПОЛОВОГО РАЗВИТИЯ
А.А. Слепцов1, М.С. Назаренко12, Л.П. Назаренко12, АЛ. Сухомясова3, А.Н. Ноговицына3, Н.Р. Максимова3, Е.Е. Гуринова3
1НИИ медицинской генетики СО РАМН, Томск 2ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России, Томск 3Якутский научный центр комплексных медицинских проблем СО РАМН E-mail: [email protected]
GENETIC TESTING OF PATIENTS WITH DISORDERS OF SEX DEVELOPMENT
А.А. Sleptsov1, М3. Nazarenko12, L.P. Nazarenko12, А1. Sukhomyasova3, А.№ Nogovitsina3, N.R. Maximova3, Е.Е. Gurinova3
Institute of Medical Genetics of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, ^msk
2Siberian State Medical University, ^msk 3Yakutsk Scientific Center of Complex Medical Problems of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences
Заболевания, связанные с нарушением полового развития, представляют собой гетерогенную группу аномалий детерминации и дифференцировки пола. Несмотря на высокую частоту патологии, причины большинства случаев остаются неясными. В настоящем исследовании проведено стандартное кариотипирование и молекулярногенетическое тестирование гена SRY у 6 больных с нарушением полового развития. В результате у больного с первичной аменореей идентифицирована мутация, которая создает преждевременный терминирующий кодон (p.Trp70X). Информация, полученная при молекулярно-генетическом обследовании, поможет в разработке стратегии медико-генетического консультирования и тактики ведения данной категории больных.
Ключевые слова: нарушение полового развития, Y-хромосома, SRY
Disorders of sex development comprise a heterogeneous group of disorders of sex determination and differentiation. In spite of many patients affected, no definitive cause for the disorder can be found. In the current study G-banded karyotyping and mutation analysis of the SRY gene was performed in six patients with poor sexual development. The mutation that results in a premature stop codon (p.Trp70X) was detected in patient with primary amenorrhea. Genetic test data will help to develop the strategy of genetic counseling and management of these patients.
Key words: 46, XY disorders of sex development, Y-chromosome, SRY.
Введение
Мужской пол человека, как и в целом у всех млекопитающих, детерминируется Y-хромосомой. Но не всегда кариотип 46^ связан с мужским фенотипом. Причиной патологии могут быть мутации в различных генах, отвечающих за детерминацию и дифференцировку мужского пола [8].
Y-хромосома человека подвержена высокой скорости мутирования, отчасти из-за большего количества и быстрого темпа делений сперматозоидов в процессе гаме-тогенеза. Кроме того, мужские половые клетки находятся в высокоокислительной среде яичек, где отсутствуют ферменты репарации повреждений. Эти факторы повышают риск мутирования Y-хромосомы в 4,8 раза по сравнению с остальным геномом [4].
Сибирский медицинский журнал, 2011, Том 26, № 4, Выпуск 2
Ген SRY (от англ. Sex-determining region Y; OMIM#480000) картирован в локусе Yp11.3. Он состоит из 1 экзона. Белковый продукт гена - TDF (от англ. testes-determining factor) играет ключевую роль в детерминации яичка [1, 9]. Он является членом семейства ДНК-свя-зывающих белков, так как содержит домен HMG-бокс, который занимает 13-82 кодоны. Домен HMG-бокс (от англ. high mobility group - “сверхподвижная группа”) обладает свойством связываться и сгибать ДНК, тем самым активируя транскрипцию и взаимодействие между определенными продуктами генов [1, 3].
В настоящее время идентифицировано около 69 мутаций в пределах открытой рамки считывания гена SRY [6]. Большинство из них локализуются в HMG-бокс домене. Мутации идентифицированы приблизительно у 1% лиц с нарушением полового развития при кариотипе 46,XY (НПР 46,XY) и 15% индивидов с полным гонадным дисгенезом при кариотипе 46,XY (ПГД 46,XY) [14].
В совокупности 46,ХУ НПР и 46,ХУ ПГД встречаются с частотой 1:20000 [11]. НПР характеризуется 46,XY кари-отипом, двойственными гениталиями с легкой или тяжелой формой членомошоночной гипоспадии с или без искривления полового члена, дисгенетическими яичками, отсутствием сперматогенеза, Мюллеровы структуры могут быть полностью развиты или отсутствовать. Основные признаки ПГД включают 46,XY кариотип, нормальные наружные женские гениталии, абсолютно неразвитые гонады (в виде “тяжей”), отсутствие сперматогенеза и нормально сформированные Мюллеровы структуры.
Значительные достижения в области генетики развития внесли вклад в понимание молекулярных основ данных патологических состояний. Вместе с тем, причины большинства случаев остаются неясными. Цель настоящего исследования заключалась в комплексном клиническом обследовании и молекулярно-генетическом тестировании гена SRY у 6 больных (5 семей) с нарушением полового развития при кариотипе 46,XY.
Материал и методы
Обследование проводилось на базе генетической клиники НИИ медицинской генетики СО РАМН (Томск) и медико-генетической консультации Якутска (Республика Саха). От всех больных и членов их семей получено информированное согласие.
Больные Ж.1 и Ж.2 были из одной семьи, а остальные -из разных. Ж.1, якутской национальности, 15 лет, клинически: аплазия матки, гинекомастия, акромегалия и гона-добластома. Ж.2, якутской национальности, 13 лет, клинически: аплазия влагалища, гипоплазия молочных желез и гонадобластома. К.А., якутской национальности, 14 лет, клинически: гипоплазия матки, акромегалия и го-надобластома. Больной К.В., якутской национальности, клинически: двойственные гениталии, кистозно-измененные яичники, гипоплазия матки и труб, а также врожденный порок развития центральной нервной системы. Он умер в возрасте до одного года. Г., русской национальности, 8 лет, клинически: гипоплазия матки и яичников, расположены типично, без фолликулов. С1. Д., русской национальности, 10 лет, клинически: гипоплазия матки,
труб и яичников, без фоликулов.
Кариотип верифицирован с помощью стандартного цитогенетического исследования. Все индивиды имеют кариотип 46 XY.
Геномная ДНК выделена из лейкоцитов периферической крови стандартным методом [13]. ПЦР проведена с использованием специфичных праймеров и условий амплификации, опубликованных ранее [15]. Секвенирова-ние осуществлялось на приборе ABI Prism 3130х с помощью реактивов и согласно протоколу производителя (‘Applied Biosystems”, США). Полученные нуклеотидные последовательности сравнивались с последовательностью гена SRY (GenBank ENSG00000184895).
Результаты и обсуждение
Заболевания, связанные с нарушением полового развития, регистрируются с частотой 1:3000 новорожденных и варьируют в своей тяжести от аномалий наружных половых органов до полной инверсии пола [2].
Согласно современной классификации, термин “нарушение полового развития” объединяет заболевания, при которых наружные половые органы сформированы атипично по отношению к кариотипу и гонадам. Определение кариотипа лежит в основе разделения патологии на несколько категорий. Это группа, связанная с аномалиями половых хромосом; нарушением полового развития при кариотипе 46,XY (НПР 46,XY) и при кариоти-пе 46,XX (НПР 46,XX). Причем группа НПР 46,XY гораздо больше по размеру, но существенно меньше успехов достигнуто в установлении точного диагноза по сравнению с таковой при кариотипе 46,XX [12].
В ряде работ показана ключевая роль белкового продукта гена SRY в развитии гонад по мужскому типу [9,3]. В настоящем исследовании у больного К.А. была идентифицирована мутация NMJ303140.1:c.209G>A Замена создает преждевременный терминирующий кодон (p.Trp70X), что приводит к укорочению белка и потере его функции.
Выявленная мутация была описана ранее [5]. Hawkins J.R. и др. обследовали 17 больных с женским фенотипом и кариотипом 46,XY. Результаты показали, что у одного индивида имелась аналогичная мутация. Она возникла de novo. К сожалению, в статье отсутствует подробное клиническое описание больного.
По происхождению большинство мутаций в гене SRY de novo, но существуют отдельные сообщения об их наследовании от фенотипически здорового отца [7]. В настоящей работе молекулярно-генетическое обследование других членов семьи не проводилось, поскольку в банке ДНК не было их биологического материала.
Больные с ПГД 46 XY имеют высокий риск развития гонадобластом. Включение в диагностический алгоритм молекулярно-генетического обследования поможет в разработке стратегии медико-генетического консультирования и тактики ведения данной категории больных.
Заключение
Поскольку мутация в гене SRY была выявлена лишь у одного индивида из исследуемой группы, представляет-
А.А. Слепцов и соавт.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБСЛЕДОВАНИЕ БОЛЬНЫХ...
ся актуальным увеличение спектра тестируемых генов. В частности, известно, что кроме гена SRY, НПР могут быть связаны с мутациями в других генах, ответственных за развитие гонад (SF1 (NR5A1), DAX1 (NR0B1), ВИН, WT1, WNT4 и SOX9). С другой стороны, применение современных молекулярно-цитогенетических технологий позволяет идентифицировать микроделеции и дупликации, приводящие к ПГД 46,XY [10]. В связи с этим особый интерес для дальнейшего исследования представляет расширение банка ДНК семейных и спорадических случаев НПР, что дополнит имеющиеся представления о механизмах патологии.
Литература
1. Смирнов А.Ф. Молекулярно-генетические механизмы первичной детерминации пола у млекопитающих // Соросов-ский образовательный журнал. - 1997. - № 1. - C. 26-34.
2. Camerino G., Parma P., Radi O. et al. Sex determination and sex reversal // Curr. Opin. Genet. Dev. - 2006. - Vol. 16, No. 3. -P. 289-292.
3. Giese K., Pagel J., Grosschedl R. Distinct DNA-binding properties of the high mobility group domain of murine and human SRY sex-determining factors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1994. -Vol. 91, No. 8. - P. 3368-3372.
4. Graves J.A. Sex chromosome specialization and degeneration in mammals // Cell. - 2006. - Vol. 124, No. 5. - P 901-914.
5. Hawkins J.R., Taylor A., Berta P. et al. Mutational analysis of SRY: nonsense and missense mutations in XY sex reversal // Hum. Genet. - 1992. - Vol. 88, No. 4. - P. 471-474.
6. The human gene mutation database [Электронный ресурс]. -URL: http://www.hgmd.org.
7. Isidor B., Capito C., Paris F. et al. Familial frameshift SRY mutation inherited from a mosaic father with testicular dysgenesis syndrome // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2009. - Vol. 94, No. 9.
- P 3467-3471.
8. Jawaheer D., Juo S.H., Le Caignec С. et al. Mapping a gene for 46,XY gonadal dysgenesis by linkage analysis // Clin. Genet. -2003. - Vol. 63, No. 6. - P. 530-535.
9. Knower K.C., Kelly S., Harley V.R. Turning on the male - SRY, SOX9 and sex determination in mammals // Cytogenet. Genome Res. - 2003. - Vol. 101, No. 3-4. - P. 185-198.
10. Ledig S., Hiort O., Scherer G. et al. Array-CGH analysis in patients with syndromic and non-syndromic XY gonadal dysgenesis: evaluation of array CGH as diagnostic tool and search for new candidate loci // Hum. Reprod. - 2010. - Vol. 25, No. 10. -P. 2637-2646.
11. Ostrer H. Sexual differentiation // Semin. Reprod. Med. - 2000.
- Vol. 18, No. 1. - P. 41-49.
12. Pasterski V., Prentice P., Hughes I.A. Impact of the consensus statement and the new DSD classification system // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. - 2010. - Vol. 24, No. 2. - P. 187195.
13. Sambrook J., Russel D.W. Molecular cloning : a laboratory manual. - NY. : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. -P. 2344.
14. Veitia R., Ion A., Barbaux S. et al. Mutations and sequence variants in the testis-determining region of the Y chromosome in individuals with a 46,XY female phenotype // Hum. Genet. -1997. - Vol. 99, No. 5. - P 648-652.
15. Wang Y., Li Q., Xu J. et al. Mutation analysis of five candidate genes in Chinese patients with hypospadias // Eur. J. Hum. Genet.
- 2004. - Vol.12, No. 9. - P. 706-712.
Поступила 12.09.2011
