CC BY
33
УДК 577.2:595.773.4
© Л. Н. Нефедова, Д. о. коростин, м. В. Потапова, Н. И. Романова,
А. И. ким
Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра генетики
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИИ АНАЛИЗ РЕГУЛЯТОРНОГО ГЕНА DIP1 У РАЗНЫХ ВИДОВ DROSOPHILA
' Ген D1P1 является регуляторным геном D. melanogaster, функция которого не известна.В результате альтернативного сплайсинга образуется не менее 6 вариантов
мРНк ф1Р1-с/К1ей-с, Э1Р1-Ь/ К1ей^, Э1Р1< Э!Р1-а, К1ей-а и К1ей-Ь). Проанализированы структура и экспрессия гомологов гена D1P1 у видов подгруппы melanogaster: D. melanogaster,
D. secheШa, D. таигШапа,
D. smulans, D. erecta и D. yakuba. У D. secheШa, D. simulans и D. mauritiana, в отличие от D. melanogaster, D. erecta и D. yakuba, обнаружены изменения, влияющие на экспрессию гомологов гена D1P1. У них не выявлено форм, гомологичных К1ей-а и К1еИ-Ь D. melanogaster, что обусловлено отсутствием альтернативного сплайсинга первого экзона.
' Ключевые слова: дрозофила; ген DlP1; гомологи гена DlP1; экспрессия гена DlP1.
Поступила в редакцию 17.09.2009 Принята к публикации 10.1 1.2009
ВВЕДЕНИЕ
Транспозиции мобильного элемента gypsy у Drosophila melanogaster контролируются геном flamenco. Мутанты по гену flamenco характеризуются генетической нестабильностью, обусловленной высокой частотой транспозиций этого элемента (Ким и др., 1989). Ген flamenco локализован в районе 20А1-3 Х-хромосомы (Prud'homme et al., 1995). С целью более точного картирования данного гена была получена линия мух P[yellow], несущая инсерцию молекулярной конструкции на основе Р-элемента и проявляющая мутантный фенотип flamenco (Robert et al., 2001). Методом «прогулки по хромосоме» картировать и клонировать ген flamenco не удалось. Установлено, что инсерция в линии P[yellow] находится на расстоянии 1,5 т. п. н. от начала кодирующей последовательности гена DIP1 (Robert et al., 2001). Было сделано предположение, что ген DIP1 или сам является геном flamenco, или принимает участие в контроле транспозиции gypsy вместе с геном flamenco (Нефедова и др., 2007).
Функция гена DIP1 практически не изучена. Показано, что белковый продукт гена DIP1 содержит два домена, связывающих двунитевую РНК (днРНК), а также сигнал ядерной локализации, и накапливается в ядрах неделящихся клеток многих тканей (DeSousa et al., 2003). Известно, что белки, связывающие днРНК, вовлечены в различные клеточные процессы. Одни белки (DICER, NFAR, ADAR, TRBP) локализованы в ядре и участвуют в РНК-интерференции, сплайсинге, экспорте РНК из ядра. Другие (PKR, PACT) расположены в цитоплазме и задействованы в регуляции трансляции, передаче стрессовых сигналов и защите клеток от вирусной инфекции (Saunders, Barber, 2003).
Показано, что ген DIP1 экспрессируется на всех стадиях развития мух. Уровень его экспрессии снижается в процессе деления клеток в разных тка -нях в течение эмбрионального и постэмбрионального развития (Saunders, Barber, 2003; Bondos et al., 2004).
С использованием дрожжевой двугибридной системы было продемонстрировано, что продукт гена DIP1 может взаимодействовать с несколькими белками. Так, он взаимодействует с белком Disco, принимающим участие в контроле развития нервной системы, циркадных ритмов и светочувствительности у D. melanogaster (Lee et al., 1999).
Продукт гена DIP1 взаимодействует с белком Ubx Ib, относящимся к Hox-семейству (Bondos et al., 2004). Hox-белки являются транскрипционными факторами. Функции большинства белков, взаимодействующих с Hox-белками, до сих пор не изучены. Белок Ubx Ib отвечает за развитие 4-го и 5-го сегментов груди, а также влияет на развитие ЦНС, периферической нервной системы, конечностей, средней кишки.
Продукт гена DIP1 может взаимодействовать с рибосомным белком L27a (De Felice et al., 2004). L27a гомологичен белку S6 млекопитающих, вовлеченному в регуляцию клеточного деления.
Наконец, продукт гена DIP1 взаимодействует с белком Su(var)3-9, который является основной метил-трансферазой, специфичной для гетерохроматина, у D. melanogaster (Krauss et al., 2001).
Изложенные выше свойства позволяют предположить, что продукт гена DIP1 является многофункциональным регуляторным белком, который принимает участие в формировании сложных белковых комплексов, контролирующих экспрессию важных генов Drosophila. Не исключено, что он может быть задействован и в процессе регуляции транспозиции мобильного элемента gypsy.
Одним из способов исследования функции гена является его инактивация. Однако DIP1 является регуляторным, и, по-видимому, жизненно важным геном. Таким образом, полное выключение этого гена является трудно выполнимой задачей (DeSousa et al., 2003). По этой причине мы решили исследовать функцию гена DIP1 посредством сравнительного анализа его структуры и экспрессии у других видов Drosophila, находящихся в разной степени филогенетического родства.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Линии дрозофилы и условия культивирования. В работе использовали виды D. melanogaster, D. sechellia, D. mauritiana, D. simulans, D. erecta и D. yakuba из коллекции кафедры генетики МГУ. Все виды дрозофилы культивировали в стандартных для D. melanogaster условиях: при температуре 25 °С на стандартной питательной агаризованной среде. Пересев культур осуществляли через 10—14 дней. Для выделения геномной ДНК брали по 30—50 особей каждого вида. Выделение ДНК из мух осуществляли, как описано ранее (Нефедова и др., 2007).
Выделение тотальной РНК и обратная транскрипция. Выделение тотальной РНК проводили с помощью набора для выделения тотальной РНК «Promega» согласно протоколу фирмы-производителя. Перед постановкой обратной транскрипции пробы (по 5 мкг тотальной РНК) обрабатывали ДНКазой-I («Fermentas») для деградации ДНК. Целостность РНК проверяли электро-форетически по присутствию в геле полос целой рРНК, концентрацию определяли спектрофотометрически.
Амплификацию ДНК- и кДНК-фрагментов гена DIP1 проводили методом ПЦР с использованием праймеров («Евроген») d1 (5’- GAAACAACAAGCCATTT GTCT-3’), d2 (5’-GTTTCCGTTGGCCAGCGAG-3’), r (5’-GTCCACCATGATTCCCAGAT-3’) в амплификато-ре Amply4 («Biokom») в течение 30 циклов по схеме: денатурация 95 °С 30 сек, отжиг праймеров 55 °С 1 мин, синтез 72 °С 2 мин. Для контроля обратной транскрипции проводили ПЦР с праймерами к гену rp49 (5’-CGATCTCGCCGCAGTAAAC-3’ и 5’-ACCATCCGCCCAGCATACA-3’).
Клонирование и секвенирование фрагмента гомолога гена DiP1 D. mauritiana. Клонирование ПЦР-фрагмента осуществляли в векторе pGEM T-easy (“Promega”) по протоколу фирмы-производителя. Клонированные фрагменты ДНК были секвенирова-ны Д. В. Мухой и А. Л. Королевым (Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН) по методу Сэнге-ра с использованием ДНК-секвенатора ABI PRIZM 310 и набора реактивов Big Dye Termination KIT V.3.0 ("PE Applied Biosystems", Foster City CA), согласно рекомендациям фирмы изготовителя.
Компьютерный анализ. Для анализа последовательностей использовали следующие программы: для поиска нуклеотидных последовательностей базу данных последовательностей генома D. melanogaster FlyBase (http://flybase.bio.indiana.edu/), BLAST для поиска гомологии в нуклеотидной последовательности генов против последовательности белка (http:// flybase.org/blast/), ClustаlW для множественного выравнивания последовательностей (http://www.ebi. ac. uk/Tools/clustalw/).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ген DiP1 D. melanogaster кодирует не менее шести продуктов
Ген DIP! D. melanogaster состоит из пяти экзонов. По данным базы FlyBase он кодирует несколько продуктов, образующихся в результате альтернативного сплайсинга пре-мРНК (DeSousa et al., 2003). Последовательность гена содержит сигнал ядерной локализации, который в результате альтернативного сплайсинга может вырезаться. Таким образом, продукты гена функционируют главным в основном в ядре, но есть также форма, которая локализуется в цитоплазме (Bondos et al., 2004). Показано, что продукты гена DIP! могут транслироваться с разных стартовых кодонов (DeSousa et al., 2003; Krauss et al., 2001).
В базе данных FlyBase приведены противоречивые сведения о кодирующих последовательностях (CDS) гена DIP! и их названиях (рис. 1). Фигурируют два названия одного и того же гена: DIP! и Klett. Кроме того, одни и те же CDS называются по-разному, или одинаково называются разные CDS. Известны три варианта кодирующих последовательностей с ATG1: DIP1-C, она же Klett-c (AF17571 1), DIP1-b, она же Klett-d, (AF182154) и DIP1-d (AY217028). Следующие CDS читаются с ATG2, локализованного в альтернативном первом экзоне: Klett-a (AJ250866) и Klett-b (AJ250867). С ATG3 читается форма DIP1-8 (AF175713).
Мы провели анализ альтернативного сплайсинга гена DIP! у D. melanogaster с использованием метода ОТ-ПЦР с парами праймеров d1-r и d2-r. В результа-
Рис. 1. Кодирующие последовательности гена DIP1 D. melanogaster.
Обозначения: ATG — предполагаемые сайты инициации трансляции, NLS — состоящий из двух частей сигнал ядерной локализации, dsRBD — два домена, связывающих двуните-вую РНК. Показана локализация праймеров d1, d2 и r.
те мы подтвердили наличие форм DIPl-c (1109 п.н.), DIPl-b (1063 п.н.), DIPl-d (713 п.н.), Klett-a (1113 п.н.) и Klett-b (1068 п.н.) (рис. 1). Нам не удалось выявить кодирующую последовательность, обозначенную DIP1-n на рисунке 1, которая имела бы альтернативный первый экзон и альтернативный второй (как у DIP1-d). В результате ОТ-ПЦР с праймерами d2 и r мы получили несколько фрагментов, сходных по размеру с формой DIP1-d. Однако эти фрагменты оказались неспецифичными для DIP1, что было подтверждено результатами секвенирования. По-видимому, эта форма специфически образуется только с участием первого экзона. Таким образом, ген DIP1 кодирует не менее 6 продуктов, 5 из которых имеют ядерную локализацию, и 1 продукт (DIP1-d) функционирует в цитоплазме.
Структурная организация гомологов гена DIP1 в геномах D. sechellia, D. mauritiana, D. simulans, D. erecta и D. yakuba
В настоящее время в базе данных FlyBase представлены секвенированные последовательности геномов двенадцати разных видов рода Drosophila. Проведя поиск гена DIP1 в геномах с помощью программы BLAST, мы обнаружили, что гомологи гена DIP1 присутствуют во всех исследованных геномах. Наиболее близкими по структуре к гену DIP1 D. melanogaster оказались, как и следовало ожидать, гомологи, обнаруженные у представителей подгруппы melanogaster (рис. 2).
Рис. 2. Филогения исследованных видов Drosophila (по Jeffs et al., 1994).
Ген DIP1 D. melanogaster во втором интроне содержит инсерцию мобильного генетического элемента НВ, которая занимает практически весь второй интрон гена (Нефедова и др., 2007). НВ представлен в геноме D. melanogaster десятками копий, и практически все они дефектны (Нефедова, Ким, 2007).
Известно, что мобильный элемент, находясь даже в интроне гена, может влиять на его экспрессию (Feschotte, 2008). Мы провели ПЦР-анализ хромосомной ДНК видов подгруппы melanogaster D. sechellia, D. mauritiana, D. simulans, D. erecta и D. yakuba на наличие в гомологах гена DIP1 копии НВ. Копии НВ присутствуют во всех геномах видов подгруппы (данные не приведены), но ни в одной из нуклеотидных последовательностей гомологов гена DIP1 HB нет. Это означает, что этот мобильный элемент ранее перемещался по геному и попал в ген DIP1 уже после отделения D. melanogaster от общего эволюционного древа подгруппы melanogaster.
Размеры амплифицированных фрагментов ДНК гомологов гена DIP1 исследуемых видов Drosophila соответствуют ожидаемым по базе данных FlyBase. По этой причине мы решили не секвенировать фрагменты ДНК гомологов DIP1 видов D. sechellia, D. simulans, D. erecta и D. yakuba. Однако геном D. mauritiana в настоящее время не секвенирован, поэтому амплифи-цированные фрагменты были клонированы и секвени-рованы.
Анализ секвенированных последовательностей показал, что гомолог DIP1 D. mauritianа, также как и гомологи этого гена у D. yakuba, D. sechellia, D. simulans и D. erecta, действительно не содержит следов НВ. Последовательности, гомологичные гену DIP1, обрабатывали с помощью компьютерной программы SoftBerry, которая позволяет выявлять экзоны и интроны. Программа предсказывает наиболее вероятные экзоны: для DIP1 они соответствуют форме DIP1-C (рис. 3).
Рис. 3. Схема строения гена DIP1 и его гомологов у разных видов Drosophila.
Обозначения: выделенные области соответствуют экзонам формы DIP1-c; mel — D. melanogaster, sim D. simulans, sec — D. sechelia, mau — D. mauritiana, yak — D. yakuba, ere — D. erecta.
Рис. 4. Множественное выравнивание участков предполагаемой локализации стартового кодона ATG2 у разных видов дрозофилы. mel — D. melanogaster, sim — D. simulans, sec — D. sechellia, mau — D. mauritiana, yak — D. yakuba, ere — D. erecta. Показана локализация праймера d2. Стрелками обозначены варианты сплайсинга альтернативного первого экзона (Klett-a и Klett-b). Звездочками под выравниванием последовательностей обозначены идентичные нуклеотиды.
В области, гомологичной альтернативному первому экзону, у гомологов гена DIP1 обнаружены изменения. У D. sechellia, D. simulans и D. mauritiana районы, комплементарные альтернативному экзону форм Ще^-а и К1ей-Ь несут делеции (рис. 4). У D. erecta и
D. yakuba организация района совпадает с таковой у D. melanogaster.
Обнаруженные изменения могут влиять на экспрессию гомологов гена DIP1. Так, можно предполагать, что у D. sechellia, D. mauritiana и D. simulans будут от-
Рис. 5. Электрофореграмма амплифицированных фрагментов ДНК и кДНК гена DIP1 видов D. melanogaster (mel), D. sechellia (sec), D. mauritiana (mau), D. simulans (sim), D. erecta (ere) и D. yakuba (yak).
(A) ДНК, амплифицированная с праймерами d1 и r, (Б) кДНК, амплифицированная с праймерами d1 и r,
(B) кДНК, амплифицированная с праймерами к гену rp49, (Г) ДНК, амплифицированная с праймерами d2 и r, (Д) кДНК, амплифицированная с праймерами d2 и r. В качестве маркера размера фрагментов ДНК (дорожка M) использован GeneRuler DNA Ladder Mix (“Fermentas”). Размеры фрагментов маркера указаны с правой стороны рисунка.
сутствовать продукты, D. melanogaster.
гомологичные Klett-a и Klett-b
Экспрессия гомологов гена DiP1 у D. sechellia, D. mauritiana, D. simulans, D. erecta и D. yakuba
Анализ экспрессии методом ОТ-ПЦР проводили на стадии имаго (рис. 5). Подобранные нами для амплификации фрагментов гена DIP1 праймеры (d1, d2 и r) локализованы в районах, практически полностью идентичных у исследуемых видов Drosophila. кДНК, гомологичные DIP1-c/Klett-c, обнаружены в геномах всех исследованных видов. Размер амплифицированных продуктов совпал с теоретически ожидаемым. кДНК, гомологичную DIP 1-b, мы обнаружили в явном виде только у D. mauritiana. Не исключено, что у других видов она также образуется, но мы не можем ее детектировать методом стандартной ОТ-ПЦР. кДНК, гомологичную DIP1-d, которая у D. melanogaster синтезируется в малых количествах, выявить не представляется возможным из-за наличия большого количества неспецифических продуктов.
Анализ экспрессии форм, образующихся с альтернативного первого экзона, однозначно свидетельствует об
экспрессии форм Klett-a/Klett-b у D. erecta. У D. simulans, D. mauritiana и D. sechellia экспрессии с альтернативного первого экзона действительно нет, как и ожидалось по данным биоинформатического анализа. О наличии продукта экспрессии у D. yakuba невозможно говорить однозначно, поскольку контрольная амплификация с хромосомой дает дополнительные неспецифичные продукты.
Таким образом, альтернативные формы транскрип-тов гена DIP1 (Klett-a/Klett-b) отсутствуют у более молодых, чем D. melanogaster, видов дрозофилы, и есть у более древних. По-видимому, эти альтернативные формы, не являясь основными у D. melanogaster, не поддерживались в процессе эволюции отбором, что привело к их утрате более молодыми видами.
Примечательно, что в большинстве случаев альтернативный сплайсинг затрагивает только первый и второй экзоны. При этом функциональный участок — домен, связывающий днРНК, — остается неизменным. Вероятно, разнообразие кодирующих форм гена DIP1 у D. melanogaster носит приспособительный характер: при наличии альтернативного первого экзона активность гена сохраняется даже в том случае, когда «основной» первый экзон инактивирован.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ №№08-04-00693 и 08-04-97050.
Литература
1. Ким А. И., Беляева Е. С., Ларкина З. Г., Асланян М. М., 1989. Генетическая нестабильность и транспозиции мобильного элемента GYPSY (МДГ4) в мутаторной линии Drosophila melanogaster // Генетика. Т. 25. № 10. С. 1747-1756.
2. Нефедова Л. Н., Романова Н. И., Ким А. И., 2007. Особенности структурной организации гена DIP1 в линиях Drosophila melanogaster, мутантных по гену flamenco // Генетика. №. 1. Т. 43. С. 71-78. (Nefedova L. N., Romanova N. I., Kim A. I. Structural organization characteristics of the DIP1 gene in Drosophila melano-gaster strains mutant for the flamenco gene // Russian journal Genetika. 2007. Vol. 43. N 1. P. 56-63.)
3. Bondos S. E., Catanese D. J. Jr., Tan X. X. et al., 2004. Hox transcription factor ultrabithorax Ib physically and genetically interacts with disconnected interacting protein 1, a double-stranded RNA-binding protein // J. Biol. Chem. Vol. 279. N 25. P. 26433-26444.
4. De Felice B., Wilson R. R., Mondola P. et al., 2003. Characterization of DIP1, a novel nuclear protein in Drosophila melanogaster // Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 307. N 2. P. 224-228.
5. DeSousaD., Mukhopadhyay M., Pelka P. et al., 2003. A novel double-stranded RNA-binding protein, disco interacting protein 1 (DIP1), contributes to cell fate decisions during Drosophila development // J. Biol. Chem. Vol. 278. N 39. P. 38040-38050.
6. Feschotte C., 2008. Transposable elements and the evolution of regulatory networks // Nat. Rev. Genet. Vol. 9. N 5. P. 397-405.
7. Jeffs P. S., Holmes E. C., Ashburner M., 1994. The molecular evolution of the alcohol dehydrogenase and alcohol dehydrogenase-related genes in the Drosophila melanogaster species group // Mol. Biol. Evol. Vol. 11. N 2. Р. 287-304.
8. Krauss V., O'Grady M., Hoffmann J. et al., 2001. KLETT, a drosophila chromatin protein with dsRNA
' Информация об авторах
Нефедова Лидия Николаевна — доцент.
E-mail: lidia_nefedova@mail.ru
Коростин Дмитрий Олегович — студент.
Потапова Мария Валерьевна — м. н. с.
E-mail: maria_potapova@mail.ru
Романова Наталия Ивановна — доцент.
Ким Александр Иннокеньтевич — профессор.
E-mail: aikim57@mail.ru.
Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра генетики. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М. В. Ломоносова, д. 1, корп. 12.
binding motifs interacts with the heterochromatin-associated SU(VAR)3-9 protein // 17th Europ. Dros. Res. Conf. Book of abstracts. Scotland. P. 8.
9. Lee K. J., Mukhopadhyay M., Pelka P. et al., 1999. Disconnected: a locus required for neuronal pathway formation in the visual system of Drosophila // Dev. Biol. Vol. 214. P. 385-398.
10. Prud'homme N., Gans M., Terzian C. et al., 1995. Flamenco, a gene controlling the gypsy retrovirus of Drosophila melanogaster // Genetics. Vol. 139. P. 697-711.
11. Robert V., Prud'homme N., Kim A. et al., 2001. Characterization of the flamenco region of the Drosophila melanogaster genome // Genetics. Vol. 158. P. 701-713.
12. Saunders L. R., Barber G. N., 2003. The dsRNA binding protein family: critical roles, diverse cellular functions // FASEB J. Vol. 17. N 9. P. 961-983.
MOLECULAR-GENETIC ANALYSIS of THE DIP1 regulator gene in VARIOUS SPECIES OF DRoSoPHILA
L. N. Nefedova, D. O. Korostin, M. V. Potapova,
N. I. Romanova, A. I. Kim
' SUMMARY: The DIP1 is a regulator gene of D. melanogaster with an unknown function. As a result of mRNA alternative splicing, at least 6 coding sequences are formed (DIP1-c/Klett-c, DIP1-b/ Klett-d, DIP1-d, DIP^, Klett-a, and Klett-b). Structure and expression of DIP1 homologues in various species of the melanogaster subgroup, such as D. melanogaster, D. sechellia, D. mauritiana, D. simulans, D. erecta, and D. yakuba, have been analyzed. In D. sechellia, D. simulans, and D. mauritiana we found alterations, which affected expression of the DIP1 homologues in contrast to D. melanogaster, D. erecta, and D. yakuba. These alterations have to do with splicing of the first alternative exon. It has been demonstrated that DIP1 homologues of D. sechellia, D. simulans and D. mauritiana do not code for Klett-а and Klett b forms.
' KEY WORDS: Drosophila; the DIP1 gene; DIP1 homologues; expression of the DIP1 gene.
Nefedova Lidiya Nikolaevna — associate professor.
E-mail: lidia_nefedova@mail.ru
Korostin Dmitriy Olegovich — student.
Potapova Mariya Valerevna — scientist.
E-mail: maria_potapova@mail.ru.
Romanova Nataliya Ivanovna — associate professor.
Kim Alexandr Innokentevich — professor E-mail: aikim57@mail.ru.
M. V Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology, Department of Genetics. 119991, GSP-2, Moscow, Leninskie Gori, M. V Lomonosov Moscow State University, 1, bld. 12
