CC BY
134
Бюллетень Брянского отделения РБО, 2013. № 1(1). С. 51-55.
Bulletin of Bryansk dpt. of RBS, 2013.
N 1(1). P. 51-55.
БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 582.594.2
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РЕДКИХ ВИДОВ ОРХИДНЫХ БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ
The molecular-genetic identification of rare orchid species of the Bryansk region
© E.E. Костюкова, В.В. Заякин, И.Я. Нам
E.E. Kostyukova, V.V. Zayakin, I.Ya. Nam
ФГБОУВПО «Брянский государственный университет им. акад. И.Г. Петровского», кафедра ботаники.
241036, г. Брянск, ул. Бежицкая, 14. Тел.: +7(4832)666834, e-mail: iyanam@yandex.ru
Аннотация. Метод молекулярно-генетического анализа был апробирован на популяциях редких растений Брянской области. Подобраны температуры отжига для шести ISSR праймеров. Некоторые праймеры обеспечили высокий уровень внутривидового полиморфизма ампликонов (IS3) и могут быть полезны для генетического анализа внутри популяций и на межпопуляционном уровне. Другие праймеры, например IS4, могут быть полезны для изучения межвидовых взаимосвязей.
Ключевые слова: ISSR-PCR, полиморфизм ампликонов, ISSR маркеры, редкие виды, Orchidaceae.
Abstract. The technology of the molecular-genetic identification was tested on populations of rare relict species of the Bryansk region. Annealing temperatures were selected for the six ISSR primers. Some primers provide a high level of intraspecific polymorphism of amplicons (IS3) and can be useful for genetic analysis of populations at the intra and interpopulation level. Other primers, such as IS4, can be useful for the study of inter-species relationships.
Key words: ISSR-PCR, amplicon polymorphism, ISSR markers, rare species, Orchidaceae.
Введение
Важным показателем жизненности редких видов растений является их внутри- и межпо-пуляционное разнообразие. Особый интерес в этом отношении представляет изучение редких видов растений, в частности, орхидных. Молекулярно-генетический анализ с использованием метода ISSR-PCR - один из наиболее современных и информативных подходов для решения этой задачи (Спиридович, 2012).
Основа метода состоит в сравнении полиморфизма длин фрагментов ДНК, находящихся между микросателлитными повторами (Куцев, 2009; Ефимов, 2012). Микросателлиты - от англ. microsatellites, или STR - Short Tandem Repeats, или SSR - Simple Sequence Repeats представляют собой фрагменты ДНК с большим количеством тандемно повторяющихся, идентичных коротких последовательностей из нескольких (от одной до шести) пар нуклеотидов (Животовский и др., 2006).
Расположение микросателлитов может значительно отличаться даже в пределах одного вида, благодаря чему возможно исследование внутривидового полиморфизма. Метод может быть использован для анализа межвидовой и внутривидовой изменчивости, анализа таксономической принадлежности, а также для идентификации видов и популяций (Календарь и др., 2002; Кочиева и др, 2002; Боронникова, 2009).
Генетическое разнообразие межмикросателлитных последовательностей редких видов орхидных в Южном Нечерноземье России не изучено. Задачей первого этапа нашей работы
является подбор праймеров и условий для выявления генетического полиморфизма разного уровня: внутри- и межвидового.
Материалы и методы
Исследования проводились на образцах ДНК, полученных из 16 растений четырех видов орхидных, собранных в природных условиях в 2012 г. на территории Брянской, Калужской и Курской областей: Серка1апЛега longifolia (Ь.) Fritsch, Ер1расй8 ИеПеЬоппе (Ь.) Crantz., Оооёуега герет (Ь.) К Бг., РШапЛега bifolia Ь. (табл. 1). Все виды занесены в Красную книгу Брянской области (2004). При сборе растения не уничтожались, собирались лишь небольшие участки ткани листа с живых растений.
Таблица 1
Анализируемые представители семейства орхидных
Номер образца Вид Место сбора Дата сбора
16 Platanthera bifolia Курская обл. Железногорский р-н. 7.VII.2012
4 Platanthera bifolia Калужская обл. Кондровский р-н. Галкинское лесн-во. 24.VIII.2012
6 Platanthera bifolia Брянская обл., Брянский район. Пос. Теменичи. 28.VII.2012
10 Platanthera bifolia Брянская обл. Суземский р-н. 1.VI.2012
3 Platanthera bifolia Брянская область. Карачевский р-н. 12.VII.2012
17 Epipactis helleborine Брянская обл. Карачевский р-н. 19.IX.2012
18 Epipactis helleborine Брянская обл. Брянский р-н. Пос. Добрунь. 25.VII.2012
26 Goodyera repens Калужская обл. Кондровский р-н. Галкинское лесн-во. 24.VIII.2012
29 Cephalanthera longifolia Брянская обл. Дятьковский р-н. Фокинское лесн-во. 27.VII.2012
Из образцов ткани выделяли ДНК с помощью СТАВ-буфера (Иванников и др., 2011). Для амплификации использовали прибор «Терцик» фирмы «ДНК-технология». ДНК денатурировали при 94°С в течение 5 минут, а затем проводили 35 циклов амплификации в следующем режиме: 94°С - 45 сек., отжиг праймеров - 45 сек., элонгация 72°С - 1,30 мин. Конечный этап синтеза проводили при 72°С в течение 7 мин. Температуры плавления, последовательности нуклеотидов и установленные экспериментально оптимальные температуры отжига праймеров указаны в табл. 2.
Таблица 2
Последовательность праймеров и температура отжига
Праймер Последовательность праймера, 5’-3’ Расчетная температура плавления Оптимальная температура отжига, °С
IS1 ga-gag-aga-gag-aga-g(y)g 47,9 48,0
IS2 aca-cac-aca-cac-aca-cg 45,7 52,0
IS3 gag-aga-gag-aga-gag-ac 45,7 44,5
IS4 cac-aca-cac-aca-cac-aa 43,3 50,0
IS5 cac-aca-cac-aca-ca(r)c 43,3 46,0
IS6 aga-gag-aga-gag-ag(y)t 40,8 52,0
Электрофорез продуктов амплификации проводили в 2%-ном агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. После электрофоретического разделения продукты амплификации анализировали с использованием системы GelDocXR (BioRad, США) и программы для обработки электрофореграмм Quantity One. Для определения размера фрагментов ДНК использовали маркер M27 (СибЭнзим, Москва) (рис. 1-3).
ISSR-праймеры подбирали путем анализа литературных данных по эффективности их использования на других видах растений. Для проведения ISSR-PCR на исследуемых видах 52
было использовано 6 праймеров: IS1, IS2, IS3, IS4, IS5, IS6. Расчет температуры плавления проводился с помощью программы Vector NTI.
Результаты и обсуждение
На начальном этапе работы была подобрана температура отжига для каждого из праймеров (табл. 2). В качестве исходных данных служила температура плавления, рассчитанная с помощью программы Vector NTI. Температура отжига подбиралась эмпирическим путем и варьировалась в пределах от 40°C до 56°C в зависимости от интенсивности и количества ампликонов.
Использование различных праймеров позволило идентифицировать от 6 до 13 ампликонов с длиной от 130 до 1100 пар нуклеотидов для каждого образца (рис. 1-3). Наибольшее количество ампликонов было получено с использованием праймеров IS5(13), IS3(12) и IS2(12) (рис. 1). Наиболее четкие ампликоны получены с праймером IS3.
Рис. 1. Спектры ампликонов 188К-РСК для образца РЫапЛвта Ы/оНа, полученные с разными прймерами.
Всего на образцах Р1а(апЛвга Ы/оНа с использованием праймера 183 был амплифицирован 21 фрагмент, 18 (86 %) из которых были полиморфными (рис. 2).
М27
Номер образца
16
6
1O
1OOO
9OO
800
700
6OO
500
4OO
3OO
2OO
4
3
Рис. 2. Спектры ампликонов ISSR-PCR для разных образцов Platanthera bifolia, полученные с праймером IS3.
Разные виды семейства орхидных дают разный набор полос, что позволяет оценить уровень межвидового полиморфизма (рис. 3).
М27
Номер образца
18
17
26
29
1OOO
9OO
8OO
7OO
6OO
5OO
4OO
300
2OO
4
6
Рис. 3. Спектры ампликонов ISSR-PCR для разных видов орхидных, полученные с праймером IS3.
Обозначения: 4, 6 - Platanthera bifolia; 18, 17 - Epipactis helleborine;
26 - Goodyera repens; 29 - Cephalanthera longifolia.
Лишь одна полоса присутствовала в спектрах продуктов амплификации всех исследуемых ДНК орхидных, в то время как другие фрагменты ДНК проявляют полиморфизм. В спектрах амплификации с использованием других праймеров уровень полиморфизма сильно различается. Например, с праймером IS4 в спектрах для Platanthera bifolia из 13 полос только 3 являются полиморфными. При этом уровень полиморфизма ампликонов, полученных для этого праймера, у разных видов достаточно высокий, хотя для них появляются отдельные общие полосы. Поэтому такие праймеры могут быть полезны для филогенетических исследований.
Заключение
Использованный метод изучения генетического полиморфизма позволяет обнаружить полиморфизм как на межвидовом, так и на внутривидовом уровнях.
Наилучшие результаты амплификации получены с применением маркеров IS3 и IS4. Праймер IS3, дает большое количество полиморфных полос и может быть использован для изучения внутривидового полиморфизма. Полиморфизм ампликонов с праймером IS4 более выражен на уровне видов, что позволяет его использовать для изучения межвидовых взаимосвязей.
Данная методика будет использована для изучения генетического полиморфизма цено-популяций редких видов орхидных Южного Нечерноземья России.
Список литературы
Боронникова С.В. Генетическая паспортизация популяций редких видов растений рода Adonis с использованием ISSR- и IRAP - маркеров. // Известия ТСХА. 2009. Вып. 1. С. 82-88.
Ефимов П.Г. Исследование генетического полиморфизма Dactylorhiza baltica, D. fuchsii и D. incarnata (Orchi-daceae) из Северо-Запада европейской части России методом ISSR // Ботан. журн. 2012. Т. 97. № 6. С. 751-760.
Иванников Р.В., Иванникова Н.С., Заякин В.В., Нам И.Я. Оптимизация методов выделения ДНК культивируемых in vitro видов орхидных для исследования их самоклональной вариабельности // Вестник Брянского государственного университета. 2011. N° 4. С. 141-145.
Календарь Р.Н., Глазко В.И. Типы молекулярных маркеров и их применение // Физиология и биохимия культурных растений. 2002. Т. 34. № 4. С. 279-296.
КочиеваЕ.З., РыжоваН.Н., Храпалова И.А., Пухальский В.А. Определение генетического полиморфизма и фи-логененических связей у представителей рода Lycopersion (Tourn) Mill методом маркирования межмикросателит-ных последовательностей (ISSR) // Генетика. 2002. Т. 38. № 8. С. 1133-1142.
Красная книга Брянской области. Растения. Грибы. Брянск: ЗАО «Изд-во «Читай-город», 2004. 272 с.
КуцевМ.Г. Фрагментный анализ ДНК растений: RAPD, DAF, ISSR. Барнаул, 2009. 164 с.
Спиридович Е.В., Молканова О.И., Коротков О.И., Власова А.Б., Юхимук А.Н., Решетников В.Н. Молекулярногенетические методы в сохранении и изучении генофонда ботанических коллекций // Интродукция, сохранение и использование биологического разнообразия мировой флоры. Мат. междунар. конф., посвященной 80-летию Центрального ботанического сада Национальной академии наук Беларуси. Минск, 2012. С. 463-467.
