CC BY
22
ОБЗОРЫ
DOI: 10.23868/202209001 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КАЛЬПАИНОПАТИИ
Л.А. Мкртчян1, 2, Я.С. Слесаренко2, 3, И.А. Яковлев2, 3, С.Н. Бардаков4, Р.В. Деев1-3
1 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
2 ООО «Генотаргет» Москва, Россия
3 ПАО «Институт стволовых клеток человека», Москва, Россия
4 Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия
MOLECULAR AND GENETIC FEATURES OF CALPAINOPATHY
L.A. Mkrtchyan1, 2, Y.S. Slesarenko2, 3, I.A. Yakovlev2, 3, S.N. Bardakov4, R.V. Deev1-3
1I.I. Mechnikov North-Western State Medical University, St. Petersburg, Russia
2 LLC "Genotarget" Moscow, Russia
3 "Human Stem Cells Institute", Moscow, Russia
4 S.M. Kirov Military Medical Academy, St. Petersburg, Russia
Поступила: 01.08.2022 Принята к печати: 15.09.2022 Опубликована on-line: 20.09.2022
e-mail: lilitmkrtch@Yandex.ru
Кальпаинопатия — наиболее распространенная форма по-ясно-конечностной прогрессирующей мышечной дистрофии, которая встречается, в среднем, в 1 случае на 15 000-42 700 населения. В Российской Федерации проведено недостаточное количество исследований, изучающих распространенность каль-паинопатии среди пациентов с поясно-конечностными прогрессирующими мышечными дистрофиями, но по имеющимся данным, приблизительно в 43% случаев заболевание связано с мутациями гена CAPN3. Молекулярно-генетический анализ является основным методом, позволяющим достоверно поставить диагноз пациенту. Исследования свидетельствуют о многих патогенных мутациях, вызывающих кальпаинопатию с соответствующими фенотипами, однако, довольно трудно установить четкие корреляции между генотипом и фенотипом из-за высокой вариабельности симптомов и тяжести, даже среди пациентов с одними и теми же мутациями гена CAPN3. В настоящее время не существует эффективных этиотропных методов лечения поясно-конечност-ных прогрессирующих мышечных дистрофий, но разрабатываются новые технологии для улучшения состояния и качества жизни пациентов с кальпаинопатией. В обзоре собраны данные исследований о распространенности кальпаинопатии в различных странах; описаны основные молекулярно-генетические особенности гена CAPN3 и белка кальпаина-3. Проанализированные данные в дальнейшем позволят разработать варианты лечения пациентов с поясно-конечностными миодистрофиями.
Ключевые слова: поясно-конечностная миодистрофия 2А типа (R1 типа), мутация, генотип, молекулярная биология, кальпаинопатия, CAPN3.
Calpainopathy is the most common form of limb-girdle muscular dystrophy, prevalence in the population is approximately 1 in 15,000-42,700 individuals. In the Russian Federation, there is an insufficient number of studies, which researched prevalence of calpainopathy among patients with limb-girdle muscular dystrophy, but according to available data, approximately in 43% of cases the disease is associated with mutations of the CAPN3 gene. Molecular genetic analysis is the main method for diagnosing these patients. Studies indicate many pathogenic mutations that cause calpainopathy with corresponding phenotypes, however, it is quite difficult to establish clear correlations between genotype and phenotype due to the high variability of symptoms and severity, even among patients with the same CAPN3 gene mutations. Currently, there is no effective etiotropic treatment for limb-girdle muscular dystrophy, but new technologies are developing to improve patients' condition and quality of life. This research collects data from various studies on the prevalence of calpainopathy in different countries and the main molecular genetic features of the CAPN3 gene and calpain-3 protein, which will further allow the development of possible treatment options for patients with limb-girdle muscular dystrophy.
Keywords: limb-girdle muscular dystrophy type 2A (type R1] mutation, genotype, molecular biology, calpainoraty, CAPN3.
Введение
Поясно-конечностные прогрессирующие мышечные дистрофии (ПКМД) представляют собой группу гетерогенных полиморфных заболеваний, характеризующихся прогрессирующей мышечной слабостью, атрофией скелетных мышц с преимущественным поражением плечевого и тазового поясов, снижением сухожильных рефлексов, повышением уровня креатинфосфокиназы в крови в крови в результате атрофии мышц [1].
Кальпаинопатия — наиболее распространенная форма ПКМД [2, 3-6], которая встречается, в среднем, в 1 случае на 15 000-42 700 населения в зависимости от географического региона [3, 6]. В Российской Федерации проведено недостаточное количество исследований, направленных на оценку распространенности кальпаинопатии среди пациентов с ПКМД, но по имеющимся данным, в среднем приблизительно в 43% случаев заболевание связано именно с мутациями гена САРМ3 [4, 5, 7, 8]. В европейской популяции, включая
пациентов Российской Федерации, выделяют 2 «мажорные» мутации в гене САРМЭ: с.550с1е1А и с.598-612с1е115 (до 35% в популяции Российской Федерации) [4].
Молекулярно-генетический анализ с выявлением мутации в гене САР№ является основным методом, позволяющим достоверно поставить диагноз пациенту [3, 7, 8].
В настоящее время не существует эффективных этиотропных методов лечения поясно-конечностных прогрессирующих мышечных дистрофий. Однако, разрабатываются новые технологии для улучшения состояния и качества жизни пациентов с различными формами ПКМД, в том числе и с кальпаинопатией [6].
1. Определение поясно-конечностных
мышечных дистрофий
Наследственные миодистрофии характеризуются первичным поражением скелетной мускулатуры. К ним относятся врождённые мышечные дистрофии,
Рис. 1. Доля кальпаинопатии в структуре ПКМД в зависимости от исследуемого региона на основании данных опубликованных исследований
а 90
^ с 80
г ч 70
^ о 60
г г 50
т а с 40
о н 30
г
а с 20
.а с 10
а
* 0
к
<3 а У
Доля кальпаинопатии среди ПКМД в различных странах мира
81
42 43
22 24
8 11 11 11 13 14 16 17
111111111
/ сг
Страна
включающие различные формы ПКМД, врождённые структурные миопатии, метаболические миопатии и прогрессирующие мышечные дистрофии [1, 9].
Несмотря на то, что все состояния, вызванные дефектами белков-кальпаинов, называются кальпаино-патиями, основное внимание уделяется патологическим состояниям, вызванным нарушениями функции белка кальпаина-3 (ПКМД П1) [2, 10]. Указанный вариант кальпаинопатии характеризуется симметричной и прогрессирующей слабостью проксимальных мышц конечностей и пояса. В основном, мышечная слабость возникает у пациентов в возрасте от 12 до 30 лет. Фенотип демонстрирует внутрисемейную и межсемейную изменчивость клинических проявлений в диапазоне от легкой до тяжелой степени [11].
2. Эпидемиология заболевания
Кальпаинопатия является наиболее распространенной формой ПКМД. Встречается, в среднем, у 1 человека на 15 000-42 700 населения в зависимости от географического региона [3, 6]. Количество исследуемых случаев в разных регионах сильно отличается, что не позволяет точно сравнить распространенность заболевания в популяциях различных стран. Однако, по имеющимся данным можно представить долю кальпа-инопатии в структуре ПКМД [1]. Данные по кальпаинопатии в структуре ПКМД в различных странах, основанные на молекулярно-генетических исследованиях пациентов представлены на графике (рис. 1).
По данным исследований 76 пациентов с ПКМД в Австралии лишь у 8% пациентов подтверждена каль-паинопатия [12]. Среди 35 пациентов из Республики Кореи и 212 пациентов из Мексики с клинико-лабораторными признаками ПКМД мутации в гене САРЫЗ были выявлены в 11% случаев [13, 14]. Разные исследования пациентов, наблюдаемых в лечебных учреждениях США, с выборками от 55 до 289 человек выявили от 4 до 12% (в среднем также 11%) случаев кальпаинопатии в популяции [15, 16]. Среди 119 пациентов в Дании с диагнозом ПКМД в 13% случаях с помощью молекулярно-генетических исследований выявлены мутации в гене САРЫЗ [17]. По данным различных исследований, проведенных в Германии в общей сложности у 258 пациентов с ПКМД у 8-33% пациентов (в среднем в 14% случаев) подтверждена
кальпаинопатия [18, 19]. В Саудовской Аравии исследование проводилось среди 50 пациентов, у 8 из них (16% случаев) подтвержден диагноз кальпаинопа-тия [20]. Среди 68 пациентов из Китая, включенных в исследование по распространенности различных типов ПКМД в 17% случаев была выявлена кальпаино-патия [21]. По результатам исследования, проведенного в Нидерландах среди 105 пациентов с ПКМД в 22% случаев причиной заболевания, являлась мутация гена САРЫЗ [22]. Среди пациентов, исследованных в Иране (45 человек с ПКМД) кальпаинопатия была установлена в 24% случаев [23]. В Италии исследование проводилось среди 370 пациентов, у 25% из них подтвержден диагноз кальпаинопатии [24]. В северной части Англии в исследование распространенности различных типов ПКМД были включены 49 пациентов, из них в 26% случаев была выявлена кальпаинопатия [25]. По данным различных исследований, проведенных в Бразилии, среди 75-216 пациентов с диагнозом ПКМД кальпаи-нопатия подтверждается в среднем в 29% случаев [26, 27]. Менее масштабные исследования были проведены в Турции. Среди 33 пациентов с ПКМД мутации в гене САр|\13 были выявлены в 30% случаев [28]. Такая же распространенность кальпаинопатии выявлена в результате исследований, проведенных в Индии (в среднем 30%) при молекулярно-генетическом исследовании различных групп пациентов с ПКМД (от 171 до 207 пациентов) [29, 30]. По данным исследований, проведенных в Чехии кальпаинопатия встречается у 42% пациентов с ПКМД (исследование проведено среди 48 пациентов) [31]. По данным исследований 42 пациентов с ПКМД в Болгарии у 42% пациентов подтверждена кальпаинопатия [32]. В России исследований по изучению распространенности каль-паинопатии среди пациентов с ПКМД немного. Однако, по имеющимся данным, в 15-70% случаев (в среднем 43%) среди пациентов с ПКМД, заболевание связано с мутациями гена САР1\13 [4, 5, 7, 8]. В Польше распространенность кальпаинопатии среди 76 пациентов с ПКМД по данным проведенного в 2015 г. исследования составляет 81 %, что, скорее всего, связано с особенностями выборки пациентов [33].
Таким образом, изучение распространенности кальпаинопатии и вариантов наиболее распространенных мутаций в гене САРЫЗ на текущий момент остается актуальной проблемой, требующей длительных
и масштабных исследований с применением молеку-лярно-генетических методов подтверждения диагноза у пациентов с клиническими проявлениями ПКМД.
3. Генетические основы
кальпаинопатии. Ген САРЫ3
В 1990 г. было установлено, что ген САРШ у человека находится в 15 хромосоме. Экспрессия гена САРМ3 впервые была идентифицирована в скелетных мышцах млекопитающих. На момент этих исследований нозерн-блоттинг не был достаточно чувствительным, чтобы обнаружить мРНК САРМ3 в других тканях. Однако в дальнейшем повышение чувствительности и специфичности методов диагностики позволили выявить присутствие мРНК САР№ в большинстве тканей. У млекопитающих САР№ экспрессируется гораздо сильнее в скелетных мышцах, особенно в быстрых волокнах (тип II) [2].
Ген человека САРЫ3 состоит из 24 экзонов и охватывает геномную область размером 52 817 п. н. (50 кб). Определяется транскриптом объемом 3315 нуклеоти-дов (3,5 кб) на основании которого формируется белок массой 94 кД — кальпаин-3. Белок является представителем суперсемейства кальпаинов, основной функцией которых является обработка внутриклеточных киназ, фосфатаз, фосфолипаз, факторов транскрипции и цито-скелетных белков [27].
Опубликованные работы свидетельствуют о многих патогенных и вероятно патогенных мутациях, вызывающих ПКМД П1 с соответствующими фенотипами, в том числе 185 миссенс-мутаций, 52 нонсенс-мутации, 2 точечные мутации (промотера), 112 мутаций со сдвигом рамки считывания, 56 мутаций, затрагивающих сайты сплайсинга, 1 4 мутаций внутри рамки считывания [34]. Однако четкие корреляции между генотипом и фенотипом установить трудно из-за высокой вариабельности симптомов и тяжести, даже среди пациентов с одними и теми же мутациями гена [2].
В европейской популяции, включая пациентов Российской Федерации, выделяют два наиболее распространенных варианта мутаций в гене САРМ3: с.550с1е1А и с.598-612с1е115 (до 35% в популяции Российской Федерации) [4]. Вариант с.550с1е1А относится к мутациям со сдвигом рамки считывания, так как в этом случае происходит делеция с инсерцией нуклеотидов не кратная трем, что приводит к нарушению считывания последовательности нуклеотидов и формированию неверной последовательности нуклеотидов в мРНК, а затем и к неправильному формированию последовательности аминокислот белка. Вариант с.598-612с1е115 относится к мутациям с делецией части гена, в результате чего также формируется неверная последовательность нуклеотидов в мРНК и неправильное формированию последовательности аминокислот белка [35].
Около 45% выявленных мутаций приводят к отсутствию белка, что указывает (вместе с рецессивным
типом наследования) на то, что ПКМД R1 обусловлен дефицитом функции кальпаина-3. С другой стороны, анализ биопсий мышц показывает, что у 20-30% пациентов сохраняется нормальное количество белка при вестерн-блоттинге. Эти пациенты обычно имеют миссенс-мутации, приводящие к нарушению аутоката-литической активности, что указывает на нарушение функции кальпаина-3 и предполагается, что патогенез ПКМД R1 связан с потерей протеолитической активности белка. С другой стороны, клинический фенотип при миссенс-мутациях трудно предсказуем, поскольку они связаны с различной тяжестью заболевания и количеством белка. Однако наличие двух аллелей с нонсенс мутациями считается негативным прогностическим фактором, в то время как компаунд-гете-розиготы и носители миссенс-мутаций, по-видимому, имеют менее выраженные клинические проявления заболевания. В 2011 г. J. Vissing с соавт. была описана доминантная форма кальпаинопатии в связи с гетерозиготной делецией 21 пары оснований в CAPN3 [36].
4. Белок кальпаин. Основные характеристики
Согласно исследованию, проведенному в 2016 г., геном человека содержит 1 6 генов, кодирующих 16 видов белков кальпаинов [2].
Физиологическая значимость кальпаинов долгое время была неизвестна, отчасти потому, что каждый вид кальпаинов довольно специфичен в своей регуляторной функции.
Усовершенствованные молекулярно-генетические методы выявили причинно-следственные связи между дефицитом кальпаина и дисфункциями тканей и органов. Эти заболевания с дефицитом кальпаина — кальпаинопатии, являются доказательством физиологической важности системы кальпаинов.
Кальпаины отличаются от других основных внутриклеточных протеолитических компонентов, таких как протеасомы и лизосомальные протеазы, функционирующие при аутофагии. Последние устраняют и перерабатывают свои субстраты путем деградации. Кальпаины уникальны тем, что они действуют путем протеолити-ческого процессинга и непосредственно распознают субстраты, в то время как протеасомы и аутофагия полагаются на другие системы — убиквитилирование и образование аутофагосом соответственно — для маркировки своих субстратов.
Кальпаины представляют собой гетеродимеры, состоящие из инвариантной малой субъединицы и вариабельных больших субъединиц. Большая субъединица обладает цистеиновым протеазным доменом, и обе субъединицы обладают кальций-связывающими доменами.
Девять классических кальпаинов человека — кальпа-ины 1-3, 8, 9 и 11-14 имеют сильное сходство последовательностей, что, однако, не обязательно указывает на их биохимическое или функциональное подобие [35].
Таблица 1. Основные функции и локализация различных видов кальпаинов (по данным [34] с изм.)
Тип Функция Орган, клетки (основная локализация)
Кальпаин 1 Протеолиз субстратов, участвующих Скелетные мышцы (мышечные волокна), ЖКТ
в ремоделировании цитоскелета и передаче (пищевод — эпителиальные и гладкомышечные сигналов. клетки, фибробласты), сердце (фибробласты,
Совместно с кальпаином 2 регулирует апоптоз- кардиомиоциты), легкие (эндотелий сосудов, индуцирующий фактор (А1П-зависимый апоптоз альвеолоциты 1 и 2 типа, фибробласты),
предстательная железа (лейомиоциты, эпителиальные клетки)
Тип
Функция
Орган, клетки (основная локализация)
Кальпаин 2 Протеолиз субстратов, участвующих
в ремоделировании цитоскелета и передаче сигналов. Отвечает за внутриклеточную переработку миоцилина (мышечная ткань цилиарного тела) в просвете эндоплазматического ретикулума Совместно с кальпаином 1 регулирует апоптоз-индуцирующий фактор (А1П-зависимый апоптоз
Кальпаин 3 Протеолиз субстратов, участвующих
в ремоделировании цитоскелета и передаче сигналов.
Дифференцировка мышечных волокон, их регенерация и апоптоз
Кальпаин 5 Протеолиз субстратов, участвующих в ремоде-лировании цитоскелета и передаче сигналов. По-видимому, не обладает протеазной активностью
Кальпаин 6 Стабилизирующий микротрубочки белок, который может быть вовлечен в регуляцию динамики микротрубочек и организации цитоскелета. Может действовать как регулятор активности ПАС1 посредством взаимодействия с АПН6ЕР2 для контроля образования пластинок и подвижности клеток. По-видимому, не обладает протеазной активностью
Кальпаин 7 Функция белка, кодируемого этим геном,
неизвестна. У мышей был обнаружен аналог, но он, по-видимому, отличается от других членов семейства. Считается, что мышиный аналог не зависит от кальция и обладает протеазной активностью
Кальпаин 8 Участвует в мембранном транспорте в клетках слизистой оболочки желудка и может активировать мембранный транспорт клеток слизи посредством взаимодействия с белком оболочки. Протеолитически расщепляет бета-субъединицу коатомерного комплекса
Кальпаин 9 Белок, кодируемый этим геном,
экспрессируется преимущественно в желудке и тонком кишечнике и может выполнять специализированные функции в пищеварительном тракте
Кальпаин 10 Катализирует ограниченный протеолиз
субстратов, участвующих в ремоделировании цитоскелета и передаче сигналов. Может играть определенную роль в стимулированном инсулином поглощении глюкозы
Кальпаин 11 Может играть функциональную роль
в сперматогенезе и в регуляции кальций-зависимой передачи сигналов во время мейоза
Кальпаин 12 Протеолиз субстратов, участвующих
в ремоделировании цитоскелета и передаче сигналов
Кальпаин 13 Протеолиз субстратов, участвующих в ремоделировании цитоскелета и передаче сигналов. Может выполнять специализированные функции в пищеварительном тракте
Скелетные мышцы (мышечные волокна), ЖКТ (пищевод — эпителиальные и гладкомышечные клетки, фибробласты), сердце (фибробласты, кардиомиоциты, эндотелий коронарных сосудов), легкие (эндотелий сосудов, альвеолоциты 1 и 2 типа, фибробласты)
Скелетные мышцы (мышечные волокна, фибробласты), ЖКТ (пищевод — эпителиальные и гладкомышечные клетки, фибробласты), сердце (фибробласты, кардиомиоциты, эндотелий коронарных сосудов), легкие (эндотелий сосудов, альвеолоциты 1 и 2 типа, фибробласты)
ЖКТ (желудок — мукоциты слизистой оболочки желудка, тонкая кишка — энтероциты), сетчатка (фоторецепторные клетки)
Сердце (фибробласты, кардиомиоциты), ЖКТ (пищевод — эпителиальные и гладкомышечные клетки), молочная железа (фибробласты), легкие (фибробласты), предстательная железа (лейомиоциты, эпителиальные клетки)
РНК есть во многих тканях, наличие белка в тканях не подтверждено
Молочная железа (эндотелий сосудов), скелетные мышцы (мышечные волокна), ЖКТ (пищевод — эпителиальные и гладкомышечные клетки), сердце (фибробласты, кардиомиоциты), легкие (эндотелий сосудов, альвеолоциты), предстательная железа (лейомиоциты, эпителиальные клетки)
ЖКТ (пищевод — эпителиальные клетки, желудок — железистые клетки желудка), легкие (альвеолоциты 1 и 2 типа), скелетные мышцы (мышечные волокна), предстательная железа (эпителиальные клетки)
Селезенка (клетки пульпы: макрофаги и плазмоциты), желудок (железистые клетки желудка)
Яички (сперматиды, сперматоциты)
ЖКТ (пищевод — эпителиальные клетки), сердце (фибробласты, эндотелий сосудов), скелетные мышцы (мышечные волокна), предстательная железа (эпителиальные клетки)
ЖКТ (пищевод — эпителиальные клетки, эндотелий сосудов, желудок — добавочные клетки желудка, тонкая кишка — энтероциты), предстательная железа (эпителиальные клетки), легкие (альвеолоциты 1 и 2 типа), сердце (кардиомиоциты).
Тип
Функция
Орган, клетки (основная локализация)
Кальпаин 14 Участвует в различных клеточных процессах, включая апоптоз, деление клеток, модуляцию интегрин-цитоскелетных взаимодействий и синаптическую пластичность
Кальпаин 15 Может функционировать как фактор
транскрипции, РНК-связывающий белок или в белок-белковых взаимодействиях во время развития зрительного анализатора
Кальпаин 16 Может играть функциональную роль
в сперматогенезе и в регуляции кальций-зависимой передачи сигналов во время мейоза
ЖКТ (пищевод — эпителиальные клетки, миофибробласты), сердце (кардиомиоциты), скелетные мышцы (мышечные волокна), легкие (альвеолярные макрофаги), предстательная железа (эпителиальные клетки)
Множество тканей (преимущественно в митохондриях)
Яички (подробной информации по типу клеток нет, предположительно сперматиды, сперматоциты)
Кальпаин-3 является членом суперсемейства кальпа-инов, которые обрабатывают различные внутриклеточные киназы, фосфатазы, фосфолипазы, факторы транскрипции и цитоскелетные белки для модуляции их активности [27].
Структура кальпаина-3 довольно сложна. Кальпаин-3 является многодоменным белком, каждый домен которого имеет отдельную функцию:
• домен I выполняет регулирующую фуекцию;
• домен II является протеолитическим модулем (наиболее частые варианты мутаций в популяции c.550delA и c.598-612del15 связаны с этим доменом] [38];
• домен III — обеспечивает сопряжение каталитического домена II и Са2+-связывающего домена IV, способствует усилению Са2+-индуцированных кон-формационных изменений, а также ассоциации кальпаинов с фосфолипидами мембран;
• домен IV в кальпаине-3 связывает четвертый ион Са2+. В других кальпаинах, которые были проанализированы, часть этого домена используется для образования димеров, а в кальпаинах 5 и 6 видов данный домен отсутствует.
Функция кальпаина-3 до конца не изучена. Исследователи предполагают, что он может расщеплять поврежденные белки на более короткие участки, чтобы облегчить их удаление из саркомеров.
Субстратами, расщепляемыми кальпаинами, в частности, являются белки, ответственные за передачу сигналов (родопсин, протеинкиназы А и С], а также белки цитоскелета (миофибриллярные белки — актин, миозин, парамиозин, тропомиозин и др., и белки нейрофиламен-тов]. Известно, что кальпаин-3 при этом расщепляет белки на короткие полипептиды, а не на отдельные аминокислоты. Следовательно, следует предположить, что кальпаин-3 непосредственно принимает участие в этих процессах, регулирует механизмы саркомерного ремоделирования и обеспечивает стабильность цитоске-лета. Многочисленные исследования с использованием клеточных культур, экспериментальных моделей in vivo и биопсии мышц пациентов свидетельствуют об участии продукта гена CAPN3 в дифференцировке мышечных волокон и их регенерации, а также в развитии апоптоза.
Особенностью кальпаина-3 также является его чрезвычайно быстрая, полная и, по всей видимости, Са2+-независимая самодеградация [3].
4.1. Функции кальпаина в скелетных
мышцах человека
Кальпаин — это «регуляторная протеаза», которая требует Са2+ для функционирования в саркомерах.
Он обрабатывает субстраты посредством ограниченного и специфического протеолиза, чтобы облегчить передачу сигнала [39]. Первой стадией активации кальпаина является его внутримолекулярная активация при связывании Са2+ (или, в случае кальпаина-3, также 1\а+). Эта внутримолекулярная активация позволяет кальпаинам гидролизовать пептидные связи. Второй стадией активации кальпаина является внемолекулярная активация, которая позволяет кальпаинам контактировать с субстратами. Вопрос о том, требуется ли протеолиз для внемолекулярной активации обычных кальпаинов, все еще остается спорным.
Большая часть кальпаина-3 в скелетных мышцах человека (87%) плотно связана с миофибриллярным комплексом, состоящим, в основном, из актина, миозина, титина и белков 7-диска. Кальпаин-3, вероятно, связан с линией 1\12-А белка титина. В ядрах обнаружена лишь небольшая доля (8%) кальпаина-3. Большая часть ядерного кальпаина-3 находится в аутолизированном состоянии. Существует очень мало (около 5%) цитозоль-ного кальпаина-3 [40].
Изображение системы белков, включающих каль-паин-3 представлено на схеме (рис. 2).
Избирательное фосфорилирование может увеличивать сродство кальпаина-3 к миофибриллам, вызывая накопление в них этого белка, что в свою очередь, по предположениям некоторых исследователей, может стимулировать пошаговую передачу сигналов [2].
Таким образом, кальпаин-3 обрабатывает субстраты посредством ограниченного и специфического про-теолиза, обеспечивая передачу сигнала и работу титина в миофибриллярном комплексе.
4.2. Внемышечные функции кальпаина
По данным некоторых исследований, каль-паин-3 выполняет важную функцию в развитии опухолевых клеток и метастазировании [43]. Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить функции кальпаина и определить, способствует ли он росту опухоли или подавляет его, независимо от типа клетки и от того, вовлечены ли в этот процесс другие виды кальпаинов.
5. Патоморфогенез кальпаинопатии
В настоящее время достоверно неизвестны основные механизмы патоморфогенеза кальпаино-патии [44]. Проведенные исследования показывают, что кальпаин-3 может выполнять значимую функцию в регуляции факторов транскрипции, контролирующих гены выживания и апоптоза, или в регуляции деградации
Убиквитиновая Аутофагосома
система
V_
Рис. 2. Схема взаимодействия кальпаина-3 с миофибриллярным комплексом [41, 42, с изм.]
цитоскелетных или миофибриллярных белков (ремоде-лировании саркомеров) [44].
Хотя мутации, которые инактивируют СЛРМБ, вызывают кальпаинопатию, не все мутации приводят к потере протеолитической активности белка. Существует пять дефектных состояний кальпаина-3:
• белок полностью неактивен (потеря способности к активации), из-за утраты способности к внутримолекулярной активации;
• неактивен в отношении протеолиза субстрата из-за потери способности к внемолекулярной активации;
• неактивен из-за чрезмерно быстрой аутолитиче-ской активности;
• неактивен из-за неправильного распознавания субстрата;
• дефектный в непротеолитических функциях, но обладающий протеолитической активностью [2].
5.1. Мышечные эффекты
Некоторые работы демонстрируют наличие функциональных взаимосвязей между протеолитическим белком кальпаином-3 и другими внутриклеточными белками. Так, показано, что кальпаин-3 связан с трансмембранным белком дисферлином, обеспечивающим стабильность, целостность сарколеммы и её репарацию [45].
Кроме того, имеется множество доказательств связи кальпаина-3 с белком титином — гигантским белком цитоскелета, который является важным функциональным компонентом саркомеров, обеспечивающим нормальный процесс миофибриллогенеза. Обосновано предположение, что кальпаин-3 входит в структуру так называемого титин-макромолекулярного комплекса
и регулирует функционирование составляющих этого комплекса и титина.
Кальпаин-3 является важной частью системы, необходимой для формирования мышц и поддержания их нормальной функции. По данным ряда исследований при ПКМД П1 в мышечной ткани снижается количество нефосфорилированного (неактивного) кальпаина-3 и фосфорилированного (активного) кальпаина-3 [45-48].
5.2. Проявления кальпаинопатии
вне скелетной мускулатуры
Кардиомиопатия при мутациях в гене СЛРМБ крайне редка, что скорее всего связано с тем, что каль-паин-3 не экспрессируется в сердечной мышце. Тем не менее, Е.Л. Дадали и соавт. (2010) в 15% случаев (у 4 пациентов из 26 с анамнезом заболевания более 5 лет) все же регистрировали минимальные явления кардиомиопатии, такие как нарушения метаболических процессов в миокарде, аритмии, тахикардия, блокада правой ножки пучка Гиса и др. [5].
6. Диагностика кальпаинопатии
Начало мышечной слабости и прогрессирование клинического течения могут значительно различаться, как и спектр фенотипов, который становится все более широким, включая гиперкалиемию, псевдометаболическую миопатию и эозинофильный миозит. Исследования корреляции генотип-фенотип показали, что эта клиническая изменчивость может быть лишь частично обусловлена генной мутацией (межсемейная и внутрисемейная изменчивость из-за одной и той же мутации), что позволяет предположить, что дополнительные
эпигенетические и (или) экологические факторы могут играть роль в изменении экспрессии фенотипа [45, 47].
Для кальпанопатии, после первоначального клинического обследования и исключения более распространенных состояний с подобным фенотипом, многие эксперты рекомендуют использовать мультигенную панель или комплексное генетическое тестирование в качестве следующего диагностического шага [49].
Важным современным методом диагностики является секвенирование нового поколения, позволяющее высокоэффективно выявлять варианты мутаций высоко-пенетрантных и генетически гетерогенных заболеваний с четкими клиническими признаками, к которым относятся и ПКМД [7, 8].
7. Клиническая картина
Клиническая картина у пациентов с кальпаинопатией может отличаться даже при наличии одинаковой мутации гена CAPN3. Клинический фенотип ПКМД R1 следует разделить на три формы: пельвиофеморальную форму болезни Лейдена-Мебиуса (с преобладанием слабости проксимальных мышц нижнего пояса), плечелопаточную форму Эрба (с преобладанием проксимальной мышечной слабости) [51] и бессимптомную форму (проявляется гиперкреатинкиназемией без клинических признаков мышечного заболевания, представляет собой пресим-птомную стадию кальпаинопатии, которая в некоторых случаях может быть достаточно длительной) [3].
8. Основные направления
в лечении кальпаинопатии
Подобно многим наследственным заболеваниям, в настоящее время не существует этиотропных методов лечения поясно-конечностных прогрессирующих мышечных дистрофий [6]. В качестве симптоматической
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Bertini E., D'Amico A., Gualandi F. et al. Congenital muscular dystrophies: a brief review. Semin. Pediatr. Neurol. 2011; 18(4): 277-88.
2. Ono Y., Ojima K., Shinkai-Ouchi F. et al. An eccentric calpain, CAPN3/p94/calpain-3. Biochimie 2016; 122: 169-87.
3. Гришина Д.А., Супонева Н.А., Шведков В.В. и соавт. Наследственная прогрессирующая конечностно-поясная мышечная дистрофия 2а типа (кальпаинопатия): обзор литературы. Нервно-мышечные болезни 2015; 5(1): 25-36 [Grishina D.A., Suponeva N.A., Shvedkov V.V. et al. Inherited progressive limb-girdle muscular dystrophy type 2A (calpainopathy): a review of literature. Neuromuscular Diseases 2015; 5(1): 25-36].
4. Рыжкова О.П. Клинико-молекулярно-генетический анализ изолированных поясно-конечностных мышечных дистрофий, являющихся ферментопатиями. Автореф. дис. канд. мед. наук. Москва: Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова. 2011: 28 [Ryzhkova O.P. Clinical and molecular-genetic analysis of isolated limb-girdle muscular dystrophy, which fermentopathia. Abstract of the dissertation of a cand. of med. sciences. Moscow: Academician N.P. Bochkov Medical and Genetic Research Center. 2011: 28].
5. Дадали Е.Л., Щагина О.А., Рыжкова О.П. и соавт. Клинико-гене-тические характеристики поясно-конечностной мышечной дистрофии 2А типа. Журнал неврологии и психиатрии 2010; 110(4): 79-83 [Dadali E.L., Shchagina O.A., Ryzhkova O.P. et al. Clinical-genetic characteristics of limb girdle-muscular dystrophy type 2A. Journal of Neurology and Psychiatry 2010; 110(4): 79-83].
6. Vissing J. Limb Girdle Muscular Dystrophies: Classification, Clinical Spectrum and Emerging Therapies. Curr. Opin. Neurol. 2016; 29: 635-41.
7. Коновалов Ф.А., Федотов В.П., Умаханова З.Р. и соавт. Молекулярная диагностика наследственных миопатий методом полноэкзомного секвенирования. Материалы VII Съезда Российского общества медицинских генетиков; 2015 Май 19-23; Санкт-Петербург, Россия. Москва: Медицинская Генетика; 19 [Konovalov F.A., Fedotov V.P., Umakhanova Z.R. et al. Molecular diagnostics of hereditary myopathies by full-exome sequencing. Materials of the VII Congress of the Russian Society of Medical Geneticists; 2015 May 19-23; St. Petersburg, Russia. Moscow: Medical Genetics; 19].
8. Ampleeva M., Tolmacheva E., Komar'kov I. et al. NGS-based testing in diagnostics of hereditary neuro-muscular disorders: observations
терапии ПКМД П1 используют силовые и аэробные упражнения. В частности, силовые тренировки увеличивают силу мышц при ПКМД П1 [51, 52].
Для ПКМД П1 продолжают разрабатываться новые стратегии терапии как на клинической, так и на доклинической стадиях. Использование этиотропной терапии, заключающейся в системном или локальном (внутримышечном) введении ААУ-ассоциированного трансгена САРМ3, возможно, будет наиболее перспективным методом при кальпаинопатии. Однако этот вариант имеет определенные ограничения, связанные с безопасностью и выявленной в некоторых исследованиях кардиотоксичностью [54].
Заключение
Кальпаинопатия — наиболее распространенная форма ПКМД, что делает данное заболевание актуальной проблемой, требующей подробного изучения моле-кулярно-генетических особенностей и разработки новых методов лечения [3, 38].
Подробное изучение гена САРМ3 и кодируемого им белка кальпаина-3, а также вариантов мутаций и их распространенности в различных популяциях, является основанием для дальнейшей разработки потенциально эффективных методов генной терапии для пациентов с ПКмД Я1.
Имеющиеся данные свидетельствуют о наличии потенциально эффективных методов генной терапии, однако вопрос безопасности этих вариантов становится основной проблемой, требующей дальнейшего изучения [54].
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ, Соглашение № 075-15-2021-1346.
on a large cohort from a clinical bioinformatician's perspective, https:// www.nature.com/articles/s41431-020-00739-z.
9. Thompson R., Straub V. Limb-girdle muscular dystrophies — international collaborations for translational research. Nat. Rev. Neurol. 2016; 12(5): 294-309.
10. Piluso G., Politano L., Aurino S. et al. Extensive scanning of the cal-pain-3 gene broadens the spectrum of LGMD2A phenotypes. J. Med. Genet. 2005; 42(9): 686-93.
11. Angelini C., Fanin M. Calpainopathy, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ books/NBK1313/.
12. Lo H.P., Cooper S.T., Evesson F.J. et al. Limb-girdle muscular dystrophy: Diagnostic evaluation, frequency and clues to pathogenesis. Neuromuscular Disorders 2008; 18(1): 34-44.
13. Shin J.H., Kim H.S., Lee C.H. et al. Mutations of CAPN3 in Korean Patients with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Journal of Korean Medical Science 2007; 22(3): 463-9.
14. Gomez-Diaz B., Rosas-Vargas H., Roque-Ramirez B. et al. Immunodetection analysis of muscular dystrophies in Mexico. Muscle & Nerve 2012; 45(3): 338-45.
15. Reddy H.M., Cho K.A., Lek M. et al. The sensitivity of exome sequencing in identifying pathogenic mutations for LGMD in the United States. Journal of Human Genetics 2016; 62(2): 243-52.
16. Moore S.A., Shilling C.J., Westra S. et al. Limb-Girdle Muscular Dystrophy in the United States. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology 2006; 65(10): 995-1003.
17. Duno M., Sveen M.L., Schwartz M. et al. cDNA analyses of CAPN3 enhance mutation detection and reveal a low prevalence of LGMD2A patients in Denmark. European Journal of Human Genetics 2008; 16(8): 935-40.
18. Hanisch F., Müller C.R., Grimm D. et al. Frequency of cal-pain-3 c.550delA mutation in limb girdle muscular dystrophy type 2 and isolated hyperCKemia in German patients. Clinical Neuropathology 2007; 26(4): 157-63.
19. Kuhn M., Gläser D., Joshi P.R. et al. Utility of a next-generation sequencing-based gene panel investigation in German patients with genetically unclassified limb-girdle muscular dystrophy. Journal of Neurology 2016; 263(4): 743-50.
20. Monies D., Alhindi H.N., Almuhaizea M.A et al. A first-line diagnostic assay for limb-girdle muscular dystrophy and other myopathies. Human Genomics 2016; 10(1): 32-8.
21. Mahmood O.A., Jiang X., Zhang Q. Limb-girdle muscular dystrophy subtypes: First-reported cohort from northeastern China. Neural Regeneration Research 2013; 8(20): 1907-18.
22. Van der Kooi A.J., Frankhuizen W.S., Barth P.G. et al. Limb-girdle muscular dystrophy in the Netherlands: Gene defect identified in half the families. Neurology 2007; 68(24): 2125-8.
23. Fattahi Z., Kalhor Z., Fadaee M. et al. Improved diagnostic yield of neuromuscular disorders applying clinical exome sequencing in patients arising from a consanguineous population. Clinical Genetics 2017; 91(3): 386-402.
24. Magri F., Nigro V., Angelini C. et al. The italian limb girdle muscular dystrophy registry: Relative frequency, clinical features, and differential diagnosis. Muscle Nerve 2017; 55(1): 55-68.
25. Norwood F.L., Harling C., Chinnery P.F. et al. Prevalence of genetic muscle disease in Northern England: in-depth analysis of a muscle clinic population. Brain 2009; 132(11): 3175-86.
26. Zatz M., Vainzof M., Passos-Bueno M.R. Limb-girdle muscular dystrophy: one gene with different phenotypes, one phenotype with different genes. Current Opinion in Neurology 2000; 13(5): 511-7.
27. De Paula F., Vainzof M., Passos-Bueno M.R. et al. Clinical variability in calpainopathy: what makes the difference? European Journal of Human Genetics 2002; 10(12): 825-32.
28. Dinner P., Leturcq F., Richard I. et al. A biochemical, genetic, and clinical survey of autosomal recessive limb girdle muscular dystrophies in Turkey. Annals of Neurology 1997; 42(2): 222-9.
29. Chakravorty S., Nallamilli B.R.R., Khadilkar S.V. et al. Clinical and Genomic Evaluation of 207 Genetic Myopathies in the Indian Subcontinent. Frontiers in Neurology 2020; 11: 559327.
30. Pathak P., Sharma M.C., Sarkar C. et al. Limb girdle muscular dystrophy type 2A in India: a study based on semi-quantitative protein analysis, with clinical and histopathological correlation. Neurology India 2010; 58(4): 549-54.
31. Stehlikova K., Skalova D., Zidkova J. et al. Autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophies in the Czech Republic. BMC Neurology 2014; 14: 154-63.
32. Todorova A., Georgieva B., Tournev I. et al. A large deletion and novel point mutations in the calpain 3 gene (CAPN3) in Bulgarian LGMD2A patients. Neurogenetics 2007; 8(3): 225-9.
33. Dorobek M., Ryniewicz B., Kabzinska D. et al. The Frequency of c.550delA Mutation of the CANP3 Gene in the Polish LGMD2A Population. Genetic Testing and Molecular Biomarkers 2015; 19(11): 637-40.
34. Lonsdale J., Thomas J., Salvatore M. et al. GTEx Consortium. The Genotype-Tissue Expression (GTEx) project. Nature genetics 2013; 45(6): 580-5.
35. Cerino M., Bartoli M., Riccardi F. et al. Autosomal dominant segregation of CAPN3 c.598_612del15 associated with a mild form of calpainopathy. Ann. Clin. Transl. Neurol. 2020; 7(12): 2538-40.
36. Vissing J., Sveen M.L., Duno M. Dominant inheritance of limb girdle muscular dystrophy type 2A. Neuromuscular Disorders 2011; 21: 750-1.
37. Sorimachi H., Ono Y. Regulation and physiological roles of the cal-pain system in muscular disorders. Cardiovascular Research 2012; 96(1): 11-22.
38. Fanin M., Fulizio L., Nascimbeni A.C. et al. Molecular diagnosis in LGMD2A: Mutation analysis or protein testing? Human mutation 2004; 24: 52-62.
39. Chen L., Tang F., Gao H. et al. CAPN3: A muscle-specific calpain with an important role in the pathogenesis of diseases (Review). International journal of molecular medicine 2021; 48(5): 203-16.
40. Murphy R.M., Vissing K., Latchman H. et al. Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol. Journal of applied physiology 2011; 111(5): 1448-58.
41. Au Y. The muscle ultrastructure: a structural perspective of the sarcomere. Cellular and molecular life sciences 2004; 61(24): 3016-33.
42. Krüger M., Kötter S. Titin, a Central Mediator for Hypertrophic Signaling, Exercise-Induced Mechanosignaling and Skeletal Muscle Remodeling. Frontiers in physiology 2016; 7: 76-84.
43. Roperto S., De Tullio R., Raso C. et al. Calpain3 is expressed in a pro-teolitically active form in papillomavirus-associated urothelial tumors of the urinary bladder in cattle. PLoS One 2010; 5(4): e10299.
44. Angelini C., Nardetto L., Fanin M. et al. Heterogeneous pathogenesis of LGMD2: Consequences for therapy. Basic and applied myology: BAM 2007; 17: 173-9.
45. Bansal D., Campbell K. Dysferlin and the plasma membrane repair in muscular dystrophy. Trends in Cell Biology 2004; 14: 206-13.
46. Anderson L., Harrison R., Pogue R. et al. Secondary reduction in calpain 3 expression in patients with limb girdle muscular dystrophy type 2B and Miyoshi myopathy (primary dysferlinopathies). Neuromuscular disorders 2000; 10: 553-9.
47. Sorimachi H., Ono Y., Suzuki K. Skeletal muscle-specific calpain, p94, and connectin/titin: their physiological functions and relationship to limb-girdle muscular dystrophy type 2A. Advances in Experimental Medicine and Biology 2000; 481: 383-95.
48. Haravuori H., Vihola A., Straub V. et al. Secondary calpain3 deficiency in 2q-linked muscular dystrophy: titin is the candidate gene. Neurology 2001; 56: 869-77.
49. Ermolova N., Kudryashova E., Di Franco M. et al. Pathogenity of some limb girdle muscular dystrophy mutations can result from reduced anchorage to myofibrils and altered stability. Human molecular genetics 2011; 20 (17): 3331-45.
50. Thompson R., Straub V. Limb girdle muscular dystrophies — international collaborations for translational research. Nat. Rev. Neurol. 2016; 12: 294-309.
51. Saenz A., Leturcq F., Cobo A.M. et al. LGMD2A: Genotype-phenotype correlations based on a large mutational survey on the calpain-3 gene. Brain 2005; 128: 732-42.
52. Sveen M.L., Andersen S.P., Ingelsrud L.H. et al. Resistance Training in Patients with Limb-Girdle and Becker Muscular Dystrophies. Muscle Nerve 2013; 47: 163-9.
53. Sczesny-Kaiser M., Kowalewski R., Schildhauer T.A. et al. Treadmill Training with HAL Exoskeleton-A Novel Approach for Symptomatic Therapy in Patients with Limb-Girdle Muscular Dystrophy-Preliminary Study. Frontiers in Neuroscience 2017; 11: 1-9.
54. Bartoli M., Roudaut C., Martin S. et al. Safety and efficacy of AAV-mediated calpain 3 gene transfer in a mouse model of limb-girdle muscular dystrophy Type 2A. Mol. Ther. 2006; 13: 250-9.
