CC BY
27
Оригинальное исследование Original study
Молекулярно-генетические основы дисгенезии щитовидной железы
©Н.А. Макрецкая1 *, О.Б. Безлепкина1, А.А. Колодкина1, А.В. Кияев2, Е.В. Васильев1, В.М. Петров1, О.А. Чикулаева1, О.А. Малиевский3, И.И. Дедов1, А.Н. Тюльпаков1
1 ФГБУ"Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии "Минздрава России, Москва, Россия
2 ФГБОУВО "Уральский государственный медицинский университет" Минздрава России, Екатеринбург, Россия 3ГБУЗРБ "Республиканская детская клиническая больница", Уфа, Россия
Врожденный гипотиреоз — гетерогенная группа заболеваний, объединенных общим признаком — снижением функции щитовидной железы (ЩЖ) к моменту рождения. 80—85% случаев заболевания обусловлены различными вариантами нарушения органогенеза ЩЖ. На сегодняшний день в литературе описано 5 генов: TSHR, PAX8, FOXE1, NKX2-1, NKX2-5, задействованных в патогенезе дисгенезии щитовидной железы.
Цель. Оценить частоту мутаций в генах TSHR, PAX8, FOXE1, NKX2-1, NKX2-5 среди пациентов с тяжелым врожденным гипотиреозом.
Методы. В исследование включен 161 пациент с врожденным гипотиреозом (64 мальчика, 97 девочек) с уровнем тирео-тропного гормона по данным скрининга или ретестирования более 90 мМЕ/л. При ультразвуковом исследовании ЩЖ у 138 обследуемых диагностированы различные варианты дисгенезии, у 23 пациентов объем железы соответствовал нормальным значениям относительно площади поверхности тела. Для молекулярно-генетического анализа применялся метод высокопроизводительного параллельного секвенирования. Секвенирование осуществлялось на полупроводниковом секвенаторе PGM (Ion Torrent, Life Technologies, США) с использованием панели праймеров "Гипотиреоз" (Custom DNA Panel). Оценка патогенности мутаций осуществлялась согласно последним международным рекомендациям (ACMG, 2015).
Результаты. Мутации в генах, приводящие к дисгенезии щитовидной железы, были выявлены у 13 пациентов (8,1%, 13/161): TSHR, n = 6; NKX2-1, n = 3; NKX2-5, n = 1; PAX8, n = 3; FOXE1, n = 0.
Заключение. Мутации в генах, обусловливающие развитие дисгенезии щитовидной железы, являются редкой патологией. Среди наших пациентов наибольшее количество мутаций выявлено в гене TSHR.
Ключевые слова: дисгенезия, высокопроизводительное параллельное секвенирование, врожденный гипотиреоз.
Study of molecular basis of thyroid dysgenesis
©Nina A. Makretskaya1 *, Olga B. Bezlepkina1, Anna A. Kolodkina1, Alexey V. Kiyaev2, Evgeny V. Vasilyev1, Vasily M. Petrov1, Olga A. Chikulaeva1, Oleg A. Malievsky3, Ivan I. Dedov1, Anatoliy N. Tiulpakov1
1 Endocrinology Research Centre, Moscow, Russia
2 Ural State Medical University, Ekaterinburg, Russia 3Republican Children's Clinical Hospital, Ufa, Russia
Congenital hypothyroidism is a heterogeneous group of diseases, which is manifested by loss of function of the thyroid gland that affects infants from birth. 80—85% of cases are due to different types of thyroid dysgenesis. 5 genes have been described that are involved in the pathogenesis of thyroid dysgenesis: TSHR, PAXX8, FOXE1, NKX2-1, NKX2-5.
Aims. To evaluate the prevalence of mutations in the genes TSHR, PAX8, FOXE1, NKX2-1, NKX2-5 among patients with severe congenital hypothyroidism.
Materials and methods. 161 patients (64 boys, 97 girls) with congenital hypothyroidism (TSH levels at neonatal screening or retesting greater than 90 mU/l) were included in the study. 138 subjects had different variants of thyroid dysgenesis, and 23 patients had normal volume of the gland. A next generation sequencing was used for molecular-genetic analysis. Sequencing was performed using PGM semiconductor sequencer (Ion Torrent, Life Technologies, USA) and a panel "Hypothyroidism" (Custom DNA Panel). Assessment of the pathogenicity of sequence variants were carried out according to the latest international guidelines (ACMG, 2015).
Results. 13 patients had variants in thyroid dysgenesis genes (8,1%, 13/161): TSHR, n = 6; NKX2-1, n = 3; NKX2-5, n = 1; PAX8, n = 3; FOXE1, n = 0.
Conclusions. Mutations in thyroid dysgenesis genes are a rare pathology. The majority of variants among our patients were identified in TSHR.
Key words: thyroid dysgenesis, next generation sequencing, congenital hypothyroidism.
Статья может быть использована на условиях
64 международной лицензии CC BY-NC-ND 4.0. © Клиническая и экспериментальная тиреоидология, 2018 _The article can be used under ^e CC BY-NC-ND 4.° lfcense. © Clinical and experimental thyroidology, 2018
Дисгенезия щитовидной железы (ЩЖ) объединяет гетерогенную группу пороков развития органа и согласно исследованиям, основанным на методах визуализации, составляет 80—85% всех случаев врожденного гипотиреоза (ВГ) [1, 2]. В структуре данной патологии выделяют аплазию ЩЖ (20—30%) вследствие нарушения процессов детерминации или ускорения апоптоза предшественников фолликулярных клеток ЩЖ, эктопию (50—60%), обусловленную преждевременным прекращением миграционного процесса, а также гипоплазию органа (5%) [2—4].
К настоящему моменту идентифицировано 5 генов, ответственных за развитие ВГ вследствие дис-генезии ЩЖ: TSHR, РАХ8, FOXE1, ЫКХ2-1, ЫКХ2-5 [5]. Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенеза дисгенезии органа, позволило выделить изолированные формы заболевания и ВГ в составе наследственных синдромов [5]. Так, мутации в генах РАХ8 и TSHR приводят к изолированным нарушениям процессов эмбриогенеза ЩЖ [5], мутации в МКХ2-1 и FOXE1 — к синдромам "мозг — легкие — щитовидная железа" и Бамфорта—Лазаруса соответственно [5]. Обособленное положение занимает ген ЫКХ2-5, экспрессия которого выявлена помимо щитовидной железы также и в сердце [6, 7]. Исходя из профиля экспрессии, мутации в ИКХ2-5 должны приводить к синдромальной форме заболевания, однако на сегодняшний день нет достоверных данных ни о роли данного гена в самих процессах эмбриогенеза ЩЖ, ни о случаях мутаций с доказанной патогенно-стью, приводящих к развитию дисгенезии ЩЖ [6, 7].
В настоящей работе впервые в Российской Федерации изучена частота мутаций в генах, ответственных за развитие дисгенезии щитовидной железы, на выборке из 161 пациента.
Цель
Изучить частоту моногенных форм тяжелого врожденного гипотиреоза вследствие мутаций в генах TSHR, РАХ8, FOXE1, ЫКХ2-1, ЫКХ2-5.
Методы
Дизайн исследования
Проведено обсервационное многоцентровое одномоментное выборочное неконтролируемое исследование с участием пациентов с тяжелым врожденным гипотиреозом.
Критерии соответствия
Критерием включения в исследование было повышение уровня тиреотропного гормона (ТТГ) по данным неонатального скрининга или ретестирова-ния более 90 мМЕ/л. Неонатальный скрининг был
проведен всем пациентам по месту жительства в соответствии с приказом Минздравсоцразвития РФ от 22.03.2006 №185 "О массовом обследовании новорожденных детей на наследственные заболевания".
Критерием исключения из исследования было увеличение размеров щитовидной железы (ВОЗ, 2003) по данным неонатального скрининга.
Условия проведения
Первичное обследование и набор пациентов были проведены на следующих базах: ФГБУ "Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии" Минздрава России (Москва), ГБУЗ РБ "Республиканская детская клиническая больница" (Уфа), ГБУЗ СО "Областная детская клиническая больница №1" (Екатеринбург).
Продолжительность исследования
Набор пациентов проводился в период с ноября 2014 г. по сентябрь 2016 г.
Исходы исследования
В ходе проведения мол екулярно-генетического исследования оценивались наличие и частота обнаружения мутаций в генах TSHR, NKX2-1, NKX2-5, PAX8, FOXE1.
Методы регистрации исходов
Молекулярно-генетический анализ проводился в лаборатории отделения наследственных эндокри-нопатий ФГБУ "НМИЦ эндокринологии" Минздрава России. Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферический крови стандартным методом (набор Pure Link, Genomic DNA Mini Kit, Life Technologies, США). Для молекулярно-генетическо-го анализа применялся метод NGS. Использовалась разработанная в отделении наследственных эндо-кринопатий ФГБУ "НМИЦ эндокринологии" Минздрава России панель праймеров для мультиплексной ПЦР и секвенирования с применением технологии Ion Ampliseq™ Custom DNA Panel (Life Technologies, США). Панель праймеров "Гипотиреоз" охватывает кодирующие области следующих генов: TPO, PAX8, NKX2-5, IYD, SLC26A4, TG, GLIS3, FOXE1, NKX2-1, DUOX2, DUOX1, DOUXA2, TSHR, SLC5A5, TSHB, THRB, THR, UBR1, THRA, SLC16A2. Подготовка библиотек и эмульсионная ПЦР проводились в соответствии с рекомендациями производителя. Секвенирование осуществлялось на полупроводниковом секвенаторе PGM (Ion Torrent, Life Technologies, США). Биоинформатическая обработка результатов секвенирования проводилась с помощью программного модуля Torrent Suite 4.2.1 (Ion Torrent, Life Technologies, США) и пакета про-
грамм Annovar (версия 2014Nov12) [8]. После анализа полученных данных проводилось подтверждение полученных мутаций на секвенаторе Genetic Analyzer Model 3130 (Life Technologies, США). В качестве референсных последовательностей генов использовались ссылки Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genbank). Интерпретация результатов исследований и оценка патогенности нуклеотидных изменений проводились согласно международным рекомендациям [9]. Обозначение мутаций проведено в соответствии с рекомендациями den Dunnen и Antonarakis [10].
Одному пациенту с подозрением на обширную делецию в гене PAX8 по результатам анализа покрытия NGS и пациентам с одной гетерозиготной мутацией в гене TSHR (n = 3) проведена мультиплексная амплификация лигазо-связанных проб (multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA). При этом использовался набор зондов SALSA MLPA probemix P319, включающих последовательность генов TPO, PAX8, FOXE1, NKX2-1, TSHR (MRC-Holland, Нидерланды), и стандартный набор реагентов SALSA MLPA EK1-FAM (MRC-Holland, Нидерланды). Обработка полученных данных проведена с использованием программного обеспечения Coffalyser.Net (MRC-Holland, Нидерланды).
Этическая экспертиза
Данное исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ "НМИЦ эндокринологии" Минздрава России (протокол №12 от 22.10.2014). Информированное согласие было получено от всех обследованных пациентов; если возраст обследованных не достиг 15 лет, информированное согласие было подписано законным представителем в соответствии с протоколом исследования.
Статистический анализ
Размер выборки участников предварительно не рассчитывался. Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ Exel Microsoft Office 2013 и STATISTICA 10.0 (StatSoftInc., USA, Version 10.0). Для количественных признаков рассчитывались медианы (Me), перцентили [25; 75].
Результаты
Объекты (участники) исследования
В исследование был включен 161 пациент с диагнозом "врожденный гипотиреоз" (ТТГ более 90 мМЕ/л).
Медиана возраста пациентов на момент проведения исследования составила 5,1 года [2,9; 10,8], самому младшему пациенту было 2 нед, старшему —
17 лет 11 мес. Распределение по полу было следующим: 97 девочек (60,25%) и 64 мальчика (39,75%).
В ходе проведения ультразвукового исследования щитовидной железы получены следующие результаты: щитовидная железа нормального объема выявлена у 23 пациентов, гипоплазия — у 97, эктопия органа — у 10 и полная аплазия — у 31 обследуемого.
Основные результаты исследования
По результатам проведенного молекулярно-генетического исследования мутации в гене TSHR были выявлены у 6 пациентов (3,73%, 6/161), ЫКХ2-1 - у 3 обследуемых (1,86%, 3/161), ЫКХ2-5 -у 1 (0,62%, 1/161), РАХ8 - у 3 (1,86%, 3/161) (таблица). Мутации в гене РОХЕ1 обнаружены не были.
В нашем исследовании компаунд-гетерозиготная мутация в гене TSHR выявлена у одного пациента (N4), у двух сибсов от близкородственного брака (N1-1 и N1-2) выявлена гомозиготная мутация, трое пациентов (N2, N3-1, N3-2) имели по одной гетерозиготной мутации (таблица). Пациентам из последней группы (N2, N3-1, N3-2) проведено дополнительное генетическое исследование методом мультиплексной амплификации лигазо-связанных проб, однако патологических изменений выявлено не было.
Среди идентифицированных нами нуклеотид-ных изменений ранее описанной оказалась только миссенс-мутация е.С4840 р.Р162А (замена пролина на аланин в положении 162) [11]. По результатам функционального исследования выявлено, что для стимуляции мутантного рецептора требуется значительное повышение уровня ТТГ (в 20 раз) по сравнению с нормой [11].
Клинически у пациентов с мутациями в TSHR выявлены уменьшенные или нормальные размеры ЩЖ, что согласуется с патогенезом заболевания (таблица). У двух сибсов с гомозиготной мутацией р.147£в обнаружена аплазия ЩЖ, что вероятно связано с полной утратой рецептором функциональной активности.
Различные нуклеотидные изменения в гене МКХ2-1 выявлены у 3 пациентов: 2 делеции со сдвигом рамки считывания, которые были классифицированы как патогенные, и 1 миссенс-мутация с неопределенной патогенностью (таблица, подробное описание клинического случая N5 было представлено нами ранее [12]). Все нуклеотидные изменения выявлены в гетерозиготном состоянии, что согласуется с аутосомно-доминантным типом наследования, характерным для данного заболевания [13]. У пациентов N5 и N7 помимо ВГ были диагностированы дополнительные компоненты синдрома. С первых месяцев жизни у пациента N5 выявлена мышечная гипотония, задержка моторного развития,
© ©
о я Р й
Р Н
о М
рз К ^ Л
со Ф
& 5
CL И ф
>о К
£ ш я
В 3
£ ф
3-1,3
со Н - g
с+- Ф
¡3* И «С 1-3
HJ Ш
о 5
СП
и
Ро а
1-3
_ К
К "S
о о 1-1 к 00 й о й о i-d Н
а
Спектр нуклеотидных изменений, выявленных в генах, ответственных за развитие дисгенезии ЩЖ, и клиническая характеристика пациентов
Пациент Ген Нуклеотидная замена Аминокислотная замена Патогенность Зиготность ExAC* HGMD# Щитовидная железа Ассоциированные пороки
N1-1 TSHR c,141delC p.I47fs Патогенная Нот NA NA Аплазия Нет
N1-2 TSHR c,141delC p.I47fs Патогенная Нот NA NA Аплазия Нет
N2 TSHR C.C484G P.P162A Возможно патогенная Het 0.00017 Описана [11] Гипоплазия Нет
N3-1 TSHR C.G902A P.C301Y Неопределенная патогенность Het NA NA Нормальный объем Нет
N3-2 TSHR C.G902A P.C301Y Неопределенная патогенность Het NA NA Нормальный объем Нет
N4 TSHR C.C1532T P.T511M Неопределенная патогенность ComHet 0.000033 NA Нормальный объем Нет
TSHR C.T1697G P.V566G Неопределенная патогенность NA NA
N5 NKX2-1 c.628_772del Патогенная Het NA NA Гипоплазия Хорея
N6 NKX2-1 C.A1180G P.T394A Неопределенная патогенность Het NA NA Аплазия Нет
N7 NKX2-1 c.943 949del TGCAGCCT Патогенная Het NA NA Нормальный объем Респираторный дистресс-синдром, мышечная гипотония
N8 NKX2-5 C.G676A P.D226N Неопределенная патогенность Het NA NA Гипоплазия Нет
N9 PAX8 C.A701G P.E234G Неопределенная патогенность Het NA NA Гипоплазия Нет
N10 PAX8 C.G440A P.C147Y Неопределенная патогенность Het NA NA Гипоплазия Нет
N11 PAX8 chr2:113973574 114036498del Патогенная Het NA NA Гипоплазия Нет
а о
о си «с
О
Is
о >
to
D
О
о 5
о
The Human Gene Mutation Database (HGMD® (http://www.hgmd.cf.ac.uk) [23]; *ExAC database (http://exac.broadiiistitute.org) [24]; NA - нет данных; Het -гетерозиготная мутация; ComHet - компаунд-гетерозиготная мутация; Нот - гомозиготная мутация. NCBI Референсные последовательности (www.ncbi.nlm. nih.gov/nuccore): TSHR, NM_000369; NKX2-1, NM_001079668; NKX2-5, NM_004387; РАХ8, NM_003466.
OS <1
PAX8-10
02q13 02-113,692364 5183 24851 0,5? 0,02
37
0,0
PAX 8-9 02q13 02-113,694172 6285 33011 0,54 0,02 «* «* 32 0,0
PAX 8-7 02q13 02-113,701204 5922 31673 0,53 0,02 «* 53 0,0
PAX 8-7 02q13 02-113,709443 3945 19714 0,49 0 02 «* <* 34 0,0
PAX8-7 02q13 02-113,715464 1262 8341 0,43 0 02 «* «* 56 -0,1
PAX8-5 02q13 02-113,716741 2710 17406 0,51 0,03 «* «* 51 -0,1
PAX8-4 02q13 02-113,718910 2064 14329 0,48 0,01 «* «* 58 -0,2
PAX 8-2 02q13 02-113,752380 6213 28655 0,53 0,02 «* «* 38 -0,1
PAX 8-1 02q13 02-113,752816 5334 25145 0,55 0,02 «* «* 45 0,0
PAX 8-1 02q13 02-113,752925 4168 19367 0,54 0,03 «* «* 36 0,0
-niNrtoiTn , , , , , , , , ' ' ' ' ' * 1 ' DrNnTVlBS 6060006006066000 Q.O.ClCLQ.CLI1Q.CL IIUCLIIUCLCL t— 1— 1— 1— 1— 1— >-l— 1— 1— 1— 1— 1— 1— 1— Stttettstil aSSSSgKEiSSS .»-Hf-nflfT-^O • 2 J; N s. N -i N ^ ^ il CO О CO CO © CO CO Ю CO CO ^ Q.aQ.CLQ.acL a a a и. E E E E r? (ogg^iiiiiiitifflfl P, ™ S- " t f ч 0 f c i a> ao 01 c-i со 1 ■ • 1 т-СЧППглГг-fffl , , — <? ™ ........... ШсчЛсчОС^аОСОСССОСССОСОССЁ ^>5>i>Siiiiiiiiiir U-ZZZi-t-1-»— i— I-I— k-1— »-J— SSSfSgRKSS <& Ф ф 4} Q) ф ф ф giigglili £££££££££ ecacozccccccaccccc
□□□□щ-oEf
-г -Г T 1 1 1 1 1 1 —г Т
m s w ш «К к Я M АО ж
ж к £ S S ffl N if К Й Ж »
<_) о 0 9 0 0 0 0 C_l a 0 0 a о 0 0 a 0 0 0 о о о о О 9 о о
<N 0 CJ О CM 0 <N 0 <N 0 м ci m м 0 0 a 0 is 0 СМ CN о a сч о сч о
да «л ч*-
S « W N N T-
pjsss
SI л а о w fi
CO СО CO CO СО СО (О со <o <o
Ott CO n CO CO 00 00 CO CO 00 s s s s § я ;
О О О О О 1
' О О О О 1
Результаты MLPA у пациента N11.
в возрасте 15 мес появились гиперкинезы ног. У пациента N7 выявлен наиболее тяжелый вариант заболевания. При рождении отмечалась нарастающая дыхательная недостаточность, потребовавшая перевода ребенка на искусственную вентиляцию легких (снят в возрасте 1 мес), диагностирована внутриутробная правосторонняя очагово-сливная пневмония. При осмотре в возрасте 7 мес обращает на себя внимание общая мышечная гипотония, гиперкинезы не выявлены.
У трех пациентов были идентифицированы мутации в гене PAX8 (таблица): 2 миссенс-мутации с неопределенной патогенностью и 1 обширная деле-ция. Среди данных пациентов особый интерес представляет обследуемый N11. В ходе анализа результатов высокопроизводительного параллельного секве-нирования была заподозрена обширная делеция гена, что и было доказано методом MLPA (рисунок). По данным ультразвукового исследования у всех пациентов из данной группы выявлена гипоплазия
ЩЖ, которая является характерным проявлением дефектов в гене РАХ8 [14].
В данном исследовании выявлена 1 гетерозиготная миссенс-мутация в гене ЫКХ2-5 (таблица), отнесенная к вариантам с неопределенной патогенно-стью, пороков развития сердца у данного пациента не обнаружено.
Обсуждение
Резюме основного
результата исследования
В нашем исследовании был проведен анализ генов-кандидатов, мутации в которых приводят к развитию различных нарушений органогенеза ЩЖ (ТБНЯ, РАХ8, ЕОХЕ1, ЫКХ2-1, N№2-5), на выборке из 161 пациента из Российской Федерации. Полученные нами результаты подтвердили, что мутации в генах дисгенеза являются крайне редкой патологией, что согласуется с данными мировой литературы [15, 16].
Обсуждение основного
результата исследования
Первые масштабные исследования по изучению этиологии врожденного гипотиреоза и распространенности различных форм заболевания были основаны на методах визуализации [1, 2, 17]. При этом ВГ, обусловленный дисгенезией органа, выявлен у 80—85% пациентов, остальные 15—20% случаев были обусловлены дисгормоногенезом и сопряжены с увеличением размеров ЩЖ [1, 2, 17]. Полученные данные позволили предположить, что основной причиной развития ВГ являются мутации в генах-кандидатах, ответственных за эмбриогенез щитовидной железы. Последующие исследования были направлены на подтверждение данной гипотезы [15, 16]. Однако молекулярная основа была установлена менее чем у 6% обследуемых [15, 16].
Инактивирующие мутации TSHR приводят к широкому фенотипическому спектру, от тяжелого врожденного гипотиреоза до изолированного повышения уровня ТТГ. Чувствительность тканей щитовидной железы к стимулирующему действию ТТГ может полностью отсутствовать, что приводит к нарушению роста органа [11, 18]. Степень резистентности к ТТГ зависит от типа мутации и количества мутировавших аллелей [18]. Тяжелый врожденный гипотиреоз с гипоплазией ЩЖ, как правило, встречается при биаллельных мутациях, в то время как моноаллельные изменения приводят к мягким формам заболевания [18]. Однако фенотипическая вариабельность является характерной чертой мутаций гена TSHR, в том числе описаны случаи гипоплазии железы при гетерозиготных изменениях [18]. К настоящему моменту в гене TSHR выявлено более 60 инактивирующих мутаций, приводящих к развитию синдрома резистентности к ТТГ [18]. Мутации распределены по всей длине гена, за исключением интрацеллюлярной С-концевой области [18]. В нашем исследовании различные нуклеотидные изменения в гене TSHR выявлены у 6 обследуемых, в том чисел у 2 пар сибсов. Интересно, что у пациентов N2, N3-1, N3-2 было обнаружено только по 1 гетерозиготной миссенс-мутации, несмотря на наличие у них тяжелого ВГ. Мутация p.C301Y представляет собой замену цистеина на тирозин в области цистеин-богатых доменов, что должно приводить к нарушению связывания с лигандом и, возможно, к дезорганизации третичной структуры белка. Миссенс-мутация c.C484G p.P162A (пациент N2) была ранее исследована, ее патологическая значимость доказана in vitro [11].
В гене NKX2-I описано более 70 мутаций [5], которые приводят к развитию синдрома "мозг — легкие — щитовидная железа", классическими проявле-
ниями которого являются доброкачественная наследственная хорея, гипотиреоз и респираторный дистресс-синдром [13]. Однако совокупность всех трех симптомов данного заболевания встречается только в 50% случаев и чаще всего обусловлена наличием таких мутаций, как инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания [13]. В нашей когорте наиболее тяжелое течение заболевания также отмечалось именно у пациентов с обширными делециями гена NKX2-1.
Кодируемый геном PAX8 белок является транскрипционным фактором, принадлежащим к семейству PAX, отличительной чертой которого является наличие консервативного ДНК-связывающего домена (paired box domain) [19]. Существует описание более 20 инактивирующих мутаций в данном гене, большинство из которых локализовано в ДНК-связывающем домене [19]. В проведенном нами исследовании выявлена мутация c.G440A p.C147Y, локализованная в экзоне 5, кодирующем фрагмент белка между ДНК-связывающим доменом и консервативным октапептидом [20]. Ранее мутации в этой части PAX8 идентифицированы не были, в связи с чем влияние данного изменения на функцию белка не определено [20]. Миссенс-мутация c.A701G p.E234G расположена в центральном гомеодомене, должна приводить к снижению транскрипционной активности [20].
Относительно роли белка NKX2-5 в процессах развития и функционирования щитовидной железы к настоящему моменту остается большое количество вопросов. Известно лишь о наличии экспрессии NKX2-5 в зачатке щитовидной железы во время эмбриогенеза [6], в связи с чем мутации в этом гене и были предложены как новый механизм формирования дисгенезии щитовидной железы [7]. После выдвижения данной теории M. Dentice и соавт. провели скрининг группы пациентов с различными вариантами дисгенезии ЩЖ и врожденным гипотиреозом на наличие мутаций в гене NKX2-5, в результате чего у четырех обследуемых были идентифицированы 3 различные миссенс-мутации в гетерозиготном состоянии [7]. При ультразвуковом исследовании у троих пациентов выявлена эктопия, у одного — аплазия ЩЖ, незначительные нарушения со стороны сердечно-сосудистой системы обнаружены только у одного пациента [7]. Функциональные исследования в ходе данной работы были проведены для всех мутаций, при этом отмечалось снижение активации промотеров генов TG, TPO и DUOX2 [7]. Несмотря на полученные результаты, патогенность изменений вызывает сомнения по ряду причин. Во-первых, аналогичные мутации были выявлены у здоровых родителей, во-вторых, одна из мутаций идентифицирована у одного обследуемого из группы контроля [7].
Авторы исследования объясняют это различной степенью пенетрантности и вариабельной экспрессией гена на уровне тканей ЩЖ и сердца [7]. Между тем на сегодняшний день в мировой литературе не представлено весомых доказательств выдвинутых гипотез.
Мутации гена FOXE1 сопровождаются формированием классического симптомокомплекса: врожденный гипотиреоз, аплазия ЩЖ, расщелина неба, двусторонняя атрезия хоан, раздвоенный надгортанник и "стоящие торчком" волосы, получившего название синдром Бамфорта—Лазаруса [21, 22]. К настоящему моменту в гене FOXEl зарегистрировано всего 6 миссенс-мутаций, все расположены в ДНК-связывающем домене [5, 22]. У пациентов из нашей когорты мутации в гене FOXEl обнаружены не были, что было ожидаемо, так как ни у одного пациента не выявлено классических проявлений синдрома.
Ограничения исследования
Идентификация у наших пациентов ранее не описанных нуклеотидных изменений требует проведения функциональных исследований in vivo или in vitro с целью уточнения влияния данных мутаций на функциональную активность белка. Несмотря на то что эти исследования в нашей работе проведены не были, обнаруженные мутации имеют высокую вероятность патогенности по результатам прогнозирования in silico.
Заключение
Проведенное нами исследование подтвердило низкую частоту встречаемости мутаций в генах TSHR, PAXS, FOXE1, NKX2-1, NKX2-5. Тем не менее всем детям с диагнозом "врожденный гипотиреоз" рекомендуется проведение молекулярно-генетического исследования, что в ряде случаев позволит определить оптимальную тактику наблюдения и ведения пациентов, а в дальнейшем провести генетическое консультирование по вопросам дальнейшего планирования семьи.
Дополнительная информация
Источник финансирования. Работа выполнена при содействии Фонда поддержки и развития филантропии "КАФ".
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Список литературы [References]
1. Devos H, Rodd C, Gagne N, et al. A search for the possible molecular mechanisms of thyroid dysgenesis: sex ratios and associated malformations. J Clin Endocrinol Metab. 1999;84(7): 2502-2506. doi: 10.1210/jcem.84.7.5831.
2. Bubuteishvili L, Garel C, Czernichow P, Léger J. Thyroid abnormalities by ultrasonography in neonates with congenital hypothyroidism. JPediatr. 2003;143(6):759-764.
doi: 10.1067/s0022-3476(03)00537-7.
3. Van Vliet G, Deladoey J. Hypothyroidism in infants and children: congenital hypothyroidism. In: Braverman LE, Cooper D, editors. Werner & Ingbar's the thyroid: a fundamental and clinical text. 10th ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins; 2012. p. 790-802.
4. Rastogi MV, LaFranchi SH. Congenital hypothyroidism. Orphanet J Rare Dis. 2010;5(1):17. doi: 10.1186/1750-1172-5-17.
5. Szinnai G. Clinical genetics of congenital hypothyroidism. Endocr Dev. 2014;26:60-78. doi: 10.1159/000363156.
6. Lints TJ, Parsons LM, Hartley L, et al. Nkx-2.5: a novel murine homeobox gene expressed in early heart progenitor cells and their myogenic descendants. Development. 1993;119(2):419-431.
7. Dentice M, Cordeddu V, Rosica A, et al. Missense mutation in the transcription factor NKX2-5: a novel molecular event in the pathogenesis of thyroid dysgenesis. J Clin Endocrinol Metab. 2006;91(4): 1428-1433. doi: 10.1210/jc.2005-1350.
8. Wang K, Li M, Hakonarson H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Res. 2010;38(16):e164. doi: 10.1093/nar/gkq603.
9. Richards S, Aziz N, Bale S, et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015; 17(5):405-424. doi: 10.1038/gim.2015.30.
10. den Dunnen JT, Dalgleish R, Maglott DR, et al. HGVS Recommendations for the Description of Sequence Variants: 2016 Update. Hum Mutat. 2016;37(6):564-569.
doi: 10.1002/humu.22981.
11. Sunthornthepvarakui T, Gottschalk ME, Hayashi Y, Refetoff S. Brief report: resistance to thyrotropin caused by mutations in the thyrotropin-receptor gene. N Engl J Med. 1995;332(3):155-160. doi: 10.1056/NEJM199501193320305.
12. Макрецкая НА, Калинченко НЮ, Васильев ЕВ, и др. Клинический случай врожденного гипотиреоза, обусловленного дефектом гена NKX2-1. // Проблемы эндокринологии. - 2016. - Т. 62. - №3. - С. 21-24. [Makretskaya NA, Kalinchenko NY, Vasiliev EV, et al. Case of congenital hypothyroidism related to NKX2-1. Problems of Endocrinology. 2016;62(3):21-24. (In Russ.)]
doi: 10.14341/probl201662321-24.
13. Gras D, Jonard L, Roze E, et al. Benign hereditary chorea: pheno-type, prognosis, therapeutic outcome and long term follow-up in a large series with new mutations in the TITF1/NKX2-1 gene. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2012;83(10):956-962.
doi: 10.1136/jnnp-2012-302505.
14. Montanelli L, Tonacchera M. Genetics and phenomics of hypo-thyroidism and thyroid dys- and agenesis due to PAX8 and TTF1 mutations. Mol Cell Endocrinol. 2010;322(1-2):64-71.
doi: 10.1016/j.mce.2010.03.009.
15. Narumi S, Muroya K, Abe Y, et al. TSHR mutations as a cause of congenital hypothyroidism in Japan: a population-based genetic epidemiology study. J Clin Endocrinol Metab. 2009;94(4):1317-1323. doi: 10.1210/jc.2008-1767.
16. Al Taji E, Biebermann H, Limanova Z, et al. Screening for mutations in transcription factors in a Czech cohort of 170 patients with congenital and early-onset hypothyroidism: identification of a novel PAX8 mutation in dominantly inherited early-onset non-autoimmune hypothyroidism. Eur J Endocrinol. 2007;156(5):521-529. doi: 10.1530/EJE-06-0709.
17. Bamforth JS, Hughes IA, Lazarus JH, et al. Congenital hypothyroidism, spiky hair, and cleft palate. J Med Genet. 1989;26(1):49-51. doi: 10.1136/jmg.26.1.49.
18. Cassio A, Nicoletti A, Rizzello A, et al. Current loss-of-function mutations in the thyrotropin receptor gene: when to investigate, clinical effects, and treatment. J Clin Res PediatrEndocrinol. 2013;5 Suppl 1:29-39. doi: 10.4274/jcrpe.864.
19. Plachov D, Chowdhury K, Walther C, et al. PAX8, a murine paired box gene expressed in the developing excretory system and thyroid gland. Development. 1990;110(2):643-651.
20. de Sanctis L, Corrias A, Romagnolo D, et al. Familial PAX8 small deletion (c.989_992delACCC) associated with extreme phenotype
variability. J Clin Endocrinol Metab. 2004;89( 11 ):5669-5674. doi: 10.1210/jc.2004-0398.
21. Bamforth JS, Hughes IA, Lazarus JH, et al. Congenital hypothyroidism, spiky hair, and cleft palate. J Med Genet. 1989;26(1):49-51. doi: 10.1136/jmg.26.1.49.
22. Clifton-Bligh RJ, Wentworth JM, Heinz P, et al. Mutation of the gene encoding human TTF-2 associated with thyroid agenesis, cleft palate and choanal atresia. Nat Genet. 1998;19(4):399-401. doi: 10.1038/1294.
23. Stenson PD, Mort M, Ball EV, et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Hum Genet. 2017;136(6):665-677.
doi: 10.1007/s00439-017-1779-6.
24. Lek M, Karczewski KJ, Minikel EV, et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 2016;536(7616): 285-291. doi: 10.1038/nature19057.
Информация об авторах [Authors info]
*Макрецкая Нина Алексеевна, н.с. [Nina A. Makretskaya, MD, research associate], адрес: Россия, 117036,
Москва, ул. Дм. Ульянова, д. 11 [address: 11 Dm. Ulyanova street, 117036 Moscow, Russia];
ORCID: http://orcid.org/0000-0003-0412-7140; eLibrary SPIN: 4467-7880; e-mail: makretskayan@gmail.com.
Безлепкина Ольга Борисовна, д.м.н., профессор [Olga B. Bezlepkina, MD, PhD, Professor]; eLibrary SPIN-код: 3884-0945;
ORCID: http://orcid.org/0000-0001-9621-5732; e-mail: olgabezlepkina@mail.ru.
Колодкина Анна Александровна, к.м.н., с.н.с. [Anna A. Kolodkina, MD, PhD, senior research associate]; eLibrary SPIN-код: 6705-6630; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7736-5372; e-mail: anna_kolodkina@mail.ru. Кияев Алексей Васильевич, д.м.н., доцент [Alexey V. Kiyaev, MD, PhD, assistant professor]; eLibrary SPIN-код: 7092-7894; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-5578-5242; e-mail: thyroend@mail.ru.
Васильев Евгений Витальевич, к.б.н., с.н.с. [Evgeny V. Vasilyev, PhD, senior research associate]; eLibrary SPIN-код: 5767-1569; ORCID: http://orcid.org/0000-0003-1107-362X; e-mail: vas-evg@yandex.ru.
Петров Василий Михайлович, к.х.н., с.н.с. [Vasily M. Petrov, PhD, senior research associate]; eLibrary SPIN-код: 4358-2147; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-0520-9132; petrov.vasiliy@gmail.com.
Чикулаева Ольга Александровна, к.м.н. [Olga A. Chikulaeva, MD, PhD]; eLibrary SPIN-код: 6813-5061; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-4743-4661; e-mail: chikulaeva.olga@gmail.com.
Малиевский Олег Артурович, д.м.н., профессор [Oleg A. Malievsky, MD, PhD, Professor]; eLibrary SPIN-код: 6813-5061; ORCID: http://orcid.org/0000-0003-2599-0867; e-mail: malievsky@list.ru
Дедов Иван Иванович, д.м.н., профессор, академик РАН [Ivan I. Dedov, MD, PhD, Professor]; eLibrary SPIN: 5873-2280; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-8175-7886; e-mail: dedov@endocrincentr.ru.
ТОольпаков Анатолий Николаевич, д.м.н. [Anatoliy N. Tiulpakov, MD, PhD]; ORCID: http://orcid.org/0000-0001-8500-4841; eLibrary SPIN: 8396-1798; e-mail: ant@endocrincentr.ru.
Как цитировать [To cite this article]
Макрецкая Н.А., Безлепкина О.Б., Колодкина А.А., Кияев А.В., Васильев Е.В., Петров В.М., Чикулаева О.А., Малиевский О.А., Дедов И.И., Тюльпаков А.Н. Молекулярно-генетические основы дисгенезии щитовидной железы. // Клиническая и экспериментальная тиреоидология. — 2018. — Т.14. — №2. — С. 64-71. doi: 10.14341/ket9556
Makretskaya NA, Bezlepkina OB, Kolodkina AA, Kiyaev AV, Vasilyev EV, Petrov VM, Chikulaeva OA, Malievsky OA, Dedov II, Tiulpakov AN. Study of molecular basis of thyroid dysgenesis. Clinical and experimental thyroidology. 2018;14(2):64-71. doi: 10.14341/ket9556
Рукопись получена: 06.02.2018. Рукопись одобрена: 05.03.2018. Received: 06.02.2018. Accepted: 05.03.2018.
