CC BY
18
выраженной, чем в контрольной группе. После применения габриглобина у пациентов на 20-50 % возрастали титры антител к вирусу гриппа А, вирусам семейства Herpesviridae, ЦМВ и респираторно-синцитиальному вирусу, а у большинства больных через 5-7 суток значительно возрастало содержание IgG-антител к хантавирусам, что свидетельствовало о нарастании пассивного иммунитета.
Так как габриглобин не содержал специфических антител к хантавирусам, можно предположить, что механизм действия препарата объясняется блокадой Fc-рецепторов им-мунокомпетентных клеток, уменьшением комплемент-зависимого повреждения тканей, изменением структуры и увеличением растворимости иммунных комплексов, что предупреждало блокаду почечных канальцев, улучшало почечный кровоток, а также снижало выброс провоспалительных цитокинов с последующей индукцией противовоспалительных цитокинов, т.е. смягчало проявление «ци-токинового шторма», и приводило к снижению тяжести заболевания.
Прямым доказательством эффективности габриглобина при коронавирусной инфекции стало его использование для терапии единственного в России случае заболевания атипичной пневмонией, вызванной вирусом SARS-CoV-1, выявленном в г. Благовещенске
Амурской области в 2002 г. Препарат был использован в период ранней реконвалесценции у больного С. в дозе 7,5 г ежедневно в течение трех дней. Введение габриглобина не сопровождалось никакими нежелательными реакциями. Со вторых суток после применения не наблюдалось подъема температуры, уменьшился лейкоцитоз, улучшилось общее состояние.
Таким образом, исходя из изложенных фактов, мы считаем, что для терапии многих тяжелых природно-очаговых инфекций можно с успехом использовать обычный поливалентный ВВИГ, в котором присутствует широкий спектр антител к различным возбудителям инфекционных заболеваний, циркулирующим на территории РФ. Механизм действия препарата при этом не связан исключительно с наличием высокого титра антител к конкретному патогену, а определяется способностью оказывать противовоспалительный эффект за счет уменьшения комплемент-зависимого повреждения тканей, изменения структуры и растворимости иммунных комплексов, индукции противовоспалительных цитокинов и нейтрализации микробных токсинов, связывании и нейтрализации патогенных антител антиидио-типическими антителами, что в итоге предотвращает цитокиновый шторм, развитие сепсиса и септического (инфекционно-токсичес-кого) шока.
Лютов Андрей Германович - доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории иммунобиологических препаратов; Алешкин Владимир Андрианович - доктор биологических наук, профессор, научный руководитель; Новикова Лидия Ивановна - кандидат медицинских наук, руководитель лаборатории иммунобиологических препаратов; Бочкарева Светлана Сергеевна - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунобиологических препаратов; ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора.
УДК 599.323.45: 614.484
Мальцев А.Н.1, Рябов С.В.2, Мохирев Д.Ю.2, Стахеев В.В. 3, Гашев С.Н.4, Баженов Ю.А. 5, Гололобова Т.В. 2' 6
1 Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова Российской академии наук, Москва, Россия
2Научно-исследовательский институт Дезинфектологии Роспотребнадзора, Москва, Россия
3Федеральный исследовательский центр Южный научный центр Российской академии наук, Ростов-на-Дону, Россия
4Тюменский государственный университет, Тюмень, Россия 5Институт природных ресурсов, экологии и криологии Сибирского отделения Российской академии наук, Чита, Россия 6ФГБОУДПО РМАНПО Минздрава России, Москва
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ДОМОВЫХ МЫШЕЙ (MUSMUSCULUS) И СЕРЫХ КРЫС (RATTUS NORVEGICUS) К РОДЕНТИЦИДАМ АНТИКОАГУ-ЛЯНТНОГО ХАРАКТЕРА ДЕЙСТВИЯ В РОССИИ
Материалом для молекулярно-генетического анализа служили 125 домовых мышей (M. musculus) и 19 серых крыс (R. norvegicus) из 13 населенных пунктов (городов и сел) России. В городах мы обнаружили две ранее не описанные мутации в первом экзоне Lys58Arg и Ser31Trp. В Ростове у 13,7 % от всех исследованных мышей, в Москве - 87,5 %, в Тюмени - 13 %, в Ногинске и Подольске - 100 %, что может быть связано с устойчивостью к антикоагулянтам. У серых крыс резистентность обнаружена только в Москве: у трех особей одна из мутаций (Tyr139Ser) находится в гетерозиготном состоянии. Эта редкая мутация обнаружена нами в трех районах Москвы.
Ключевые слова:
Maltsev A.N.1, Ryabov S.V.2, Mokhirev D.Yu.2, Stakheev V.V.3, Gashev S.N.4, Bazhenov Yu.A.5, Gololobova T.V.2, 6
1Severtsov Institute ofProblems of Ecology and Evolution, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia.
2Scientific Research Disinfectology Institute of Federal Service for Surveillance on Consumer
Rights Protection and Human Well-being, Moscow, Russia
3The Federal Research Center Southern Scientific Centre of the Russian Academy
of Sciences, Rostov-on-Don, Russia
4 University of Tyumen, Тyumen, Russia.
5Institute of Natural Resources, Ecology and Cryology, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Chita, Russia
6FGBOU of additional professional education RMAPO of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russia
MOLECULAR GENETIC RESISTANCE OF HOUSE MICE (MUS MUSCULUS) AND NORWAY RATS (RATTUS NORVEGICUS) TO ANTICOAGULANT RODENTICIDES IN RUSSIA
The material for molecular genetic analysis was 125 house mice (M. musculus) and 19 Norway rats (R. norvegicus) from 13 settlements (cities and villages) of Russia. In cities, we found two previously undescribed mutations in the first exon Lys58Arg and Ser31Trp. In Rostov, 13.7 % of all mice studied, in Moscow - 87.5 %, in Tyumen - 13 %, in Noginsk and Podolsk - 100 %, which may be due to resistance to anticoagulants. In Norway rats, resistance was found only in Moscow: in three individuals, one of the mutations (Tyr139Ser) is in a heterozygous state. This rare mutation was discovered by us in 3 districts of Moscow.
Keywords: Mus musculus, Ruttus norvegicus, resistance to anticoagulants, VCORC1.
Многолетнее применение родентицидов для борьбы с грызунами способствовало развитию у них приобретенной к антикоагулянтам резистентности и, как следствие, снижению в ряде случаев эффективности дератиза-дератизационных мероприятий.
Открытие в начале 50-х годов антикоагулянтов I поколения - варфарина, дифацино-на, куматетралила, этилфенацина и т.д. сделало переворот в мировой дератизационной практике [5]. В результате в разных населенных местах в большинстве стран, в том числе и в городах России, с помощью антикоагулянтов удалось значительно повысить эффективность дератизационных мероприятий. Антикоагулянты I поколения очень долгое время доминировали в качестве основного средства борьбы с серыми крысами и домовыми мышами. Впервые в 1958 г. резистентность к антикоагулянтам I поколения была обнаружена у серых крыс и в начале 1960-х гг. у домовых мышей в Великобритании. Развитие резистентности грызунов к антикоагулянтам I поколения привело к разработке в 70-80-х гг. более токсичных антикоагулянтов II поколения - бромадиолона, бродифакума, флокума-фена, дифенакума, дифетиалона. Разработчики рассчитывали преодолеть проблему снижения эффективности дератизационных мероприятий с помощью антикоагулянтов II поколения [5]. Однако странам, где была зарегистрирована устойчивость грызунов к антикоагулянтам I поколения, решить эту проблему с помощью антикоагулянтов II поколения не удалось. В 1977 г. была обнаружена резистентность серых крыс к дифенакуму, а устойчивость к бромадиалону, бродифакуму и флокумафену вскоре после их массового применения. Резистентность грызунов к антикоагулянтам второго поколения оказалась связана с механизмом их действия на грызунов [5, 6].
В 2004 г. был установлен и секвениро-ван ген, отвечающий за устойчивость грызунов к антикоагулянтам - VKORCI [4]. Ген VKORC1 кодирует субъединицу 1 витамин К - эпоксид-редуктазного комплекса (vitamin К epoxide reductase complex, subunit 1). Дефицит витамина К приводит к кровотечениям, особенно на фоне поступления в организм варфарина или других непрямых антикоагулянтов, которые непосредственно не участвуют в свертываемости крови, но нарушают ее, ингибируя ферменты витамин-К-редуктазу -
VKOR и витамин-К-эпоксид редуктазу -VKORC. Одной из причин дефицита витамина К и замедленного свертывания крови является изменение в гене VKORC1, приводящее к снижению синтеза ферментов [4, 5].
В Западной Европе устойчивость к антикоагулянтам у домовых мышей и серых крыс хорошо изучена [7-9]. У серых крыс обнаружен ряд мутаций, которые обеспечивают устойчивость к антикоагулянтам первого и второго поколений (Leu128Ser, LEU120GLN, ILE82ILE, IL82IL, TRP59GLY, TYR139CYS, TYR139SER, TYR139PHE, LEU128GLN, ARG35PRO). У домовых мышей найдены две мутации гена VKORC1 (TYR139CYS, LEU128SER). Относительно недавно их список был значительно расширен. До сих пор не было никаких исследований распространения мутации гена VKORC1 в России у домовых мышей. Мутация Tyr139Ser была найдена у серых крыс в Москве и Московской области [3]. Однако устойчивость синантропных грызунов к антикоагулянтам на большей части России остается, слабо исследованной. Цель нашего исследования состоит в том, чтобы проанализировать полиморфизм гена VKORC1 у домовых мышей и серых крыс в населенных пунктах России и выявить наличие или отсутствие мутаций определяющих резистентность.
Материал и методы. Путем использования ловушек с 2019 по 2020 г. были собраны в населённых пунктах России грызуны: домовая мышь (Mus musculus) - 125 шт. и серая крыса (Rattus norvegicus) - 71 шт. Ткани серых крыс и домовых мышей хранили в 96 %-ном спирте при температуре 6 °C. Из разных частей тела - хвост, сердце, мышцы конечностей выделяли ДНК. Для выделения ДНК использовали наборы DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen). ПЦР проведена в тер-моциклере SimpliAmp™ (Applied Biosystems). Для амплификации геномной ДНК домовых мышей использовались следующие прайме-ры: экзон 1 - GACCAATCTTCCGGTAGGAG (прямой), CGACCCCAGACTCCAAAAT
(обратный праймер); экзон 3 -GAAGCACCTGCTGTCTGTCA (прямой) и GCCTTCTAGGAACCCACACA (обратный праймер).
Амплификация проводилась с помощью набора 2Х Мастер-микс HotStarTaq Plus (Qiagen). В 25 мкл реакционной смеси входил микс из смеси полимераз (HS-Taq и Pfu), сме-
си дезоксинуклеозидтрифосфатов, ПЦР-буфер, Mg2+ и другие реагенты (ДНК-матрица -1-2 нг, деионезированная вода (Н2О) до 50 мкл, прямой и обратный праймеры -0,1-800 нМ. Режим ПЦР включал следующие условия: 94 °C в течении 3 мин, 25 циклов амплификации (94 °C - 30 с, 58 °C - 30 с и 72°C - 1 мин 30 с) и финальную достройку цепей (72 °C - 10 мин). ПЦР для тотальной ДНК серых крыс проведена с использованием следующих праймеров: экзон 1 - RE1AF CTCTTGTGTCTGCGCTGTAC, RE1R
GCTTTTCATTTCTGCACGCA; экзон 3 - RE3F TGAGTTCCCTGGTGTCTGTC, RE3R
TTTTAGGGACCCACACACGA [8]. Условия ПЦР: 94 °C - 3 мин, 35 циклов амплификации (94 °C - 30 с, 58 °C - 30 с и 72 °C - 1 мин) и финальную достройку цепей (72 °C - 10 мин). Для очистки ПЦР-продуктов использовался набор QIAquick PCR Purification Kit. Секвени-рование ПЦР-продуктов проводилось по обеим цепям с помощью генетического анализатора 3500xL (Applied Biosystems). Было отсеквенировано 2 участка ДНК гена VCORC1 у домовых мышей (250 п.н. - 1-й экзон, 330 п.н. - 3-й экзон) и серых крыс (209 п.н. и 227 п.н. соответственно). Выравнивание последовательностей ДНК произведено с помощью программы BioEdit v.7.0.5.3, анализ в MEGA V.10.05. Полученные нуклеотидные последовательности для обнаружения гомозиготных мутаций гена VCORC1 сравнивались с диким типом контрольных последовательностей из базы данных GenBank/NCBI: (NM_203335.2 для R. norvegicus и NM_178600.2 для M. musculus). Для обнаружения гетерозиготных мутаций сравнивали хроматограммы положения нуклеотидов в последовательностях прямого и обратного прай-меров. Для оценки соотношения синонимичных и несинонимичных замен (dN/dS) в экзонах у домовых мышей и серых крыс использовали программу DNAsp, v.6.
Результаты и обсуждение. У домовых мышей не обнаружено мутаций гена VKORC1, ответственного за резистентность к антикоагулянтам первого и второго поколения на позициях LEU128SER и TYR139CYS, локализованных в третьем экзоне. Однако в городах мы
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Мальцев А.Н. Мутации гена резистентности VCORC1 к антикоагулянтам у синантропных грызунов на урбанизированных территориях России /
нашли две ранее неизвестные гетерозиготные мутации в первом экзоне, Lys58Arg и Ser31TRP. Соотношение мутаций в городах были следующие: в Ростове 16,6 % всех мышей, в Москве - 87,5 %, в Тюмени - 12,5 %, в Ногинске и Подольске - 100 %. Мутации могли быть вызваны применением антикоагулянтов второго поколения: в г. Москва, Московская область - бромадиалон, бродифакум в концентрации 0,005 %; в г. Ростов-на-Дону -бромадиалон в концентрации 0,005 %, в г. Тюмени - бромадиолон, бродифакум -0,005 %. Мы предполагаем, что под действием более токсичных антикоагулянтов II поколения из популяции исчезли домовые мыши, связанными с устойчивостью к варфарину (антикоагулянт I поколения).
У серых крыс резистентность обнаружена только в Москве: у трех особей одна из мутаций (Tyr139Ser) находится в гетерозиготном состоянии [1, 2]. Процент резистентных особей составил 15,7 %. Крысы, устойчивые к варфарину, были отловлены в трех районах Москвы: Юго-Западном, Северном и СевероВосточном. Мы предполагаем, что эта мутация доминирует в Москве и Московской области. Мутация Tyr139Ser вызвана устойчивостью к антикоагулянтам I поколения. Возможно, в связи с этим в Москве наиболее распространены, пищевые приманки на антикоагулянтах II поколения (бромдиолон, бродифакума, фло-кумафен), которые эффективны против городской популяции серых крыс.
В Европе Мутация Tyr139Ser (Y139S) обнаружена только в Великобритании (Уэльс, Северный Йоркшир). Несмотря на очень ограниченное распределение этой мутации в Европе, эта редкая мутация обнаружена у серых крыс в Юго-Западном округе Москвы, в поселке Московский (Московская область) [3] и нами в трех районах Москвы [1, 2].
Мутация могла появиться в результате применения пищевых приманок на антикоагулянтах I поколения при проведении длительных истребительных работ на этих территориях. Возможно появление мутации в результате завоза серых крыс с транспортом из Великобритании в Москву и Московскую область.
REFERENCES
1. Mal'cev A.N. Mutacii gena rezistentnosti VCORC1 k antikoagulyantam u sinantropnyh gryzunov na urbanizirovannyh territoriyah Rossii / A.N. Mal'cev,
A.Н. Мальцев, С.В. Рябов, В.В. Стахеев, Н.В. Пана-сюк, С.Н. Гашев, Н.В. Сорокина, Ю.А. Баженов, Е.В. Котенкова // Доклады Российской Академии Наук. науки о жизни, 2021. Т. 498. С. 41-45.
2. Мальцев А.Н. Уровень мутирования гена резистентности VKORC1 к антикоагулянтам у домовых мышей и серых крыс г. Москвы и Московской области / А.Н. Мальцев, С.В. Рябов, Д.Ю. Мохирев, Т.В. Гололобова, П.А. Юнаков, О.М. Окушко,
B.Ю. Капустин, Е.В. Котенкова // Дезинфекционное дело. 2021. № 1. С. 55-62.
3. Миронова Т.А. Распространение мутаций гена VKORC1 и устойчивость серых крыс к антикоа-гулянтным родентицидам в ряде городов России / Т.А. Миронова, В.А. Рыльников, А.В. Богачева, Л.А. Лавренченко // Пест мэнежмент, 2020. № 1.
C. 5-7.
4. Прескотт С.В. Резистентность к роденти-цидам-антикоагулянтам. Новая молекулярная методология определения мутаций гена резистентности VKORC1 и понимание их возможного влияния на эффективность применения препаратов // РЭТ-инфо, 2013. № 4 (88). С. 39-46.
5. Рябов С.В. Резистентность грызунов к антикоагулянтам // Дезинфекционное дело 2018. № 2. С. 46-54.
6. Рябов С.В., Мохирев Д.Ю., Сапожникова А.И. Устойчивость грызунов к антикоагулянтам и пути её предотвращения с помощью ультразвуковых дератизационных устройств // Современные вопросы дезинфектологии / под общ. ред. Н.В. Шестопалова и М.Г. Шандалы. М. : ФБУН «НИИДезинфектологии» Роспотребнадзора, 2018. С. 332-344.
7. Goulois J., Lambert V., Legros L. [et al.]. Adaptative evolution of the Vkorc1 gene in Mus muscu-lus domesticus is influenced by the selective pressure of anticoagulant rodenticides // Ecology and Evolution. 2017. Vol. 7, № 8. P. 2767-2776.
8. Mooney J., Lynch M., Prescott C. [et al.]. VKORC1 sequence variants associated with resistance to anticoagulant rodenticides in Irish populations of Rattus norvegicus and Mus musculus domesticus // Scientific Reports. 2018. Vol. 8, № 4535. P. 1-6.
9. Pelz H. J., Rost S., Müller E. [et al.]. Distribution and frequency of VKORC1 sequence variants conferring resistance to anticoagulants in Mus musculus // Pest Management Science. 2012. Vol. 68, № 2. P. 254-259.
S.V. Ryabov, V.V. Staheev, N.V. Panasyuk, S.N. Gashev, N.V. Sorokina, Yu.A. Bazhenov, E.V. Ko-tenkova // Doklady Rossijskoj Akademii Nauk. nauki o zhizni, 2021. T. 498. S. 41-45.
2. Mal'cev A.N. Uroven' mutirovaniya gena re-zistentnosti VKORC1 k antikoagulyantam u d omovyh myshej i seryh krys g. Moskvy i Moskovskoj oblasti / A.N. Mal'cev, S.V. Ryabov, D.Yu. Mohirev, T.V. Go-lolobova, P.A. Yunakov, O.M. Okushko, V.Yu. Kapustin, E.V. Kotenkova // Dezinfekcionnoe delo. 2021. № 1. S. 55-62.
3. Mironova T.A. Rasprostranenie mutacij gena VKORC1 i ustojchivost' seryh krys k antikoagulyantnym rodenticidam v r yade gorodov Rossii / T.A. Mironova, V.A. Ryl'nikov, A.V. Bogacheva, L.A. Lavrenchenko // Pest menezhment, 2020. № 1. S. 5-7.
4. Preskott S.V. Rezistentnost' k rodenti-cidam-antikoagulyantam. Novaya molekulyarnaya metodologi-ya opredeleniya mutacij gena rezistentnosti VKORC1 i ponimanie ih vozmozhnogo vliyaniya na effektivnost' primeneniya preparatov // RET-info, 2013. № 4 (88). S. 39-46.
5. Ryabov S.V. Rezistentnost' gryzunov k antikoagulyantam // Dezinfekcionnoe delo 2018. № 2. S. 46-54.
6. Ryabov S.V., Mohirev D.Yu., Sapozhnikova A.I. Ustojchivost' gryzunov k a ntikoagulyantam i puti eyo predotvrashcheniya s pomoshch'yu ul'trazvukovyh deratizacionnyh ustrojstv // Sovremennye voprosy dezin-fektologii / pod obshch. red. N.V. SHestopalova i M.G. Shandaly. M. : FBUN «NII Dezinfektologii» Rospotrebnadzora, 2018. S. 332-344.
7. Goulois J., Lambert V., Legros L. [et al.]. Adaptative evolution of the Vkorc1 gene in Mus musculus domesticus is influenced by the selective pressure of anticoagulant rodenticides // Ecology and Evolution. 2017. Vol. 7, № 8. P. 2767-2776.
8. Mooney J., Lynch M., Prescott C. [et al.]. VKORC1 sequence variants associated with resistance to anticoagulant rodenticides in Irish populations of Rattus norvegicus and Mus musculus domesticus // Scientific Reports. 2018. Vol. 8, № 4535. P. 1-6.
9. Pelz H. J., Rost S., Müller E. [et al.]. Distribution and frequency of VKORC1 sequence variants conferring resistance to anticoagulants in Mus musculus // Pest Man-agement Science. 2012. Vol. 68, № 2. P. 254-259.
Мальцев Алексей Николаевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова Российской академии наук;
Рябов Сергей Васильевич - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник - заведующий лабораторией проблем дератизации; Мохирев Денис Юрьевич - младший научный сотрудник лаборатории проблем дератизации; ФБУН «НИИ Дезинфектологии» Роспотребнадзора;
Стахеев Валерий Владимирович - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Федерального исследовательского центра «Южный научный центр» Российской академии наук;
Гашев Сергей Николаевич - профессор, доктор биологических наук, Институт биологии Тюменского государственного университета;
Баженов Юрий Александрович - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, институт природных ресурсов, экологии и криологии СО РАН;
Гололобова Татьяна Викторовна - доктор медицинских наук, заместитель директора, ВРИО директора ФБУН «НИИДезинфектологии» Роспотребнадзора.
