CC BY
91
УДК: 636.4.082.2
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ПАСПОРТИЗАЦИЯ КЕМЕРОВСКОЙ ПОРОДЫ СВИНЕЙ НА ОСНОВЕ 8ТЯ-АНАЛИЗА
B.Р. ХАРЗИНОВА1, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник (e-mail: veronika0784@mail.ru)
К.В. ЖУЧАЕВ2, доктор биологических наук, декан (e-mail: nsau@inbox.ru)
О.В. КОСТЮНИНА1, доктор биологических наук, зав. лабораторией (e-mail: kostolan@mail.ru)
М.Л. КОЧНЕВА2, доктор биологических наук, зам. декана (e-mail: mlkochneva@nsau.edu.ru)
C.М. ЧЫДЫМ2, аспирант (e-mail: chydym.syrga@ yandex.ru)
Н.А. ЗИНОВЬЕВА1, доктор биологических наук, академик РАН, директор (e-mail: zinovieva@mail.ru)
всероссийский научно-исследовательский институт животноводства им. Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская Федерация
2Новосибирский государственный аграрный университет, ул.Добролюбова, 160, Новосибирск, 630039, Российская Федерация
Резюме. Генетическая паспортизация и идентификация свиней -актуальная задача в селекционно-племенной работе. Для этого используют микросателлиты (STR-маркеры). Цель исследований - генетическая идентификация и паспортизация локальной кемеровской породы свиней с использованием STR-анализа, оценка ее генетического разнообразия и степени дифференциации, в сравнении с другими локальными и коммерческими породами. Исследования проведены в 2017г. на 79животных трех локальных пород - кемеровская (KEM, n=31), беркширская (BER, n=29), крупная черная (LB, n = 19) и 121 особи трех коммерческих пород - крупная белая (LW, n=64), ландрас (L, n=21) идюрок(DU, n = 36). Для исследований брали образцы ткани (ушной выщип) свиней из коллекции банка генетического материала домашних и диких животных и птицы на базе ВИЖ им. Л.К. Эрнста. Геномную ДНК выделяли с использованием колонок «Nexttec» (Германия) согласно рекомендациям фирмы-изготовителя. Полиморфизм десяти STR-маркеров (SW24, S0155, S0355, S0386, SW72, SW951, S0101, SW240, SW857и S0005) определяли по собственным методикам на ДНК-анализаторе ABI3130xl («Applied Biosystems», США). Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета MS Excel 2007 с плагином GenAlEx v. 6.5. Генетическую структуру изучаемых пород оценивали методом кластеризации в программе STRUCTURE v. 2.3.4. Кемеровская порода имеет наименьшие значения наблюдаемой степени гете-розиготности, в сравнении с породами ландрас, дюрок и крупной белой:0,554±0,054против0,635±0,082,0,567±0,092,0,762±0,053 соответственно. Однако превосходит по величине этого показателя локальные породы (крупная черная и беркширская), у которых она составляет 0,542±0,079 и 0,499±0,072. Кемеровские свиньи характеризуются наибольшими значениями среднего (Na) и эффективного (Ne) числа аллелей, уступая только крупной белой породе (NaKEM=5,000±0,645, NaW=5,556±0,852, NeKEM=3,295±0,384, NeLW= 3,305±0,446). Все исследованные породы формируют свой клаwтер с высокой степенью консолидированности, что свидетельствует об уникальности их аллелофонда.
Ключевые слова: кемеровская порода, свиньи, ДНК-паспортизация, STR.
Для цитирования: Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация кемеровской породы свиней на основе STR-анализа/В.Р. Харзинова, К.В. Жучаев, О.В. Костюнина, М.Л. Кочнев, С. М. Чыдым, Н.А. Зиновьева //Достижения науки и техники АПК. 2017. Т. 31. № 6. С. 62-64.
Анализируя современное состояние отрасли свиноводства, следует отметить, что за последние 50-75 лет, на территории многих стран значительно увеличилась численность наиболее продуктивныхпород свиней (коммерческих),
приспособленных к существующим технологиям производства. И, наоборот, резко сократилось поголовье или совсем исчезли десятки локальных (местных), низкопродуктивных и неперспективных пород [1]. При этом последние сохраняют большую индивидуальную изменчивость, по сравнению с коммерческими породами, многие из них характеризуются конституциональной крепостью, стрессоустойчивостью, пониженной потребностью в протеине, хорошей адаптацией к местным климатическим условиям и нетребовательностью к кормам [2]. Эти качества с успехом могут быть использованы в селекции свиней при совершенствовании и выведении пород, линий и гибридов. Исчезновение животных локальных пород влечет за собой невосполнимую потерю уникальных генов, приобретенных ими в результате длительного хозяйственного использования и влияния природных факторов. Веским аргументом в пользу их сохранения служит целесообразность разведения в районах страны с резкими колебаниями климатическихусловий и сезонным характером кормовой базы, а также в зонах с горным рельефом и низкой урожайностью пастбищ [3].
Одна из таких пород, утвержденная еще в 1960 г., -кемеровская порода свиней. Работами по ее созданию руководили профессор А.И. Овсянников и И.И. Гудилин. На первом этапе местных скороспелых свиней скрещивали с хряками крупной белой породы. На втором для сложного воспроизводительного скрещивания использовали хряков беркширской и крупной черной пород. Кемеровские свиньи относятся к породам мясо-сального направления продуктивности и характеризуются спокойным нравом, крупными размерами, крепкой конституцией, интенсивным ростом живой массы и скороспелостью, хорошей приспособленностью к суровым климатическим условиям севера. На сегодняшний день эту породу разводят на территории Сибири и Дальнего Востока, а также в некоторых районах Казахстана (преимущественно на севере страны) [4].
С целью уменьшения потери уникальных генов и сохранения генофонда множества локальных пород свиней, в том числе кемеровской, актуально проведение их ДНК-паспортизации и идентификации. Генетическая паспортизация представляет собой метод получения генетически детерминированных характеристик с помощью молекулярных маркеров. Сейчас в мировой практике для паспортизации пород и индивидуальной паспортизации сельскохозяйственных животных преимущественно при-меняютДНК-маркеры, не подверженные влиянию факторов внешней среды [5]. Наиболее часто используют микросателлиты - короткие тандемные повторы (short tandem repeats, STR). STR-анализ широко применяют во многих аспектахпопуляционно-генетическихисследований: оценке чистопородности, контроле достоверности происхождения, определении степени инбридинга, характеристике биоразнообразия и степени генетической дифференциации пород и внутрипородных генетических структур [6].
Мы использовали STR-анализ с целью молекулярно-генетической идентификации и создания ДНК-паспорта кемеровской породы свиней, а также характеристики ее генетического разнообразия и степени генетической дифференциации в отношении свиней локальных (беркширской и крупной черной) и коммерческих (крупная белая, ландрас и дюрок) пород.
30
0
-25 -20 -15 -10 -5 0
-5
'»Л1.
в. ж
!■ и ■ " -10
-15
ВХ .«к J
Ч * > Л f ^ ♦
х х х
х >«<
Измерение 1
-20
-25
Рис. 1. Двухмерное распределение в породах свиней по принадлежности к собственной популяции на основании STR-анализа: ♦ - DU - дюрок; ■ - LW - крупная белая; а - L - ландрас; х - LB -крупная черная; ж - BER - беркширская; • - KEM - кемеровская.
Условия, материалы и методы. Исследования проведены в 2017 г. В качестве биологического материала использовали 200 образцов тканей (выщип уха) свиней кемеровской (KEM, n = 31), беркширской (BER, n = 29), крупной черной (LB, n = 19), крупной белой (LW, n = 64) пород, а также ландрас (L, n = 21) и дюрок (DU, n = 36) из коллекции банка генетического материала домашних и диких животных и птицы, созданного на базе ВИЖ им. Л.К. Эрнста. Выделение ДНК проводили с использованием колонок фирмы Nexttec (Германия) согласно рекомендациям фирмы-изготовителя.
Полиморфизм 10 STR-маркеров (SW24, S0155, S0355, S0386, SW72, SW951, S0101, SW240, SW857и S0005) определяли по собственным методикам, опубликованным ранее [7, 8], с использованием генетического анализатора ABI PRISM 3130xl («Applied Biosystems», США). Размеры фрагментов определяли с использованием программного обеспечения GeneMapper® Software v4 («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Генетическую консолидированность (assignment-тест), среднее число аллелей (Na), число эффективных аллелей (Ne), наблюдаемую (Ho) и ожидаемую (He) степени гетерозиготно-сти и коэффициент инбридинга (Fis) определяли с помощью программного обеспечения GenAlEx v. 6.5.1 [9]. Для изучения структуры популяций на основе микроса-теллитных профилей использовали программу Structure v. 2.3.4 [10]. Приложение STRUCTURE HARVESTER [11] применяли для определения оптимального числа кластеров (ДК) выборки по методу G. Evanno с соавт. [12].
Результаты и обсуждение. На основе полученных ДНК-профилей каждого индивидуума по микросателлитам,
Таблица. STR*
Генетическое разнообразие изучаемых пород свиней по локусам
Порода n Na Ne Pr Ho He
KEM 31 5,000±0,645 3,295±0,384 0,345±0,236 0,554±0,054 0,649±0,054 0,148
LB 13 4,333±0,833 2,761±0,437 0,556±0,294 0,542±0,079 0,585±0,078 0,078
BER 29 3,667±0,333 2,332±0,199 — 0,499±0,072 0,534±0,058 0,061
DU 36 3,778±0,596 2,437±0,470 0,333±0,236 0,567±0,092 0,495±0,075 -0,154
LW 64 5,556±0,852 3,305±0,446 0,444±0,176 0,762±0,053 0,659±0,036 -0,156
L 21 4,444±0,444 2,523±0,406 0,222±0,147 0,635±0,082 0,537±0,058 -0,169
*Ш - среднее число аллелей на локус; N0 - среднее эффективное число аллелей на локус; Рг-число приватных аллелей на локус; Но - наблюдаемая герерогзиготность; Но - ожидаемая гетерозиготность, - коэффициент инбридинга; DU - дюрок, - крупная белая; 1 - ландрас; 1Б - крупная черная; БЕИ-беркширская; КЕМ-кемеровская
а также общих для каждой группы числа и частоты аллелей показано распределение исследуемых животных по принадлежности к собственной популяции (рис.1).
Точность отнесения каждой особи к своей собственной популяции составила 100 % по всем исследованным породам, причем для популяций была характерна разная степень генетической удаленности, при этом они образовывали два массива.
Первый массив был сформирован из свиней пяти пород: КЕМ, LW, LB, L и ВЕЯ, второй - особями породы дюрок, что, по всей видимости, служит отражением значительных фенотипических отличий, а также стратегии селекционно-племенной работы, направленной на поддержание типа конституции и совершенствование продуктивных качеств этой породы.
По результатам анализа генетического разнообразия исследованных пород свиней (см. табл.) среднее число аллелей на локус ^а) варьировало от 3,667±0,333 у породы ВЕЯ до 5,556±0,852 у породы LW. Такая же закономерность отмечена и в отношении числа эффективных аллелей: для LW характерна наибольшая величина этого показателя (3,305±0,446 аллелей на локус), а для ВЕЯ -наименьшая (2,332±0,199 аллелей на локус).
Уровень наблюдаемой гетерозиготности (Но) составил 0,554, 0,542, 0,499, 0,567, 0,762 и 0,635 для КЕМ, LW, ВЕЯ, DU, LWи L соответственно. Для кемеровской породы свиней свойственен относительно невысокий уровень полиморфизма микросателлитов: среднее число аллелей на локус №) составляет 5,000±0,645, среднее эффективное число аллелей на локус (№) - 3,295±0,384. По всей видимости это представляет собой следствие локального разведения.
Еще одна из характеристик аллелофонда популяций -наличие уникальных (приватных) аллелей, специфичных для каждой из исследованных пород свиней. Среди локальных пород приватные аллели выявлены во всех исследованных группах, за исключением породы беркшир. Наибольшее их количество было идентифицировано у свиней крупной черной породы (Рг = 0,556±0,294), а наименьшее - у породы ландрас (Рг = 0,222±0,147). Животные кемеровской породы имели промежуточные значения величины этого показателя (Рг = 0,345±0,236).
Генетическое равновесие у всех рассмотренных локальных пород было смещено в сторону недостатка гете-розигот, с ранжированием коэффициента инбридинга (^8) от 0,061 у ВЕЯ до 0,148 у КЕМ. Возможно, это следствие их продолжительного разведения «в себе». Коммерческие породы свиней характеризовались незначительным избытком гетерозигот, при этом значения составили -0,154, -0,156 и -0,169 для пород DU, LW и L соответственно.
Для определения генетической структуры исследуемых пород свиней был проведен кластерный анализ (рис. 2). Оптимальным числом кластеров для всей выборки оказалось К = 6 (ДК = 73,34). Проведенный анализ выявил высокую степень генетической обособленности всех исследованных пород свиней, о чем свидетельствуют средние значения коэффициентаподо-бия Q в каждой породе ^^ = 0,940±0,013, QLB=0,893±0,010, QвER = 0,941 ±=0,011, QDU = 0,956±0,017, QLW=0,949±0,016 и QL = 0,940±0,016).
Выводы. В результате исследований, направленных на ДНК-паспортизацию и идентификацию геноти-
0%
Рис. 2. Кластерный анализ пород свиней на основе 10 STR-локусов с использованием программы Structure v. 2.3.4 при К=6: ось X - индивидуумы изученных пород; осьY- значение Q - величина вклада каждого из кластеров в генотип особи (вероятность того, что особь принадлежит к тому или иному кластеру); L - ландрас; KEM - кемеровская, DU - дюрок, LB - крупная черная, BER-беркширская, LW - крупная белая.
пов кемеровской породы свиней с последующей характеристикой ее генетического разнообразия, было выявлено, что они характеризуются относительно невысоким уровнем генетического разнообразия, в сравнении исследованными коммерческими породами, но имеют наибольшие величины этих показателей
по отношению к другим локальным породам.
Кластерный анализ выявил высокую степень генетической консолидиро-ванности каждой из изученных пород, что свидетельствует об уникальности их аллелофонда. Полученные результаты - важнейший этап в изучении уникальных качеств кемеровской породы свиней. Они послужат основой для оптимизации методов сохранения ее генетического разнообразия и генофонда на популяционном уровне. На основании оценок полилокусного сочетания моно- и полиморфных участков ДНК можно будет составить молекулярно-генетическую формулу, штрих-код породы и обобщить сведения о ней в виде генетического паспорта.
Литература.
1. Михайлова О.А. История выведения и проблема сохранения редких и исчезающих пород свиней// Свиноводство. 2016. № 1. С. 8-11.
2. Анализ 30 микросателлитных маркеров у шести локальных популяций крупного рогатого скота / Т.Ю. Киселева, Б.Е. Подоба, Е.Е. Заблудовский, В.П. Терлецкий, Н.И. Воробьев, Ю. Кантанен // Сельскохозяйственная биология. 2010. № 6. С. 20-25.
3. Местные породы крупного рогатого скота [Электронный ресурс]. URL: http://worldgonesour.ru/razvedenie-s-h-zhivotnyh/63-mestnye-porody-krupnogo-rogatogo-skota.html. (дата обращения: 15.05.2017).
4. Чернышова Е. Кемеровская порода свиней//АгроХХ1: агропромышленный портал [Электронный ресурс]. URL: https://www.agroxxi. ru/wiki-animal/svini/mjaso-salnye-universalnye-porody-svinei/kemerovskaja-poroda-svinei.html (дата обращения: 15.05.2017).
5. Монахова М.А., Горячева И.И., Кривцов Н.И. Генетическая паспортизация Apis mellifera. Проблемы и методы // Пчеловодство. 2009. № 4. С. 12-13.
6. Development of multiplex microsatellite panel to assess the parentage verification in and differentiation degree of reindeer populations (Rangifertarandus)/V.R. Kharzinova, E.A. Gladyr', V.I. Fedorov, T.M. Romanenko, L.D. Shimit, K.A. Layshev, L.A. Kalashnikova, N.A. Zinovieva// Sel'skokhozyaistvennayaBiologiya(AgriculturalBiology). 2015. №6. Pp. 756-765. doi: 10.15389/agrobiology.2015.6.756eng.
7. Тихомирова Т.И. Мультилокусное исследование ДНК-микросателлитов в характеристике генофонда свиней различной породной принадлежности и происхождения:автореф.... канд. биол. наук. Дубровицы, 2008.22с.
8. Микросателлитные профили как критерии определения чистопородности и оценки степени гетерогенности подборов родительских пар в свиноводстве/Н.А. Зиновьева, В.Р. Харзинова, Т.И. Логвинова, Е.А. Гладырь, Е.И. Сизарева, Ю.И. Чинаров // Сельскохозяйственная биология. 2011. № 6. С. 47-53.
9. Peakall R., Smouse P.E. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research-an update// Bioinformatics. 2012. No 28. Pp. 2537-2539. doi: 10.1093/bioinformatics/bts460.
10. Pritchard J. K., Stephens M., Donnelly P. Inference of population structure using multilocus genotype data // Genetics. 2000. No 155. Pp. 945-959.
11. Earl D.A., vonHoldt B.M. STRUCTURE HARVESTER: a website and program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method//Conserv. Genet. Resour. 2012. No 4. Pp. 359-361. doi: http://dx.doi-.org/10.1007/s12686-011-9548-7.
12. Evanno G., Regnaut S., Goudet J. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: A simulation study//Mol. Ecol. 2005. No. 14. Pp. 2611-2620. doi: 10.1111/j.1365-294X.2005.02553.x.
MOLECULAR-GENETIC IDENTIFICATION AND CERTIFICATION OF KEMEROVO BREED OF PIGS BASED
ON STR-ANALYSIS
V.R. Kharzinova1, K.V. Zhuchaev2, O.V. Kostyunina1, M.L. Kochneva2, S. M. Chydym2, N.A. Zinovieva1
1L.K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, pos. Dubrovitsy, 60, Podol'skii r-n, Moskovskaya obl., 142132, Russian Federation
2Novosibirsk State Agrarian University, ul. Dobrolyubova, 160, Novosibirsk, 630039, Russian Federation
Abstract. Genetic certification and identification of pigs is an urgent task in selection and breeding work. Microsatellites, so-called STR-markers, are used for these purposes. The aim ofthe current studywas genetic identification and certification ofKemerovo breed of pigs with the use of STR-analysis, as well as an estimation of its genetic diversity and differentiation degree in comparison with other local and commercial breeds. The studies were carried out in 2017 on 79 animals of three local breeds: Kemerovo (KEM, n = 31), Berkshire (BER, n = 29), Large Black (LB, n = 19) and 121 animals of three commercial breeds: Large White (LW, n = 64), Landrace (L, n = 21) and Duroc (DU, n = 36). Tissue samples (ear notches) of pigs, available in the collection of the bank of genetic material of domestic and wild animals and poultry, L.K. Ernst All-Russian Institute of Animal Husbandry, were used for the study. Genomic DNA was extracted using Nextech column (Germany) according to manufacturer's recommendations. Polymorphism of 10 STR-markers (SW24, S0155, S0355, S0386, SW72, SW951, S0101, SW240, SW857and S0005) was determined by own procedures on ABI 3130xl DNA analyzer («Applied Biosystems», USA). Statistical analysis was performed in MS Excel 2007 with GenAlEx v. 6.5 plugin. Genetic structure of the studied breeds was assessed through clustering in STRUCTURE 2.3.4 software. Kemerovo breed has the lowest values of the observed degree of heterozygosity in comparison with Landrace, Duroc, and Large White breeds: 0.554 ± 0.054 vs. 0.635 ± 0.082, 0.567 ± 0.092, 0.762 ± 0.053, respectively. However, it exceeds the local breeds (Large Black and Berkshire) by this index: 0.542 ± 0.079 and 0.499 ± 0.072. Kemerovo pigs are characterized by the maximum values of the mean (Na) and effective (Ne) numbers of alleles, yielding only to Large White breed (Na(KEM) = 5.000 ± 0.645, Na(LW) = 5.556 ± 0.852, Ne(KEM) = 3.295 ± 0.384, Ne(LW) = 3.305 ± 0.446). The results of the genetic structure analysis showed that all studied breeds form their own cluster with a high degree of genetic consolidation, which indicates the uniqueness of their allele pool. Keywords: Kemerovo breed, pigs, DNA-certification, STR.
Author Details: V.R. Kharzinova, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow (e-mail: veronika0784@mail.ru); K.V. Zhuchaev, D. Sc. (Biol.), prof., dean (e-mail: nsau@inbox.ru); O.V. Kostyunina, D. Sc. (Biol.), leading research fellow, head of laboratory (e-mail: kostolan@mail. ru); M.L. Kochneva, D. Sc. (Biol.), prof., deputy dean (e-mail: mlkochneva@nsau.edu.ru); S. M. Chydym, post graduate student (e-mail: chydym.syrga@yandex.ru); N.A. Zinovieva, D. Sc. (Biol.), member of the RAS, director (e-mail: zinovieva@mail.ru). For citation: Kharzinova VR., Zhuchaev K.V., Kostyunina O.V., Kochneva M.L., Chydym S. M., Zinovieva N.A. Molecular-Genetic Identification and Certification of Kemerovo Breed of Pigs Based on STR-Analysis. Dostizheniya naukiitekhnikiAPK. 2017. Vol. 31. No. 6. Pp. 62-64 (in Russ.).
