CC BY
139
УДК 574.1:636.475
МОДЕЛИРОВАНИЕ СИСТЕМЫ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО АНАЛИЗА ISSR-МАРКЕРОВ СВИНЕЙ
Т. Е. ДЕНИСКОВА, аспирант
Е.А. ГЛАДЫРЬ, кандидат биологических наук, зав. лабораторией
Н.А. ЗИНОВЬЕВА, доктор биологических наук, член-корреспондент РАСХН
ВИЖ Россельхозакадемии
Е.И. СИЗАРЕВА, кандидат биологических наук, генеральный директор
ООО «Знаменский селекционно-гибридный центр» E-mail: n_zinovieva@mail.ru
Резюме. Предложена система анализа ДНК-маркеров на основе межмикросателлитных последовательностей (ISSR) свиней. Система основана на ПЦР-амплификации с флуоресцентно меченными праймерами ISSR-6 и ISSR-2 с последующей мультиплексной лазерной детекцией продуктов с помощью ДНК-анализатора. Полученную бинарную матрицу ISSR-профилей анализировали с использованием программного обеспечения GenAlEx, в. 6.4. Исследование свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок(n=47) показало высокую степень полиморфизма ISSR-маркеров: из 568 идентифицированных локусов 80,8 % были полиморфными. Все идентифицированные пики встречались с частотой более 5 %, что свидетельствует об их информативности. Самое низкое число пиков идентифицировано у свиней породы ландрас: 199 и 195 для праймеров ISSR-6 и ISSR-2 соответственно. Число идентифицированных пиков у животных крупной белой породы составило 214 и 274, у свиней породы дюрок - 210 и 291 соответственно. Наименьшим уровнем гетерозигот-ности характеризовались свиньи породы ландрас - 23,3 %, в то время как у пород крупная белая и дюрок этот показатель составил 26,7 и 27,0 %. В каждой из пород были обнаружены приватные пики, число которых у свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок составило 15, 36 и 54, соответственно. Разработанная система ISSR-анализа найдет применение в характеристике аллелофонда пород свиней.
Ключевые слова: ISSR-маркеры, полиморфизм, биоразнообразие, породы свиней.
Оценка значения породы с точки зрения ее консервации требует синтеза информации из ряда источников, в том числе результатов молекулярно-генетических исследований, которые дают объективные критерии оценки разнообразия в породе и между породами, а также единых генетических характеристик [1]. Использование молекулярных маркеров значительно расширяет возможности генетического анализа популяций, позволяет установить меж- и вну-трипородную изменчивость отдельных участков генома и составить представление о генетической структуре породы [2]. Хорошо изучены и широко распространены для характеристики генетического разнообразия видов сельскохозяйственных животных, в частности свиней, метод микросателлитного анализа [3, 4]. Однако для объективной оценки состо-
яния и динамики аллелофонда популяций животных необходимо расширение спектра высокополиморфных ДНК-маркеров.
Один из типов таких маркеров - межмикросател-литные последовательности (ISSR) [2]. В геномах животных и растений количество микросателлитных повторов довольно велико, что делает метод удобным для генетического анализа. Микросателлитные последовательности окружают многие гены и могут использоваться как якорные последовательности к этим генам, а, следовательно, ISSR-маркеры могут показать большое число полиморфных фрагментов на праймер [5]. ISSR-маркеры проявляют специфику микросателлитных маркеров, но при этом не нуждаются в информации о последовательности для синтеза праймеров [6].
Традиционно для обнаружения полиморфизма ISSR применяют электрофоретическое разделение ампли-фицированных фрагментов в полиакриламидном геле и последующую визуализацию с окрашиванием нитратом серебра или применением радиоизотопов, что не всегда приемлемо. Информативность, чувствительность и скорость ISSR-анализа можно значительно увеличить при использовании ДНК-анализаторов [7, 8].
В этой связи целью нашего исследования была разработка системы мультиплексного генотипирования ISSR-маркеров свиней с использованием флуорес-центно-меченных праймеров и последующего электрофоретического разделения и детекции продуктов амплификации на ДНК-анализаторе.
Условия, материалы и методы. Исследование проводили в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖ на 47 головах племенных свиней пород крупная белая, ландрас и дюрок. В качестве образцов использовали пробы ткани (ушные выщипы). Выделение ДНК и постановку ПЦР проводили согласно «Методическим рекомендациям...» [9]. Для ПЦР амплификации использовали специфические праймеры
Рис. 1. ISSR - анализ на ABI Prism 3130xl: а) ISSR-2; б) ISSR-6
ISSR-2 и ISSR-6 с флуоресцентными метками R6G и FAM соответственно. Анализ продуктов ПЦР выполняли на 16-и капиллярном генетическом анализаторе ABI3130xl Genetic Analyzer. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью программного
обеспечения GenAIEx6_4 и Microsoft Office Excel 2007.
результаты и обсуждение. В ходе проведенных исследований была разработана система генотипиро-вания ISSR-маркеров свиней с использованием комбинации праймеров с флуоресцентными метками R6G и FAM, анализируемых в одном капилляре. Полученный в результате анализа ISSR-фингерпринт представлен набором пиков разной длины (рис. 1).
Вследствие доминантного характера наследования ISSR-маркеров для обработки полученных данных была сформирована бинарная матрица, которая построена из двух составных элементов: 0 (отсутствие соответствующего фрагмента) и 1 (наличие фрагмента). В процессе ее создания из анализа исключали пики с высотой менее 100 единиц для предотвращения обработки неспецифических фрагментов. Созданная бинарная матрица послужила базой для дальнейшей обработки результатов с помощью программного обеспечения GenAIEx6.4.
Проведенный ISSR-анализ свиней трех пород позволил идентифицировать 568 локусов, в том числе 247 - для ISSR-6 и 321 - для ISSR-2. Праймер ISSR-6 показал более высокий уровень полиморфизма для свиней породы ландрас, а ISSR-2 характеризовался большей степенью полиморфизма для свиней породы дюрок. У свиней крупной белой породы существенных различий в уровне полимофизма между праймерами не установлено (см. табл.).
Все идентифицированные при анализе пики вне зависимости от породы встречались с частотой более
Литература.
1. FAO: «Состояние всемирных генетических ресурсов животных в сфере продовольствия и сельского хозяйства». - Отчет. - Рим, 2007. - 526 с.
2. Сулимова Г. И., ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения // Успехи современной биологии. - 2004. - Т. 124. - №3. - С.260-271.
3. Зиновьева Н.А., Ларионова П.В., Тихомирова Т.И., Гладырь Е.А., Шавырина К.М. Генетическая характеристика свиней пород крупная белая и йоркшир различного происхождения с использованием ДНК-маркеров//Доклады РАСХН. - 2008. - № 2. - с. 33-36.
4. Зиновьева Н.А., Сизарева Е.И., Гладырь Е.А., Проскурина Н.В., Шавырина К.М. Некоторые аспекты использования микросателлитов в свиноводстве// Достижения науки и техники АПК. - 2010. - № 8. - С. 38-41.
5. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D .Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. - Vol. 20. - P. 176-183.
6. Joshi S.P., Gupta V.S., Aggarwal R.K., Ranjekar P.K., Brar D.S. Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by intersimple sequence repeat (ISSR) polymorphism in the genus Oryza//Theor. Appl. Genet. - 2000. - Vol. 100. - P. 1311-1320.
7. Archibald J.K. The utility of automated analysis of Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) loci for resolving relationships in the Canary island species of Tolpis (Asteraceae) //American Journal of Botany. - 2006. - Vol. 93. - P. 1154-1162.
8. Nagaraju J., Kathirvel M., Subbaiah E. V., Muthulakshmi M., Kumar L.D. FISSR-PCR: a simple and sensitive assay for high throughput genotyping and genetic mapping//Molecular and Cellular Probes. - 2002. - Vol.16. - P. 67-72.
9. Зиновьева Н.А., Попов А.Н., ЭрнстЛ.К., Марзанов Н.С., Бочкарев В.В., Стрекозов Н.И., Брем Г. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. - Дубровицы: ВИЖ, 1998. - 47 с.
development of system for MuLTiPLEx ANALYsis of PiG issR-MARKERs
T.E. Deniskova, E.A. gladyr, E.l. sizareva, N.A. Zinovieva.
summary. The system for analysis of pig DNA-markers on base of inter-simple sequence repeat (ISSR) was developed. The system is based on PCR amplification with fluorescent labeled primers ISSR-6 and ISSR-2 and the consequent multiplex laser detection of PCR products using DNA Analyzer. Created binary DNA matrix of ISSR profiles was analyzed using GenAlEx, v6.4 software. The study of large white, landrace and duroc breeds (n=47) showed the high degree of polymorphism of ISSR-markers: 80.8 per cent of 568 identified loci were polymorphic. The all of picks identified were observed with the frequency of 5 per cent and thus were informative. The minimal number of picks was identified in landrace breed: 199 and 195 for ISSR-6 and ISSR-2 primers, respectively. The number of identified picks in large white breed was 214 and 274 and in duroc breed - 210 and 291, respectively. The landrace breed was characterized by minimal heterozygote level - 23.3 per cent whereas the values of this characteristic in large white and duroc breeds were 26.7 and 27.0 per cent, respectively. The private picks were identified in each breed analyzed: their number in large white, landrace and duroc breeds was 15, 36 and 54, respectively. The developed system of ISSR-analysis will be used for characteristics of allele pool of pig breeds. Key words: ISSR-markers, polymorphism, biodiversity, pig breeds
5 % (рис. 2), что свидетельствует об их информативности. Для каждой из пород обнаружены приватные пики, число которых у свиней породы ландрас было равно 15, крупная белая - 36, дюрок - 54. Однако для подтверждения их породоспецифичного характера требуются дальнейшие исследования на животных других популяций.
выводы. Таким образом, в ходе проведенных
рис. 2. Структура пиков в исследуемых породах свиней: ■ - число пиков; □ - число приватных пиков; □ - число пиков
р> 5%; -о- - степень гетерозиготности, %.
исследований разработана система анализа ISSR-маркеров, основанная на разделении и лазерной детекции продуктов амплификации на ДНК-анализаторе. Возможность одновременного анализа до 500 различных локусов, а также высокая степень полиморфизма анализируемых локусов (68,5.88,5 %), выявленная у свиней трех различных пород, позволяет рассматривать ее в качестве информативного инструмента для проведения популяционно-генетических исследований в свиноводстве.
Таблица. Количество полиморфных локусов по породам
Порода Праймер
ISSR-2 ISSR-2 ISSR-2 / ISSR-6
число локусов доля полиморфных, % число локусов доля полиморфных, % число локусов доля полиморфных, %
Крупная 214 86,6 274 85,4 488 85,9
белая
Ландрас 199 78,5 195 60,8 394 68,5
Дюрок 210 84,6 291 90,7 500 88,0
Среднее 83,3 78,9 80,8
