CC BY
176
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНыЕ СТАТЬИ
в КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 579.841.95:579.253]:577.21.08
М.И. Кормилицына, И.С. Мещерякова, Т.В. Михайлова молекулярно-генетическая характеристика штаммов FRANCISELLA
тьлштш, различающихся по таксономической принадлежности и
вирулентности
ФГБУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи Минздрава
России, Москва
Проведено типирование коллекционных штаммов Francisella tularensis с помощью полимеразной цепной реакции на основе гена tul4, кодирующего белок наружной мембраны 17 кД, и геномного региона различий RD1, что позволило осуществить видовую и внутривидовую идентификацию 112 изученных штаммов. Дифференциация штаммов F.tularensis, различающихся по вирулентности, осуществлена на локусах генов, кодирующих пили 4-го типа: pilA, pilE2, pilE3, pilE4, pilE5, pilF, pi1т, pilD и pilQ. Показана возможность дифференциации штаммов F. tularensis в ПЦР на основании обнаружения гена pilA в вирулентных штаммах трех подвидов F.tularensis и F.tularensis subsp. novicida. Ген pilA не выявлен у вакцинного штамма 15НИИЭГ и его вариантов, а также у большинства авирулентных штаммов F. tularensis subsp. holarctica. У аттенуированных штаммов F. tularensis subsp. tularensis и mediasiatica обнаружен фрагмент гена pilA. По остальным генам пилей никаких различий между штаммами F. tularensis не обнаружено, за исключением штамма F. tularensis subsp. novicida Utah112, у которого фрагмент гена pilE2 не определялся. Выявление гена pilA в полимеразной цепной реакции позволяет отличить вирулентные штаммы F. tularensis subsp. holarctica от вакцинного штамма 15НИИЭГ, его вариантов и авирулентных штаммов.
К л ю ч е в ы е с л о в а : Francisella tularensis, видовая, под-видовая идентификация, вирулентность, полимеразная цепная реакция, гены tul4, RD1, pilA, pilE2, pilE3, pilE4, pilE5, pilF, pilT, pilD и pilQ
Туляремия - природно-очаговая зоонозная инфекция, широко распространенная в странах умеренного климатического пояса Старого и Нового Света. Этиологическим агентом туляремии является патогенный микроорганизм Francisella tularensis (Bergey's Manual of Systemic Bacteriology [17]). Вид F. tularensis включает 4 подвида: F. tularensis subsp. tularensis (неарктический), F.tularensis mediasiatica (среднеазиатский), F. tularensis subsp. holarctica (голарктический), который представлен тремя биоварами: japonica, I Erys и II Eryr [12], а также F.tularensis subsp. novicida (novicida-like) [17]. F. tularensis - факультативный внутриклеточный микроорганизм, который обладает высоким уровнем инфекциозности для человека. Подвиды F.tularensis различаются по вирулентности для человека и животных: высоковирулентный - F.tularensis subsp. tularensis; умеренно вирулентные - F. tularensis subsp.media-siatica, F.tularensis subsp.holarctica [12] и F. tularensis subsp. novicida /novicida-like/ - малопатогенный для человека и вызывающий туляремиеподобное заболевание у лиц с иммунодефицитом [2, 10].
Одним из методов идентификации внутривидовых таксонов (подвидов) F. tularensis является амплификация в полимеразной цепной реакции (ПЦР) высоковариабельного геномного региона различий - RD1 [4]. Впервые о секвенировании полного генома туляремий-
ной бактерии было сообщено Р. Larsson и соавт. в 2005 г. [11]. До настоящего времени, однако, в литературе недостаточно данных о факторах вирулентности Е tularensis и о генах, кодирующих эти факторы. Одним из факторов вирулентности многих микроорганизмов признаются гомологи генов пилей - многофункциональных, гибких, волокнистых поверхностных структур бактериальной клетки. Обнаружено, что геномы всех подвидов Е. Ш1аг-ет\ъ включают кластеры генов, кодирующих пили 4-го типа (п4т) [8, 11]. При этом выявлены потенциальные различия в генах, кодирующих блок пилей, штаммов разных подвидов Е. tularensis, в том числе вакцинного штамма LVS [5, 11, 13, 15]. Отмечено, что некоторые мутации в генах п4т изменяли вирулентность Е. tularensis для мышей [5, 6, 9, 18]. Так, АХ. Forslund и соавт. [6, 7] установили, что РИА - поверхностно локализованный белок (пилин), кодируемый геном рИЛ (регион RD19), является необходимым для реализации вирулентных свойств Е. tularensis subsp. holarctica и tularensis для мышей при подкожном введении. Некоторые аттенуирован-ные штаммы Е. tularensis subsp. holarctica - вакцинный штамм LVS и штамм FSC074 утратили ген рИЛ в результате делеции [6, 14, 16]. Основываясь на этих данных, можно предположить, что выявленные различия в генах п4т могут быть, по крайней мере частично, ответственными за вирулентность возбудителя туляремии.
Цель работы - идентифицировать штаммы Егап-cisella tularensis разной таксономической принадлежности на основе ПЦР к генам ш14 и геномного региона различий RD1, а также дифференцировать штаммы по вирулентности генов пилей (рИЛ, рИЕ2, рИЕЗ, рйЕ4, рИЕ5, рИЕ, рйТ, pilD и рИО).
Материалы и методы
Штаммы. В работе использованы коллекционные штаммы микроорганизмов лаборатории туляремии Francisella разной таксономической принадлежности и вирулентности. Штаммы Е tularensis были изолированы из различных источников, различались географическим местом и временем выделения, биологическими свойствами, включая вирулентность. Штаммы хранили в лиофилизированном состоянии или на желточной среде МсСоу; культивировали на цистин-сердечном агаре с гемоглобином США) при температуре 37оС в течение 1-2 сут. Суспензию клеток (~109 м.к. в 1 мл 0,9% раствора №С1) инакти-вировали при температуре 98-99оС в течение 20 мин.
Полимеразная цепная реакция. Для выделения ДНК применяли наборы «Проба-НК» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология») или «ДНК-ЭКСПРЕСС» (ООО «НПФ Литех»).
Праймерную пару TUL4G Forward/Revers (5'-3'): GCAG-GTTTAGCGAGCTGTTCTACTC /AGCTGTCCACTTACCGCTA-
ЭКСПЕPИMЕHTАЛЬHЫЕ СTАTЬИ
Таблица 1
Видовая и внутривидовая идентификация штаммов F. tularensis в ПЦР с праймерами к генам tul4 и RD1
tul4 RD1
Вид, подвид (биовар) Francisella наличие амплификации/ количество исследованных размер ампликона наличие амплификации/ количество исследованных размер ампликона,
штаммов н. п. штаммов н. п.
F. tularensis subsp. holarctica +/69 +/88 924
F. tularensis subsp. holarctica {japónica) +/5 +/5 1135
F. tularensis subsp. mediasiatica +/8 +/8 1453
F. tularensis subsp. tularensis +/7 357 +/6 1522-1523
F. tularensis subsp. novicida, штамм Utah 112 +/1 +/1 3322
F. tularensis subsp. novicida /novicida- like +/2 -/2 -
F. philomiragia -/2 - -/2 -
П р и м е ч а н и е . (+) - наличие, (-) - отсутствие специфического ПЦР-продукта.
CAGAAG использовали для детекции локуса гена tul4 (lpnA), кодирующего иммуногенный эпитоп белка с молекулярной массой 17 кД наружной мембраны F. tularensis [1]. Количество исследованных штаммов Francisella в ПЦР с праймером TUL4G - 94. Для выявления высоковариабельного геномного региона различий RD1 применяли праймеры RD1, предложенные M. Broekhuijsen и соавт. [4]. Количество исследованных штаммов Francisella в ПЦР с праймером RD1 - 112.
Для амплификации специфических локусов генов пилей были выбраны следующие праймеры: А, В - для гена pilA, PE2-81F и PE2-294R - pilE2, PE3-88F и PE3-313R - pilE3, PE4-91F и PE4-339R -pilE4, PE5-119F и PE5-283R -pilE5, PF-667F и PF-1030R -pilF, PT-186F и PT682R - pilT, PD-38F и PD-198R - pilD, PQ-1259F и PQ-1547R -pilQ. Последовательность олигонуклеотидов А, В и номенклатура гена - pilA дана по [6], остальных генов пилей - по [8]. Все праймеры были синтезированы НПК "Синтол" (Россия).
Для выявления гена pilA исследовано 45 штаммов: F. tularensis subsp. holarctica (биовары Erys иЕгуг и japónica) - 15 вирулентных, 1 аттенуированный природный изолят, 1 вакцинный штамм 15НИИЭГ (15/10) и его варианты - 15/10 Doxr40-Rifr40, 15/10 № 83 ts42o, 6 рекомбинантных 15pACYCFNLtul4
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК штаммов внутривидовых таксонов F.tularensis в ПЦР на мишень региона различий RD1. Штаммы F. tularensis: 503, F. tularensis subsp. holarctica - 1; Kosho, F.t. subsp. holarctica (japónica) - 2; 543, F.t. subsp. mediasiatica - 3; Schu, F.t. subsp. tularensis - 4; Utah 112, F.t. subsp. novicida - 5. Маркер OGene Ruler (Fermentas) и маркерные фрагменты (н. п.) - 6.
и 15pACYCFNLtul4-85A, а также 7 авирулентных; F. tularensis subsp. mediasiatica - 2 вирулентных и 1 аттенуированный; F. tularensis subsp. tularensis - 2 вирулентных и 3 аттенуированных; F. tularensis subsp. novicida (novicida-like) - 3; F. philomiragia - 2. Для идентификации генов пилей pilF исследовано 37 штаммов, pilE3, pilE4, pilE5, pilF, pilT; pilD, pilQ - 28 штаммов указанных выше таксонов разной вирулентности.
С целью одновременной видовой идентификации и характеристики штаммов F. tularensis четырех подвидов по вирулентности была использована мультиплексная ПЦР (2 праймерные пары в одной реакции: Tul4G и А, В). Количество исследованных штаммов составляло 22, включая вакцинный штамм 15НИИЭГ и 2 его варианта (15/10 Doxr40Rif40, 15/10 № 83 ts42o).
Реакционная смесь для проведения ПЦР состояла из 2,5 мкл 10х стандартного Tag-буфера (pH 8,6); 250 мкМ/мкл каждого дНТФ (200 мкМ/мкл для тест-системы RD1); 12 pM каждого праймера в пробе, деионизированной воды и фермента: 1,25 ед. SynTaq ДНК-полимераза с ингибирующими активность фермента антителами (НПК "Синтол") или ColoredTag полимераза (ЗАО "Силекс") с добавлением 5 мкл ДНК-матрицы (конечный объем смеси 25 мкл). ПЦР проводили в многоканальном ДНК-амплификаторе "Терцик" (ЗАО "НПФ ДНК-Технология"), используя программу амплификации реакционных смесей: цикл I - 94оС - 5 мин, цикл II - (94о - 30 с, температура отжига - 30 с, 72оС - 60 с) х 30-40 циклов, цикл III -72оС - 3 мин и 10оС - режим хранения; температура отжига составляла 59оС с праймерами AB/PE5/PD/PF, 60оС - TUL4G/RD1/PE3, 61о - PE2/PT/PQ; 64о - PE4. Результаты ПЦР регистрировали методом горизонтального электрофореза в 0,7 - 1,5% агарозном геле при постоянном напряжении 150 В в однократном буфере ТВЕ (pH 8,0) с окрашиванием раствором этидия бромида в концентрации 0,5 мкг/мл. Использовали камеру для горизонтального электрофореза (DNA Sub Cell, Bio-Rad, США). После проведения электрофореза производили последующее фотографирование (с помощью видеосистемы DNA Analyzer, Россия) в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе ECX-15M (Vilber Lourmat, EEC).
Результаты и обсуждение
Видовая и внутривидовая идентификация штаммов Francisella. Использование в ПЦР праймеров к гену tul4 позволило выявить специфический фрагмент гена размером 357 н. п. у всех штаммов F.tularensis четырех подвидов (табл. 1).
В результате исследования штаммов F. tularensis в ПЦР с праймерами к RD1 были получены продукты амплификации ДНК разных размеров: 924, 1135, 1453, 1522-1523 и 3322 н. п. (см. табл. 1, рис. 1). На основании различий в размерах ампликонов в ПЦР с праймерами к RD1 были дифференцированы штаммы F. tularensis четырех подвидов: F. tularensis subsp.
Таблица 2
Дифференциация штаммов F. tularensis, различающихся по вирулентности, в ПЦР с праймерами к гену pilA
Наличие ам-
Вид, подвид (биовар) Francisella Штаммы плификации/ количество
исследованных штаммов
F. tularensis subsp. holarctica Вирулентные +/13
Аттенуированный +/1
природный изолят
Вакцинный 15НИ- -/9
ИЭГ, его варианты
и рекомбинантные
вакцинные
Авирулентные -/6, +/1
F. tularensis subsp. holarc- Вирулентные +/2
tica (japónica)
F. tularensis subsp. media- Вирулентные +/2
siatica Авирулентные +/1
F. tularensis subsp. tularensis Вирулентные +/2
Аттенуированные +/2
Авирулентные + /1
F tularensis subsp. novicida Умеренно виру- +/1
штамм Utah 112 лентный
F. tularensis subsp. novicida Слабовирулентные +/2
/novicida- like/
F. philomiragia Слабовирулентные -/2
П р и м е ч а н и е . (+) - наличие специфического ПЦР-продукта с размером ампликона ~500 н. п.; (-) - отсутствие специфического ПЦР-продукта.
holarctica, F. tularensis subsp. mediasiatica, F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. novicida. Кроме того, ПЦР с праймерами к RD1 позволила дифференцировать штаммы F. tularensis subsp. holarctica биовара japónica от других штаммов этого подвида. Штаммы F. tularensis subsp. novicida(-like) не были определены с помощью праймерной пары RD1, что свидетельствовало о необходимости подбора специфических праймеров для идентификации подобных штаммов (см. табл. 1).
В штаммах F. philomiragia не выявлено специфических продуктов амплификации при использовании ДНК мишеней tul4 и RD1, что подтверждает таксономическую самостоятельность этого вида.
Таким образом, молекулярно-генетическое ти-пирование штаммов франциселл с помощью ПЦР с праймерами к генам tul4 и RDI позволило осуществить видовую и внутривидовую идентификацию изученных штаммов.
Дифференциация штаммов F.tularensis по вирулентности на мишенях генов п4т. С целью выявления различий штаммов F. tularensis по вирулентности были исследованы некоторые локусы генов пилей F. tularensis. При использовании праймеров А, В ген pilA был обнаружен у всех вирулентных штаммов F. tularensis трех подвидов и F. tularensis subsp. novicida. Размер выявленного ампликона гена pilA составил ~500 н.п. и соответствовал предсказанному по сиквен-су [6]. При этом ген pilA не был обнаружен у вакцинного штамма 15НИИЭГ (15/10), его вариантов и большинства авирулентных штаммов F. tularensis subsp. holarctica (рис. 2). Исключение составили 2 штамма F. tularensis subsp. holarctica: 268 (природный аттенуиро-
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК штаммов F. tularensis в ПЦР на мишени гена pilA.
Штаммы F. tularensis subsp. holarctica: 503, вирулентный - 1; 503-av - 2; 80-Я, вирулентный - 3; 15НИИЭГ, вакцинный - 4; 86-Б, вирулентный - 5; 15pACYCFNLtul4, рекомбинантный - 6; отрицательный контроль (дист. H2O) - 7. Маркер O'Gene Ruler ("Fermentas") и маркерные фрагменты (н. п.). - 8.
ванный изолят) и 21/400 (авирулентный штамм), 4 ат-тенуированных штамма Е tularensis subsp. tularensis и mediasiatica, у которых ген рИА был выявлен (табл. 2).
Таким образом, использование ПЦР с праймерами к гену рИА позволило дискриминировать вирулентные штаммы Е. tularensis subsp. ЫШгсЫса и вакцинный штамма 15НИИЭГ, его варианты и авирулентные штаммы. Отсутствие амплификации ДНК-мишени гена рИА вакцинного штамма 15НИИЭГ свидетельствует об утрате этого гена, что, по-видимому, является одной из генетических причин аттенуации штамма 15НИИЭГ, как и в случае с LVS (производного от штамма 15НИИЭГ) [6, 13, 14].
Исследование штаммов Е tularensis четырех подвидов позволило выявить гены пилей: рЛЕ2, рИЕЗ, рИЕ4, рйЕ5, рйЕ, рИТ, pilD и pilQ, продукты амплификации которых составили 214, 226, 248, 164, 364, 497, 161 и 289 н.п. соответственно. Фрагмент генарИЕ2 не был выявлен только у одного исследованного штамма Е. tularensis subsp. novicida Ц;аЫ12, что соответствует данным, обнаруженным в базе данных GenBank (ЫС-В1, RefSeq ЫС_008601.1).
Обнаружение фрагмента гена рИА у вирулентных штаммов Eшlarensis subsp. ЫШгсЫса и отсутствие его у вакцинного штамма 15 НИИЭГ, его вариантов и ави-
Рис.3. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК штаммов F. tularensis в мультиплексной ПЦР на мишенях генов tul4 и pilA.
Штаммы F. tularensis: 15/10 Doxr40Rifr40, вариант вакцинного - 2; 15/10 № 83 ts42o, вариант вакцинного - 3; 15НИИЭГ, вакцинный - 4. 38-a, авирулентный F.t. subsp. tularensis - 5; 543-а, авирулентный F.t. subsp. mediasiatica - 6; 1-Тв, вирулентный F.t. subsp. holarctica - 7. Маркер O'Gene Ruler ("Fermentas") и маркерные фрагменты (н. п.) - 1.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
рулентных штаммов свидетельствует о роли генаpilA в вирулентности туляремийных бактерий. Известно, что компонент белковой секреции - пилевая субъединица PilA - участвует во взаимодействии с клетками/тканью хозяина, что облегчает распространение туляремийных бактерий от начального периферийного сайта инфекции [6]. A.L. Forslund и соавт. [6, 7] в эксперименте на мышах показали роль белка PilA в вирулентности F. tularensis subsp. holarctica и tularensis.
В экспериментах с делеционными мутантами Schu S4 F. tularensis subsp. tularensis и LVS показана роль гена pilE4, pilE5 и pilE6 [3]. Так, генpilE4 необходим для экспрессии п4т двух подвидов (tularensis и holarctica), гены pilE5 и рИЕ6 были необязательны в продукции пилей. Мутанты LVS pilE5 и pilE6 были значительно аттенуированы по сравнению с диким типом в отличие от мутантов Schu S4, которые были вирулентными для мышей [3]. Выявлено, что делеция в гене pilF или pilT штамма LVS приводила к умеренной аттенуации мутантов при внутрикожном заражении мышей, полной потере пилей и дефекту в клеточной адгезии [5]. Мутанты pilT Schu S4 не оказывали никакого воздействия на вирулентность при подкожном заражении мышей [7]. Гены pilC и pilQ требуются для полной вирулентности высоковирулентного штамма подвида tularensis [7].
В наших исследованиях у всех штаммов F. tularensis было обнаружено присутствие генов: pilE2, pilE3, pilE4, pilE5, pilF, pilT, pilD и pilQ. При этом отмечено, что ген pilE2 в штамме Utah112 F. tularensis subsp. novicida не определялся в ПЦР с праймерной парой PE2-81F/PE2-294R, что может служить одним из маркеров в генетической паспортизации штамма F. tularensis subsp. novicida Utah112.
Видовая идентификация и дифференциация штаммов F. tularensis по вирулентности в мультиплексной полимеразной цепной реакции. С целью одновременной видовой идентификации и выявления аттенуированных штаммов F.tularensis было исследовано 22 штамма четырех подвидов в ПЦР с праймерными парами Tul4G и А, В. У 17 из них было выявлено 2 типа амплифици-рованных фрагментов ДНК: 357 и ~500 н. п., соответствующих локусам двух генов - tul4 и pilA. У 5 штаммов F. tularensis subsp. holarctica (вакцинные и авирулент-ный) обнаружен фрагмент, соответствующий локусу tul4, и не выявлен ген pilA (357 н.п.), что свидетельствует о возможной делеции гена pilA (рис.3). Результаты мультиплексной ПЦР показывают возможность одновременной идентификации вида F. tularensis и дискриминации штаммов голарктического подвида по вирулентности.
Таким образом, полученные результаты позволили осуществить видовую и внутривидовую идентификацию штаммов F. tularensis с использованием ДНК-мишеней tul4 и RD1 и дифференцировать штаммы F. tularensis subsp. holarctica по вирулентности на основании обнаружения гена п4тpilA в вирулентных штаммах. Полученные результаты вносят определенный вклад в изучение генов F.tularensis, ответственных за вирулентность, и могут служить основой для характеристики новых кандидатных вакцинных штаммов.
Сведения об авторах:
Кормилицына Марина Ильинична - канд. биол. наук., ст. науч. сотр. лаб. туляремии ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, e-mail: [email protected];
Мещерякова Ирина Сергеевна - д-р биол. наук, зав. лаб. туляремии ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России.
Михайлова Татьяна Владимировна - канд. биол. наук., ст. науч. сотр. лаб. туляремии ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России.
ЛИТЕРАТУРА
1. Каджаев К.В., Кормилицына М.И., Демидова Т.Н., Мещерякова И.С. // Актуальные аспекты природно-очаговых болезней. Омск; 2001: 152-3.
2. МещеряковаИ.С., КормилицынаМ.И., РодионоваИ.В., Константинова Н.Д. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1995; 5: 3-8.
3. Ark N.M., Mann B.J. Microb. Pathog. 2011; 51: 110-20.
4. Broekhuijsen M., Larsson P., Johansson A. et al. J. Clin. Microbiol. 2003; 41: 2924-31.
5. Chakraborty S., MonfettM, Maier T.M. et al. Infect. Immun. 2008; 76: 2852-61.
6. Forslund A.L., KuoppaK, SvenssonK. et al. Mol. Microbiol. 2006; 59: 1818-30.
7. Forslund A.L., Salomonsson E.N., GolovliovI. et al. BMC Microbiol. 2010; 26: 227.
8. GilH., Benach J.L., Thanassi D.G. Infect. Immun. 2004; 72: 3042-7.
9. Hager A.J., Bolton D.L., Pelletier M.R. et al. Mol. Microbiol. 2006; 62: 227-37.
10. Hollis D.G., Weaver R.E., Steigerwalt A.G. et al. J. Clin. Microbiol. 1989; 27: 1601-8.
11. Larsson P., Oyston P.C., Chain P. et al. Nat Genet. 2005; 37: 153-9.
12. OlsufievI.S., MeshcheryakovaI.S. Intern. J. Syst. Bact. 1983; 872-4.
13. RohmerL., BrittnacherM, SvenssonK. et al. Infect. Immun. 2006; 74: 6895-06.
14. SalomonssonE., KuoppaK, Forslund A.L. et al. Infect. Immun. 2009; 77: 3424-31.
15. SalomonssonE., ForslundA.L., ForsbergА. Front. Microbiol. 2011; 2: article 29.
16. Svensson K., Larsson P., Johansson D. et al. Bacteriol. 2005; 187: 3903-8.
17. SjöstedtA. GenusI. FrancisellaDorofe'ev 1947, 176AL. /In: Brenner D.J., Krieg N.R., Stalley J. T., Garriti G.M. eds. Bergey's manual of systematic bacteriology, 2-nd ed. New York: Springer; 2005: 200210.
18. Zogaj X., Chakraborty S., Liu J., et al. Microbiology. 2008; 154 (7): 2139-50.
Поступила 07.08.12
THE MOLECULAR AND GENETIC CHARACTERIZATION OF FRANCISELLA TULARENSIS STRAINS OF DIFFERENT TAXONOMIC STATUS AND VIRULECE
M.I. Kormilitsyna, I.S. Meshcheryakova, T.V. Mikhailova
Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow
Typing of Francisella strains collection by means of PCR on the basis of tul4 and RD1 genes was carried out. The identification of the species and subspecies of the 112 strains of Francisella tularensis was reashed. The PCR on DNA-targets loci of type IV pili genes: pilA, pilE2, pilE3, pilE4, pilE5, pilF, pilT, pilD and pilQ for differentiation of F.tularensis strains on virulence was carried out. It was demonstrated the possibility of differentiation of F.tularensis strains in PCR (primers A-В) on the basis of the revelation of the gene pilA in virulent strains of third subspecies F.tularensis and F.tularensis subsp. novicida. This gene pilA was not detected in the vaccine strain 15/10 and its variants, as well as in the most of avirulent F.tularensis subsp.holarctica strains. However, the fragment gene pilA was found in the attenuated strains F.tularensis subsp.tularensis and mediasiatica. It was not revealed any differences on other targets of pili genes between ofF.tularensis strains, with the exception of the strain F.tularensis subsp. novicida Utah112, which had not a fragment of the gene pilE2. The use of PCR to target the locus of the pilA gene allows to discriminate virulent F.tularensis subsp.. holarctica strains from the vaccine 15/10, its variants and avirulent strains. K e y w o r d s: francisella tularensis, species, subspecies, identification, virulence, PCR, tul4, RD1, pcilA, pilE2, pilE3, pilE4, pilE5, pilF, pilT, pilD and pilQ genes
