CC BY
30
УДК 581.5, 581.
© т. Нень 1, ю. В. михайлова 2, м. Ф. Шишова1
1 ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»;
2 Ботанический институт им. В. Л. Комарова РАН, Санкт-Петербург
Вакуолярная Н+-АТФаза представляет собой мультисубъединичный белковый комплекс, выполняющий целый ряд ключевых функций в растительной клетке. Известны различные механизмы регуляции активности данного протон-транспортирующего фермента как на транскрипционном, так и на посттрансляционном уровне. В данной работе впервые проведен моле-кулярно-филогенетический анализ аминокислотных последовательностей субъединиц вакуолярной Н+-АТФазы для выявления степени консервативности мембранного и периферического комплексов фермента. Показана высокая консервативность субъединиц с, d и В, а также древние дупликации в эволюции субъединицы а.
С Ключевые слова: Н+-АТФаза; тонопласт; вакуоль; активность фермента; филогенетический анализ.
Поступила в редакцию 03.09.2015 Принята к публикации 31.12.2015
MOЛEKУЛЯPНO-ФИЛOГEНETИЧECKИИ АНАЛИЗ CУБЪEДИНИЦ Н+-АТФазы ТОНОПЛАСТА
ВВЕДЕНИЕ
Вакуолярная Н+-АТФаза (V-АТФаза) растительных клеток представляет собой основной потенциал-генерирующий фермент, локализованный на то-нопласте и обеспечивающий движущую силу, заключающуюся в протонном градиенте, для транспорта различных ионов и метаболитов в вакуоль. Накоплен ряд данных, указывающих на универсальность организации и функционирования V-АТФаз у эукариотических клеток (Finbow, Harrison, 1997), а также их сходство с АТФ-синтазами (F-АТФазами) митохондрий и хлоро-пластов (Ratajczak, 2000). Эти ферментные комплексы используют способ ротационного взаимопревращения энергии макроэргической связи и энергии протонного градиента (Song et al., 2013). Нарушение работы этого фермента зачастую приводит к смерти организма или к появлению серьезных аномалий развития. Однако при всей функциональной значимости работы вакуолярной протонной помпы закономерности ее сборки (соподчинение субъединиц и изменение изоферментного состава), а также способы регуляции ее активности практически не изучены.
Согласно современным представлениям, вакуолярная Н+-АТФаза состоит из двух доменов: периферического (V1) и интегрального мембранного (V0). Домен V1 осуществляет гидролиз АТФ, а V0 выполняет функцию транспорта протонов (Beyenbach, Wieczorek, 2006; Martinoia et al., 2007).
Субъединицы домена Vx
Домен V1 представляет собой структуру «головки на стержне» и включает в себя восемь субъединиц: А, В, С, D, Е, F, G и Н.
Молекулярная масса (ММ) субъединицы А составляет от 68,5 до 68,8 кДа у разных видов растений. Она содержит нуклеотид-связывающий сайт. При связывании аналогов аденина — 7-хлоро-4-нитробензо-2-оксо- 1,3-диазо-ла (Randall, Sze, 1987), флуоресцеин-5'-изотиоцианата (Tzeng et al., 1992) или N-этилмалеимида (Randall, Sze, 1987; Wang, Sze, 1985) с субъединицей А происходит ингибирование гидролиза АТФ, что доказывает ее каталитическую функцию.
Молекулярная масса субъединицы В — от 53,7 до 54,7 кДа. Субъединица В также содержит нуклеотид-связывающий сайт. Однако связывание фотоактивированного АТФ-аналога 3-О-(4-бензоил)бензоиладенозин-5 Р-три-фосфата не подавляет гидролиз АТФ (Manolson et al., 1985), что указывает на то, что субъединица В является субстрат-связывающей, но не каталитической. Предполагается, что она осуществляет регуляторную функцию.
Остальные субъединицы V1-комплекса образуют два стержня разного типа — центральный (D- и F-субъединицы) и периферический (С-, Е-, G- и Н-субъединицы), которые соединяют домены V1 и V0 (Cipriano et al., 2008).
Субъединица С, входящая в состав периферического стержня, имеет ММ 37—52 кДа (Ratajczak, 2000). Она играет ключевую роль в обратимой сборке V-АТФазы и в осуществлении сопряжения работы V1 и V0 (Hong-Hermesdorf et al., 2006). В структуре субъединицы С выделяют три домена — глобулярный «Head», удлиненную «шейку» и глобулярный «foo^-домен. «Head»^-мен связывается с комплексом V1, а два других — с V0. Показано, что субъ-
единица с вакуолярной Н+-АТФазы арабидопсиса имеет сайт связывания адениновых нуклеотидов, в результате чего происходят изменения в ее структуре (Armbrüster et al., 2005).
Субъединица D с ММ 29,1 кДа входит в состав центрального стержня, соединяющего домен V0 с головкой домена Vp и принимает участие в сопряжении гидролиза АТФ и транспорта протонов (Ratajczak, 2000).
Субъединица Е входит в состав периферического стержня фермента, который участвует в стабилизации связи Vj-комплекса с заякоренным в мембране доменом V0 (Strompen et al., 2005, Dettmer et al., 2010).
Субъединица F (ММ 13 кДа) является частью центрального стержня и играет важную роль в сопряжении гидролиза АТФ и транспорта протонов. Предположительно эта субъединица подвергается конформационным изменениям в ходе катализа (Basak et al., 2011).
Субъединица G (ММ 12,2 кДа) является частью периферического стержня Vp отвечающего за сопряжение процессов гидролиза АтФ и транспорта протонов (Ratajczak, 2000). Полипептид, который представляет собой G-субъединицу вакуолярной Н+-АТФазы Avena sativa, остается при домене V0 после диссоциации V1 (Ward, Sze, 1992). Это указывает на тесный контакт субъединицы G с мембранным интегральным доменом фермента. В составе V-АТФазы субъединица G присутствует в форме гомодимера.
Субъединица н требуется для связывания домена V1 с V0 (периферический стержень), а также для активации V-АТФазы (Kluge et al., 2003).
Субъединицы домена F
^-домен V-АТФаз включает в себя до шести субъединиц: a, c, c', c'', d и e (Gaxiola et al., 2007). Однако у растений в геноме не были обнаружены гены, кодирующие субъединицу c', а в тонопластном протеоме не обнаружены субъединицы c'' и е, что указывает на отсутствие этих субъединиц в составе вакуолярной Н+-АТФазы (Schumacher, Krebs, 2010). Предполагается, что субъ-
единицы c ' ' и е принимают участие в сборке и, возможно, в определении локализации фермента (эндоплазмати-ческий ретикулум и аппарат Гольджи), а не в транспорте протонов (Seidel et al., 2008).
Субъединица а трансмембранного домена (ММ 95 кДа) взаимодействует своим цитозольным участком с субъединицей А периферического домена и с периферическим стержнем фермента (Padmanaban et al., 2004). Это самая крупная субъединица ферментного комплекса, принимающая участие как в формировании периферического стержня, так и в транспорте протонов (Hanitzsch et al., 2007).
Основным компонентом V -домена тонопласт-ной протонной АТФазы, непосредственно вовлеченным в транспорт протонов, является субъединица с. Она представляет собой гидрофобный белок, содержащий четыре трансмембранных домена (Lai et al., 1991). В составе фермента шесть с-субъединиц, образующих кольцо, вращение которого ответственно за процесс перемещения протонов (Hirata et al., 2003).
Субъединица d — единственная гидрофильная субъединица интегрального домена. Она является частью центрального стержня V-АТФазы и важна для ротационного механизма фермента. Для Vigna radiata было продемонстрировано, что комплекс V в отсутствие субъединицы d представляет собой пассивный протонный канал (Ouyang et al., 2008).
Гены, кодирующие вакуолярную Н+-АТФазу, идентифицированы во всех растительных геномах, которые были секвенированы к настоящему времени. Все субъединицы, идентифицированные в геноме дрожжей, кроме субъединицы c обнаружены у растений, причем многие из них кодируются небольшими семействами генов. Суммарное количество генов субъединиц протонной АТФазы тонопласта составляет от 14 у Chlamydomonas до 54 у сои. В геноме Arabidopsis thaliana обнаружено как минимум 26 генов, кодирующих субъединицы вакуолярной протонной АТФазы (Sze et al., 2002) (табл 1, 2). Кодирование небольшими семействами
Таблица 1
гены, кодирующие субъединицы домена Vj (по Sze et al., 2002)
Субъединица, Количество Количество Количество аминокислот
название гена генов экзонов в белке
А 1
VHA-A 20 623
В 3
VHA-81 12 486
VHA-E2 14 487
VHA-E3 14 485
с 1
VHA-С 11 375
D 1
VHA-D 1 261
Таблица l (Окончание)
Субъединица, Количество Количество Количество аминокислот
название гена генов экзонов в белке
E 3
VHA-El б 230
VHA-E2 5 235
VHA-ES б 237
F 1
VHA-F 4 128
G 3
VHA-Gl 3 110
VHA-G2 3 106
VHA-GS 3 108
H 1
VHA-H 11 441
Таблица 2
Гены, кодирующие субъединицы домена V0 (по Sze et al., 2002)
Субъединица, Количество Количество Количество аминокислот
название гена генов экзонов в белке
a 3
VHA-al 17 780
VHA-a2 18 821
VHA-aS 18 843
c 5
VHA-cl 3 164
VHA-c2 3 165
VHA-cS 3 164
VHA-c4 3 166
VHA-c5 3 164
c'' 2
VHA-c"l 4 180
VHA-c"2 4 178
d 2
VHA-dl 10 351
VHA-d2 10 351
e 2
VHA-el 3 70
VHA-e2 3 70
позволяет предположить родо- или даже видоспеци-фичную специализацию изоформ субъединиц V-АТФазы (Schumacher, Krebs, 2010).
Активность вакуолярной Н+-АТФазы регулируется многими факторами окружающей среды, поэтому V-АТФазу высших растений называют «эко-ферментом» (Luttge et al., 2001). Для фермента показана возможность модуляции активности посредством изменения количества ферментных комплексов в составе тонопласта, а также изменения его субъединичного состава. Имеется ряд данных об изменении экспрессии генов, кодирующих субъединицы фермента, и о посттрансляционных модификациях.
Для Suaeda salsa, галофита из семейства Chenopodiaceae, было показано, что основной стратегией устойчивости к солевому стрессу у данного вида является увеличение количества ферментных комплексов, а не изменения их структуры (Wang et al., 2001).
При повышении солености и индукции САМ-мета-болизма у Mesembryanthemum crystallinum наблюдали ряд изменений V-АТФазы: 1) количество и активность фермента повышались (Bremberger, Lüttge, 1992; Ratajczak et al., 1994); 2) соотношение транспорта протонов и гидролиза АТФ уменьшалось (Ratajczak, 2000); 3) увеличивался диаметр Vjj-домена (Klink, Lüttge, 1992;
Rockel et al., 1994), что сопровождалось возрастанием количества с-субъединиц и количества их мРНК (Rockel et al., 1998); 4) в стержне появлялись две новые субъединицы, которые являются продуктом модификации субъединицы В специфической протеазой или активными формами кислорода (Zhigang et al., 1996; Krisch et al., 2000); 5) V1-домен на электронных микрофотографиях представлял собой как гексамерную, так и пен-тамерную структуру (Kramer et al., 1995), т. е. не всегда число субъединиц А и В было кратным трем. Представляется интересным то, что при засолении у Citrus происходит протеолитическое разрушение субъединицы А, а у M. crystallinum — субъединицы В.
Приведенные выше данные могут служить доказательством многообразия регуляторных механизмов, имеющихся у растений, в том числе путем изменения субъединичного состава ферментного комплекса. Наряду с этим, посттрансляционная регуляция может осуществляться и рядом других способов. Так, для Н+-АТФаз V-типа дрожжей, насекомых и млекопитающих характерен еще один механизм регуляции активности — обратимая диссоциация доменов V1 и V0 (Toei et al., 2010). У дрожжей этот процесс происходит при истощении запасов глюкозы в среде, а у насекомых во время линьки для поддержания количества АТФ в клетке. У млекопитающих диссоциация доменов V-АТФазы происходит в клетках почечного эпителия в ответ на изменения уровня глюкозы, однако физиологическое значение этого явления представляется менее понятным. Диссоциация происходит быстро, обратимо и не требует синтеза белков. Активность разделенных периферического и интегрального доменов блокируется. Диссоциированный V1-домен не гидролизует АТФ, а свободный Vjj-домен не осуществляет пассивного переноса протонов через мембрану (Jefferies, Forgac, 2008). При добавлении в среду глюкозы происходит сборка фермента. Диссоциация и сборка комплекса V-АТФазы не являются прямым отражением друг друга. Так, для диссоциации требуется участие сети микротрубочек, а для сборки — гетеротримерный белковый комплекс RAVE, стабилизирующий свободный V1-комплекс в форме, пригодной для объединения с V0. Роль в модуляции стабильности V^-комплекса может играть субъединица С, выступающая в качестве сенсора глюкозы (Beyenbach, Wieczorek, 2006). В контроле диссоциации V-АТФазы при понижении количества глюкозы в среде принимает участие экстраклеточный уровень рН: при щелочных значениях рН диссоци-
ации не происходит даже при низком уровне глюкозы, так как в этих условиях приоритетным процессом становится поддержание работы Н+-АТФазы для осуществления за-кисления вакуоли (Diakov, Kane, 2010). Сравнительно недавно такой способ регуляции, посредством обратимой диссоциации, был показан и для растений (Schnitzer et al., 2011). Тем самым данный процесс представляется универсальным и наиболее эволюционно древним.
В связи с очень сложными способами организации комплекса и его регуляции, а также в связи с наличием различных изоформ субъединиц, которые могут обладать не только ткане-, но и видоспецифичностью, возникает вопрос: каким образом сформировалось многообразие изоформ и насколько они изменчивы? Существуют ли общие закономерности эволюционных преобразований субъединиц, характерные для V1- и ^-комплексов? Для ответа на поставленные вопросы в данном исследовании впервые проведен молекулярно-филогенетиче-ский анализ аминокислотных последовательностей различных субъединиц вакуолярной Н+-АТФазы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Поиск аминокислотных последовательностей cубъ-единиц Н+-АТФазы тонопласта в базе данных GenBank (GenBank 13.07.2015) проводили с помощью алгоритма blastp (BLAST 10.12.2015; Madden, 2002). Преимущественно были использованы аннотированные последовательности из геномных проектов (известные и смоделированные последовательности белков), а также несколько последовательностей, полученных путем клонирования и секвенирования генов, кодирующих различные субъединицы Н+-АТФазы тонопласта. Отбирались только полные белковые последовательности, содержащие в своем составе характерные для данного белка домены pfam и мотивы для связывания субстратов. В некоторых случаях последовательности белков проверялись с помощью ресурса по белкам UniProt (The UniProt Consortium, 2015) и ресурса по геномам растений Phytozome 10.3 (Goodstein et al., 2012). Виды выбирались из разных групп цветковых растений (злаков, астерид и розид), чтобы результаты отражали эволюцию субъединиц у цветковых растений. Зеленая водоросль Chlamydamonas reinhardtii была использована как внешняя группа при филогенетических построениях. Список проанализированных последовательностей представлен в таблице 3.
Таблица 3
Исследованные аминокислотные последовательности
Субъединицы Номера последовательностей в GenBank
А XP 001698410, NP 178011, XP 009104562, XP 009128319, XP 009106605, XP 008462205 б XP 004141749, XP 003529464, NP 001242061, KHG19519, XP 007023681, XP 008380395, ABO33173, NP 001234287, NP 001234281, XP 006357450, XP 006362109, XP 009781359, AIS71897, NP 001058280, NP 001046054, ABD85016, EMS67961, XP 008645297, ACG48688, XP 008679916, AFW70345, AFW66324
Таблица 3 (Окончание)
Субъединицы
Номера последовательностей в GenBank
XP_001701846, NP_177729, NP_173451, NP_195563, NP_001190954, BAH19957, AAC36485, XP_009106252, XP_009103349, XP_00914951 1 XP_008447926, XP_008447927, XP_004144861, KGN43272, XP_003552473, XP_003534485, XP_006605856, XP_003536722, KHG25939, KHG14291, XP_012465281, XP_007036766, XP_007036767, XP_007017894, XP_008365054, XP_008365055, XP_008382093, XP_004231058, XP_004248643, XP_006364499, XP_006360894, XP_009783508, AAF26445, NP_001057902, NP_001044043, EAZ37403, EEC71367, EAZ01383, ABN54974, EMS55986, EMS59319, ACJ06627, NP_001148978, NP_001 152665, AFW76484_
XP_001696429, NP_563916, XP_009148561, XP_0091 18052, XP_0091 10617, XP_008463120, XP_004150739, KGN50885, XP_003553974, XP_003518129, XP_00659941 1, KHG11234, XP_007031994, XP_008379060, XP_004235295, XP_006363973, XP_00978691 1, NP_001056500, AAO72561, ABG23314, NP_001147632, NP_001 142247, XP_008654564, AFW81320, EMS67397
EDP01852, NP_191432, CAB46439, XP_0091 16556, XP_009104169, XP_008449506, XP_004140139, XP_003531738, XP_003530267, KHG05002, XP_007048793, XP_008380248, XP_008353645, XP_010322009, XP_006359140, XP_009786974, XP_009799285, NP_001054048, EAZ32174, AEH95771, EMS57781, NP_001131707, NP_001149703, NP_001151312, XP_008662802, ACF86079_
XP_001692936, XP_004245546, NP_192853, NP_187468, NP_176602, XP_009772790, XP_006343898
EDP07785, NP_192171, XP_009786189, XP_004233261, XP_006364993
G
CAA06756, BAD07544, DAA39513, DAA39514, CAA06757, EMS46087, XP_009773042, XP_003552499, XP_010316755, NP_001275137, XP_009770835, XP_004239677, XP_006345803, NP_186788, XP_009147429, KHG25904, XP_008442676, XP_008387598, NP_194102, XP_009137332, NP_194325, XP_009139721, XP_008444528, XP_004137818, XP_004137819, XP_004137820
EDP09300, EMS54494, BAC57732, ACG24799, NP_189791, XP_009138267, XP_008443236, XP_009792608, ELU44195, XP_004242619, KHG22602, XP_004162622, XP_008357072, XP_003548002, XP_006343605
XP_001695223, XP_001692167, NP_850122, NP_568051, NP_179736, AAK96647, XP_009140911, XP_009103695, XP_009133874, XP_009109504, XP_009140276, XP_009117405, XP_009149095, XP_008463888, XP_008448072, XP_004149561, XP_004148529, XP_004152666, XP_004168233, XP_004169002, XP_00354751 1, XP_006594994, XP_003539739, XP_003538035, XP_003527676, XP_003540986, XP_003537855, KHG14971, KHG00921, KHG13921, KHG00114, KHG13283, XP_007015509, XP_007017674, XP_007015511, XP_007017673, XP_007042075, XP_008358210 XP_004251275, XP_004241262, XP_004243162, XP_004230865, XP_006366398, XP_006365749, XP_006356756, XP_006362018, XP_009759132 XP_009769606, XP_009785999, NP_001044718, NP_001049572, EEE50667, EEC71752, EEC66656, CDM85023, AEH95770, XP_008653566, XP_008657093, XP_008660336
XP_001696361, NP_195198, NP_564098, NP_195603, NP_177693, NP_001 185404, NP_179244, AAA99934, NP_179244, XP_009109515, XP_006416453, XP_009103374, XP_009149488 XP_008444773, XP_004152663, XP_004152664, XP_004133996, XP_003543079, XP_003517187, XP_003520270, XP_006590717, NP_001276180, KHG25128, KHG04199, KHG23863, KHF97295, XP_007017703, XP_008391887, XP_008372768, XP_008387974, XP_008377172, XP_008365697, NP_001233967, XP_004232469, NP_001275382, XP_006340710, XP_009758914, XP_009804090, XP_009770493, Q40585, CAA65063, CAA65062, NP_001054416, NP_001047092, NP_001066258, NP_001065855, NP_001150274, ACN25606, NP_001 149195, ABG23316, EMS54266
XP_001703440, AF324679, NP_001 189996, NP_189512, NP_189513, XP_009151855, XP_009129362, XP_0091 1 1605, XP_008443426, XP_004147464, KGN59587, XP_004166299, NP_001242797, XP_003534461, KHG24135, KHG10145, XP_007032459, XP_008341542, XP_010312197, XP_006339198, XP_009765131, XP_009790018, XP_009790017, NP_001043429, BAB8991 1, ABG23315, CDM83070, EMS47297, ACR36866
В
с
D
E
f
H
а
с
d
Аминокислотные последовательности выравнивались c помощью алгоритма MUSCLE на сайте Европейского института биоинформатики (EMBL-EBI 10.12.2015), после чего выравнивания проверялись «вручную». Для анализа последовательностей, подбора оптимальных эволюционных моделей по критериям BIC (информационный критерий Байеса) и AIC (информационный критерий Акаике), построения дерева методом объединения сосе-
дей (NJ) использовали программу MEGA 6 (Tamura et al., 2013). Филогенетические деревья методами объединения соседей строили на основе аминокислотных р-расстоя-ний и эволюционных расстояний JTT (Jones et al., 1992). Для пропущенных данных и делеций была выбрана опция partial deletion coverage cutoff 95 %. В качестве показателя устойчивости дерева использовали бутстреп-индексы, рассчитанные на основе 500 повторностей. Филогенети-
ческие деревья методами максимального правдоподобия (ML) строили с использованием оптимальной эволюционной модели согласно критерию BIC. Метод максимального правдоподобия был реализован в пакете PhyML (Guindon, Gascuel, 2003) через графический интерфейс программы Unipro UGENE 1.19 (Okonechnikov et al., 2012). Для статистической оценки ветвей деревьев, построенных методом максимального правдоподобия, использовали непараметрический тест SH-aLRT (Anisimova, Gascuel, 2008). Байесовский анализ проводили с помощью программы MrBayes 3.1 (Huelsenbeck, Ronquist, 2001). Оптимальную эволюционную модель определяли по вкладу модели в распределение апостериорной вероятности. Для каждой субъединицы в программе запускали два независимых анализа MCMC со следующими условиями: 500 000 генераций, 50 000 отбрасываемых начальных генераций (burn-in), 4 цепи (одна холодная и три горячих), гамма-распределение с четырьмя категориями (G). Трассировочные файлы, сгенерированные в ходе MCMC, анализировались с помощью программы Tracer 1.16 (Rambaut et al., 2014). Для статистической оценки ветвей деревьев, построенных методом Байеса, использовали оценку апостериорной вероятности. Для графической работы с филогенетическими деревьями использовали программу FigTree v. 1.4.2 (FigTree 10.12.2015).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты. Характеристика выравнивания
аминокислотных последовательностей
Для реконструкции филогении субъединиц белкового комплекса Н+-АТФазы тонопласта нами были выбраны
восемнадцать видов из разных групп цветковых растений. Эти виды представляли два класса цветковых: двудольные и однодольные. Из двудольных были выбраны представители нескольких семейств из групп астерид и розид. В настоящее время филогенетические отношения между этими группами хорошо известны (Angiosperm Phylogeny Webcite 10.12.2015), и мы можем сопоставить с ними построенные в нашей работе филогенетические деревья белковых субъединиц. Некоторые субъединицы были проанализированы по меньшему числу видов, так как несколько последовательностей были отбракованы из-за ненадлежащего качества.
У большинства видов было обнаружено несколько изоформ каждой из субъединиц. Число изоформ варьирует в зависимости от вида и от конкретной белковой субъединицы. Больше всего изоформ отмечается для субъединицы a трансмембранного комплекса V0. У этой же субъединицы мы обнаружили самое большое число полиморфных сайтов: 63,2 %, из которых 90 % парсимонично информативны. Также высокое число полиморфных сайтов наблюдается у субъединиц С и D периферического домена Vp самое низкое число — у субъединицы с интегрального домена (табл. 4). Таким образом, мы можем разделить исследованные субъединицы на две группы: с высоким уровнем полиморфизма (С, D, a) и низким (А, В, c, d). Похожую картину можно наблюдать по межаминокислотным р-расстояниям: наибольшие значения у a и D, самые маленькие у В и c.
Результаты подбора эволюционных моделей представлены в таблице 4. В число оптимальных вошло три семейства моделей: Le-Gascuel (LG), Jones-Taylor-Thornton (JTT) и General Reversible Chloroplast (cpREV).
Таблица 4
Характеристики аминокислотных последовательностей субъединиц вакуолярной Н+-АТФазы
Число аминокислот в выравни- Оптимальная эволюционная Средняя Средняя
Число вании Макси- модель длина де- длина
Субъ- Чис- после- парси-монично мальные согласно рева при ветвей
единица ло видов дова-тельнос-тей всего полиморф- р-рас-стояния* согласно согласно доле апосте- анализе методом Байе-са*** дерева при анализе методом Байеса***
ных* информативных* AIC BIC риорной вероятности**
V1-A 16 28 627 122 (19,5 %) 99 (15,7 %) 12,1 % LG+G+I LG+G WAG/JTT 1,4223 0,0268
V1-B 17 42 506 67 (13,2 %) 50 (9,9 %) 6,5 % JTT+G+I JTT+G+I JTT 3,9931 0,0493
V1-C 13 22 388 175 (45,1 %) 140 (36 %) 27,0 % JTT+G JTT+G JTT 2,565 0,0626
V1-D 15 24 271 138 (50,9 %) 127 (46,9 %) 38,4 % LG+G LG+G JTT 3,0454 0,0677
V0-a 15 56 886 560 (63,2 %) 508 (57,3 %) 39,5 % JTT+G+I+F JTT+G+I JTT 6,6035 0,0606
V0-c 18 37 178 26 (14,6 %) 12 (6,7 %) 5,0 % cpREV+G cpREV cpREV 0,7976 0,0112
V0-d 15 29 352 81 (23 %) 59 (16,8 %) 12,1 % LG+G LG+G JTT 1,0075 0,0183
* — число полиморфных и парсимонично информативных сайтов и р-расстояния указаны без учета внешней группы, т. е. только
для высших растений; ** — при оценке доли апостериорной вероятности оценивались только сами модели без учета парамет-
ров G и I, которые должны быть предустановлены при анализе в MrBayes; *** — длины деревьев и ветвей оценивали исходя из ожидаемого числа нуклеотидных замен на сайт. LG — модель Le-Gascuel, JTT — модель Jones—Taylor—Thornton, cpREV — модель General Reversible Chloroplast; параметры моделей: G — гамма-распределение, I — инвариантные сайты, F — амино-
кислотные частоты, рассчитываемые по выравниванию
Для трех субъединиц (В, С, a) была выбрана модель JTT. Эта модель была предложена в 1992 г. на основе усовершенствованной матрицы аминокислотных замен (Jones et al., 1992) вместо матрицы PAM (Dayhoff et al., 1978). Модель LG была выбрана для субъединиц A, D и d. Так как эта модель не включена в программу MrBayes, то по апостериорной вероятности вместо нее для указанных субъединиц оптимальными были модели JTT и WAG. По критериям AIC и BIC для этих субъединиц следующей по оптимальности моделью после LG была JTT. Более современные модели используют матрицы аминокислотных замен, рассчитанные по большему числу накопленных данных, и чаще всего последние модели лучше подходят для реконструкции филогении, но есть и исключения (Le, Gascuel, 2008). Довольно неожиданным результатом стал выбор оптимальной модели cpREV для протеолипидной субъединицы с. Модель cpREV разработана для белков, закодированных хлоропласт-ными генами водорослей и высших растений (Adachi et al., 2000). Существуют предположения, что субъединица с АТФаз V-типа возникла в результате слияния двух протеолипидных субъединиц АТФаз F-типа (Nelson, 1992; Kibak et al., 1992), которые локализованы на мембранах хлоропластов и митохондрий и участвуют в синтезе АТФ в ходе процессов фотосинтеза и дыхания. Выбор модели cpREV является дополнительным аргументом в пользу родства протеолипидных субъединиц АТФаз вакуолей и хлоропластов.
Филогения субъединиц периферического
комплекса vi
Для построения филогенетических деревьев были использованы три метода: NJ, ML и метод Байеса. На рисунке 1 представлены филогенетические деревья субъединицы А, построенные различными методами. Можно видеть, что топологии всех трех моделей в достаточной степени схожи. Больше всего узлов с поддержкой более 50 % наблюдалось при построении деревьев методом ML, поэтому на остальных рисунках представлены реконструкции, проведенные именно им. Филогенетическое дерево субъединицы А сходно с филогенией растений, что характерно для последовательностей ортологов. Для нескольких видов были выделены изоформы субъединицы А: три изоформы у Brassica rapa, по две у Glycine max, Solanum lycopersicum, S. tuberosum, Oryza sativa, Zea mays. В случае S. tuberosum и S. lycopersicum две изоформы (А1 и А2) оказались паралогами. Дупликация исходного гена, которая привела к их образованию, по-видимому, произошла еще у общего предка томата и картофеля. Такая же картина наблюдается для изо-форм риса O. sativa.
Филогенетическое дерево некаталитической АТФ-свя-зывающей субъединицы В в меньшей степени согласуется с филогенией растений, представители только некоторых семейств образуют монофилетичные
клады (рис. 2 Б). Изоформы были обнаружены для всех видов кроме Cucumis melo, C. sativus, Nicotiana sylvestris, N. tabacum, Triticum aestivum и T. urartu. В большинстве случаев изоформы одного вида попадали в разные клады, что говорит о том, что они являются паралогами.
Топология филогенетического дерева субъединиц С (рис. 2 А) и D (рис. 2 В) была близка с таковой для А. У обеих субъединиц изоформы являлись ортологами. Изоформы субъединицы с были обнаружены только у четырех видов: G. max, B. rapa, O. sativa и Z. mays. Изоформы субъединицы D найдены у Malus domestica, G. max, N. sylvestris, B. rapa, A. thaliana, Z. mays и O. sativa. Все изоформы одного вида образовывали монофилетичные группы, что позволяет предположить их относительно недавнее происхождение.
Сходные по топологии филогенетические деревья были получены для субъединиц G и Н, по 26 и 15 аминокислотным последовательностям, соответственно. У субъединицы G были обнаружены изоформы почти во всех изученных видах. Изоформы одного вида являлись паралогами и попадали в разные клады. Филогенетические деревья субъединиц G-Н не представлены, т. к. они были сходны по топологии с деревом субъединицы А.
Филогения субъединиц мембранного
комплекса vo
На молекулярно-филогенетическом дереве субъединицы a аминокислотные последовательности формировали две клады с высокой поддержкой при любом методе анализа (реконструкция методом ML представлена на рис. 3). У всех видов присутствовало не менее двух изоформ этого белка. В первой кладе содержались изоформы, обозначенные как а1, во второй — а2 и а3. Разделение на однодольные и двудольные происходило уже внутри клад а1 и а2/а3. У некоторых видов было несколько изоформ в группе а1 (B. rapa, S. tuberosum, S. lycopersicum, G. arboretum, G. max). В кладе а2/а3 двудольные распадались на две подклады. Филогенетическое дерево последовательностей субъединицы а свидетельствует о древней дупликации кодирующих ее генов. Первая древняя дупликация произошла у предков цветковых растений или еще раньше, у предков наземных растений. таким образом сформировались изоформа а1 и общая предковая изоформа для а2 и а3. Вторая дупликация привела к образованию изоформ а2 и а3 и происходила уже после разделения двудольных и однодольных.
На филогенетическом дереве протеолипидной субъединицы с было меньше клад с высокой статистической поддержкой (рис. 4 А). Это связано с низким числом вариабельных сайтов при выравнивании (табл. 4), среди которых высока доля парсимонично неинформативных замен. Также для этой субъединицы отмечено самое низ-
0.8?
г*
-A Arabidopsis thaJfana NP 175011
A Brassica rapa XP 009106605 Brassica rapaXP 009104562
0.75
- A Brassica rapaXP 009128319
A Solanum tuberosum XP 0063S74S0
0.97
0.92
%
0.96 0.8S 0.75
•
o.ei
"11001-
-156q
003
A Arabidopsis I ha liana NP 178011 A Brassica rapa XP 009106605 A Brassica rapa XP 009104562 A Brassica rapa XP 009128319 -A Glycine max XP 003529464 -A Glycinia max NP 001242061 -A Malus domestica XP 008380395 -A Malus domestica AB033173 -A Cucumis malo XP 008462205 -A Cucumis sativus XP 004141749
В
iuu —д Solanum tuberosum XP 0063S7450 I La2 Solanum lycopersicum NP 001234287 -1 100 /-А Nlcotlana sylvestris XP 009781359
A1 N ico (¡ana labacum AIS71397 A Solonum tubero3um XP 006362109 A1 Solanum lycopers leu m NP 0012.V. 281 A1 Tltcobroma cacao XP 007023681 A Cryz.l sativa Japónica Group NP 001046054 A Oryza sativa Japónica Group NP DD1058ZB0 A Tritioum urartu EMS62901 A Trtticum aostlvum ABD3S016 A Zea maya APW7034S A 2o a maya XP 000645297 A Zea mays AFW 66324 A Zea mays ACG486&6 A Zea mayo XP 008670916
A Chlamydomonas ninharctUI XP 001698410
A2 Solanum lycopersicum NP 0012342&7 o^s . A NI cotí ana sylvestris XP 009781359
—lO.SB
1 Al Nlcotlana tabacum AÍS71897
0.93
r A Solanum tuberosum XP 006362109
—10.98
lA1 Solanum lycopersicum NP 001234281 A Malus domestica XP 008380395 A Malus domestica AB033173 A Glycine ma* XP 003S29464 A Glycinia max NP 001242061 A Cucumis meló XP 008462205
»
A Cucumis sativus XP 004141749 Al Theobroma cacao XP 0070236S1 A Zea mays AFW66324 A Zea mays XP 008679916 A Zea mays ACG4S688 A Zea mays AFW70345 A Zea mays XP 00864S297 A Trlticum urartu EMS67961 A Trlticum aestlvum ABD85016 A Oryza saitiva Japónica Group NP 001058280 A Oryza sativa Japónica Group NP 001046054 A Chlamydomonas reinhardtll XP 001698410
A Arabklopais Oializna NP 179011 A Brassica rapa Xf> 009106605 A Drissiu npi ÍP 0И1М562 А В ПШ ca ripi íP 00912Í 319 A Solanum tubaroaum XP 0053574И A2 Solanum lycöparticum NP 001734287 A Nlcotiana aylviilrl» XP №9761369 Al Nicotina tabacum AIS71897 A Solanum tuberosum XP 006362109 AI Solanum lycoporMcum HP 00123*201 А ММ и J Jomes lita XP OOSMHH AMMui domHIica A3033173
CA Glycine mu XP 003523464 A Glycmia mji NP 001242061 A Cucumis malo XP 006462205 A Cucumis sativus XP 004141744 Al Ttieoiroma cacao XP 007023661 A Zu may* AFW5C324 A lea may* XP 006679916 A 2oa maya ACG4S6SB A Zea may* AFW7034S A Z» mayi XP 006646297 Triücum urartu EMS67K1 Trlticum antivbim АБ085016 Oryza sativa Japónica Group NP 001058280 A Oryza saliva Japónica Group NP 001046054 А С hiam ydomona s rtlnhardlil XP 001696410
Рис. 1. Филогенетические деревья аминокислотных последовательностей субъединицы А периферического комплекса V1; А — филодендрограмма, построенная методом ML с использованием модели LG + G, указаны значения SH-aLRT более 0,5, масштабная линейка — число ожидаемых аминокислотных замен на сайт; Б — кладограмма, построенная методом Ш с использованием модели ^Т + G, указаны значения бутстреп-индексов более 50 %; В — кладограмма, построенная методом Байеса с использованием моделей WAG/JTT + G, указаны значения апостериорной вероятности более 0,5
С Ем 11 луз АГЛ'8:320 С Zci maya ХР 008654564 CZíJ miys NP 001147632 С Огуга sitlvi Japónica NP 001056500 С Zea mays NP 001142247 С Trirlcum Msllvum ABC23314 С Ni cot un a sylvestris ХР 007031994 С Solanum lycopersicum ХР 00659M11 С Silin um tuberosum ХР 0065 99411
I- С Glycine гчи ХР 003S 53974
ТЧ* С Glycine max ХР 0035 16129 " С Glycine ma* ХР 006599411
С Malus domestica ХР 003379060 г- С Brassica rapa ХР 009110617 «.СBrassica тара ХР 009148561 ♦ С Brassica rapa ХР 00911805 2 - С Arabldopsls thallana NP S63916 С Theobroma cacao ХР 007031994 — С Cucumis meló ХР OOS463 IZO С Cucumis sativus KCN506S5
аш
С Cucumis satlvus ХР 004150739 С Qilamydomonas relnbardtll ХР 001696429
4
B2 Malus domestica XP 003332093 B2 Malus domestica XP 00836505 5 BZ Malus domestica XP 008365054 B2 Cucumis satlvus XP 004144861 B2 Cucumis melo XP 008447927 B2 Cucumis melo XP 006447926 B1 Cossyplum arboreum KHG25939 B1 Theobrom a cacao.XP.007036767 B1 Theobroma cacao XP 007036766 B1 XI Glycine max XP 006605856 B1 1 Glycine max XP 003536722 B1 XI Glycine max XP 003534485 B2 1 Glycine max XP 003552473 B2 Solanum tuberosum XP 006360894 B2 Solanum lycopersicum XP 0103Z7396 B2 Solanum lycopersicum XP 004248643 BNicotlanatabacum AAF26445 B2 Ni cot i an a sylvestris XP 009783 S 08 B2 Solanum lycoperslcum XP 004231058 B2 XI Solanum tuberosum XP 006364499 BZ Oryza sativa Japónica Group NP 001044043 Oryza sativa Indica Group EEC71367 r-Bl Tritlcum aestivum ABN54974 >¥1 Tritlcum urartu EMS559B6 ■ Oryza sativa Indica Group EAZ013S3
Cr'za sativa Japónica Group NP 001057902 asatlvajaponlcaGroup EAZ37403 B Oryza sativa AAKS4617 BZ Zeamays NP 001148978 B1 Zeamays NP 0011S266S BZ Arabldopsls thallana NP 195 563 B2 Arabldopsls thallana NP 001190954 B Arabldopsls thallana BAH19957 B1 Theobroma cacao XP 007017S94 BZ Gossyplum arboreum KHG14Z91 B1 Brassica rapaXP 009106252 B Arabidopsls thallana AAC36485 B1 Arabldopsls thallana NP 177729 B3 Arabldopsls thallana NP 1734S1 B3 Brassica rapa XP 009103349 B3 Brassica rapaXP 009149511 B Chiamydomonas reinhardtii XP 001701846
Dl Zea mays NP 00115 131Z D Zea mays XP 008662802
D Oryza sativa Japónica NP 001054048 Dl Tritlcum aestivum AEH95771 Dl 2 Zeamays NP 001131707 D Zea mays ACFS6079 Dl Zea mays NP 001149703 D Arabldopsls thaliana NP 191432 D Arabldopsls thallana CAB46439 D Brassica rapa XP 0091165 5 6 D Brassica rapaXP 009104169 D Cucumis melo XP 008449506 D Cucumis sativus XP 004140139 D Malus domestica XP 0083S024S D Malus domestica XP 008353645 Dl Theobroma cacao XP 007048793 D Glycine max XP 003531738 D XI Glycine max XP 003530267 D Gossypium arboreum KHG05002 D Nlcotlana sylvestris XP 009799285 D Nicotian a sylvestris XP 009786974 D Solanum tuberosum XP 006359140 D Solanum lycopersicum XP 010322009 D Chlamydomonas relnhardtii EDP01S5Z
Рис. 2. Филодендрограммы аминокислотных последовательностей субъединиц С (А), В (Б) и Э (В) периферического комплекса V1, построенные методом ML; указаны значения SH-aLRT более 0,5; масштабная линейка — число ожидаемых аминокислотных замен на сайт
al
1—¡0.96
ъ
Е
{
1 0.S8
а2/аЗ
«5
-ЕГ
-ь
Н1
-fö.9
Е
al Zea mays XP 00865 7093 Oryza sativa Japónica NP 001044718 aTriticum aestivum CDM85023 al Arabldopsts thaiiana NP 850122 al Brassica rapa XP 009103695 5%1 Brassica rapa XP 009133874 al Brassica rapa XP 009140911 al Solanum lycopersicum XP 004251275 al Solanum tuberosum XP 006366398 al XI Nicotiana sylvestris XP 009759132 al Solanum lycopersicum XP 004241262 al XI Solanum tuberosum XP 006365749 al 3 Theobroma cacao XP 007015509 al S Theobroma cacao XP 0070155 11 al Glycine max XP 003538035 al Glycine max XP 003S 39739 al Glycine max XP 003S47511 al XI Glycine max XP 006594994 al Malus domestica XP 008358210 al Cucumis meló XP OOS463S88 al Cucumis sativus XP 004149561 al Cucumis sativus XP 004168233 Oryza sativa Indica EEC66656 Oryza sativa Japónica EEE50667 a Oryza sativa Japónica NP 001049572 aTriticum aestivum AEH95770 a3 Zea mays XP 008653566 a3 Zea mays XP 008660336 a2 Nicotiana sylvestris XP 009769606 a2 Solanum lycopersicum XP 004243162 a2 Solanum tuberosum XP 006356756 a2 Cucumis sativus XP 004152666 a3 Cucumis sativus XP 004169002 a3 Glycine max XP 003527676 a Gossypium arboreum KHG00114 a3 1 Theobroma cacao XP 007017673 a Gossypium arboreum KHG13921 a Gossypium arboreum KHG13283 a3 1 Theobroma cacao XP 007042074 a3 2 Theobroma cacao XP 007042075 a3 Glycine max XP 0035 3785 5 a3 Glycine max XP 003540986 a3 Cucumis meló XP 008448072 a3 Cucumis sativus XP 004148529 a2 Nicotiana sylvestris XP 009785999 a3 Solanum lycopersicum XP 004230865 a3 Solanum tuberosum XP 006362018 Arabidopsis thaiiana AAK96647 a2 Arabidopsis thaiiana NP 179736 a2 Brassica rapa XP 009117405 a2 Brassica rapa XP 009140276 a3 Brassica rapa XP 009149095 a3 Arabidopsis thaiiana NP 56805 1 a3 Brassica rapa XP 009109504 a Chi amy do monas reinhardtü XP 001692167 a Chlamydomonas reinhardtü XP 001695223
Рис. 3. Филодендрограмма аминокислотных последовательностей субъединицы а трансмембранного комплекса V0, построенная методом ML; указаны значения SH-aLRT более 0,5; масштабная линейка — число ожидаемых аминокислотных замен на сайт. Серыми блоками обозначены клады а1 и а2/а3
r^j-Oryza saliva Japónica NP 001065855 < Oryza sativa Japónica NP 001066258 j cTritlcum urartu EMS54266
---с Zea mays NP 001149195
-с Zea mays ACN25606
--cTritlcum aestivum ABG23316
-с Zea mays NP001150Z74
——Oryza sativa Japónica NP 001047092
Oryza sativa Japónica NP 00IOS4416 c Cossyplum arboreum KHF97295 c2 Solanum tuberosum XP 006340710 c NI cotí ana sylvestris XP 009804090 c Solanum lycoperslcum NP 001233967 c Solanum tuberosum NP001275382 c NI cotí arta tabacum CAA65063 c2 Solanum lycopcrslcum XP 004232469 c NI cotí ana sylvestris XP 009758914 c Nicociana tabacum CAA65062 c2 Brassica rapa XP 009103374 c2 Brassica rapa XP 006416453 c2 Brassica rapa XP 0091494SS el Theo broma cacao XP 007017703 el Brassica rapa XP 009109515 -el Brassica rapa NP 179244 - c Malus domestica XP 008377172 c Malus domestica XP 008372768 c Cucumis molo XP 008444773 e Cucumli sativus XP 004152664 c Cucumis sativus XP 004152663 c Cucumis sativus XP 004133996 c Arabidopsis thaliana AAA99934 el Glycine maxXP 0035 17187 c Glycine max XP 006590717 c Glycine max XP 003543079 c Glycine maxXP 003520270 c Glycine max NP 001276180 cc Chlomydomonas rtinhordtíi XP 001696361
[aai
— И7—(»"
№
ten..........
tez
- d Trltleum MHIvum ABG23315
- d Trltleum Millvurn CDM83070
_ d Or/u satlva Japonlca BAB89911 d Oryza satlva Japonlca NP 001043429 ZM m«y> ACR3SS6S
d2 Nicotiana sylvestris XP 009765131 d2xl Nleotlin* sylvestris XP 009790017 d2 x2 Nlcotlina lylvastrli XP 009790018 d2 Solanum lycopsnlcum XP 010312197 d2 Solanum tuberosum XP 006339198 d2 Cucumis sativus XP 004166299 d2 Cucumis sativus XP 004147464 Cucumis sativus KGN59587 dZ Cucumis meloXP 008443426 -dl Brassica rapaXP009129362 -dl Brassica rapaXP 00915 185 S -dl Brassica rapaXP009111605 dl Arabidopsis thaliana NP 1895 1! Arabldopsls thaliana AF324679 d2 Arabldopsls thaliana NP 001189990 d2 Arabldopsls thaliana NP 1895 13
- Glycin* max NP 001242797 d2 Glycine maxXP 003534461
dz Malus domtstleaXP 008341542 d2 Thaobroma caew XP 007032460 dl Thaobroma eacao XP 007032459 d2 Cossyplum arboreum KHC10145 ■ d Chlumydcmcn» riinhardtll XP 001703440
Рис. 4. Филодендрограммы аминокислотных последовательностей субъединиц с (А) и d (Б) трансмембранного комплекса V,, построенные методом ML; указаны значения SH-aLRT более 0,5; масштабная линейка — число ожидаемых аминокис-
лотных замен на сайт
кое значение средней длины филогенетического дерева (табл. 4). Несмотря на низкую вариабельность, у многих видов существуют изоформы, отличающиеся между собой одной или несколькими аминокислотами. У Zea, Solanum и Nicotiana изоформы являются паралогами, возникшими в результате недавней дупликации. Для остальных видов из-за низкой поддержки клад филогенетического дерева нельзя определенно сказать, являются ли изоформы паралогами или ортологами.
Филогенетическое дерево третьего белка трансмембранного комплекса, субъединицы d, было похоже на деревья субъединиц периферического комплекса D (рис. 4 Б). Изоформы были идентифицированы у N. sylvestris, G. max, A. thaliana, B. rapa, C. sativus, T. cacao, T. aestivum, O. sativa. Как и для а, для этой субъединицы отмечено довольно низкое значение средней длины филогенетического дерева (табл. 4).
ОБСУЖДЕНИЕ
Интерес к эволюции вакуолярной АТФазы возник еще в начале 90-х гг., однако большинство исследований было посвящено ее происхождению от F-АТФаз митохондрий и хлоропластов, по-видимому, из-за общего принципа субъединичного строения фермента (Gogarten et al., 1992). Особенностям эволюции данного фермента внутри царства растений уделялось мало внимания. Возможно, это объяснялось еще и недостатком информации, так как клонировать и секвенировать такой муль-тиферментный комплекс — это трудоемкая и затратная по времени задача. В настоящее время благодаря интенсивному развитию технологий секвенирования нового поколения и реализации геномных проектов появилась возможность сравнения десятков последовательностей, что позволило говорить о молекулярной эволюции каждой из субъединиц. Необходимые данные представлены в широкодоступных базах данных. Именно они были использованы нами для данного исследования характера изменчивости различных субъединиц фермента.
Нами показано, что различные субъединицы V-АТФазы изменяются в ходе эволюции по-разному, хотя и являются структурными частями одного белка. На основе проведенного анализа можно охарактеризовать несколько основных особенностей эволюции, которые по-разному сочетаются у разных субъединиц этого фермента.
1. Древние дупликации. Филогенетический анализ субъединицы а показывает как минимум два события дупликации ее генов. Согласно современным представлениям древние цветковые отделились примерно 374 миллионов лет назад (Silvestre et al., 2015). Результаты молекулярно-филогенетического анализа субъединицы а позволяют предположить, что дупликация кодирующего ее гена произошла до этого события. Возможно, дупликация этого белка связана
с переходом растений к наземному существованию. Вторая дупликация произошла у двудольных, после отделения однодольных, не позднее 100 млн лет назад (примерное время дивергенции — Poales, Hertweck et al., 2015). Предположение о древней дупликации, произошедшей около 300 млн лет назад, ранее было сделано для субъединицы А периферического комплекса на основе сравнения длины уникального для растений интрона (Gogarten et al., 1992; Starke, Gogarten, 1993). Наши данные не подтверждают этого для А домена V1, но достоверно показывают для а домена V0.
2. Новые дупликации. В большинстве случаев новые дупликации субъединиц вакуолярной Н+-АТФазы происходили либо при становлении отдельных семейств цветковых (такая картина наблюдается у Solanaceae), либо позже, при дивергенции таксонов внутри семейства (например, O. sativa из Poaceae). Изофор-мы, возникшие в результате новых дупликаций, могут различаться тканеспецифичностью экспрессии и участием в адаптации к стрессовым воздействиям (Bageshwar et al., 2005).
3. Высокая консервативность. Проведенный анализ свидетельствует, что аминокислотные последовательности субъединицы с очень близки у всех цветковых растений. Об этом говорит и низкое число вариабельных сайтов выравнивания, и наименьшая длина филогенетического дерева, и выбор в качестве оптимальной эволюционной модели, разработанной для хлоропластных белков. Консервативность субъединицы с можно объяснить ее функциональностью как трансмембранного канала. В то же время клонировано нескольких изоформ этой субъединицы, по-разному отвечающих на солевой стресс (Lehr et al., 1999). Изоформы, рассмотренные нами, отличались между собой всего несколькими аминокислотами. По-видимому, даже такие минимальные различия в столь консервативном белке могут приводить к существенному изменению работы фермента. Консервативностью отличалась и другая субъединица интегрального домена — d, что может быть связано с ее ролью в ротационном механизме V-АТФазы. Также относительно консервативной оказалась субъединица В, что может быть связано с выполнением регуляторной функции. Хотя она не участвует в гидролизе АТФ, но содержит АТФ-связывающие сайты, которые модулируют активность фермента, а при определенных мутациях в центрах связывания АТФ на субъединице В происходит полное выключение работы фермента или разобщение транспортной и каталитической составляющих активности (Liu et al., 1996; Vasilyeva et al., 2000). Кроме того, показано, что именно субъединица В может быть фосфорилирована по серину (Martiny-Baron et al., 1992), что является одним из механизмов посттрансляционной регуляции фермента.
Таким образом, эволюция Н+-АТФазы тоноплас-та представляет собой сложный процесс. Субъединицы периферического комплекса V1 характеризовались высокой вариабельностью, за исключением субъединицы В, которая отличалась консервативностью. Наиболее консервативной была субъединица V0-c, формирующая протонный канал. В то же время субъединица а дупли-цировалась несколько раз, что привело к появлению большого разнообразия изоформ. Благодаря сочетанию древних и новых дупликаций, консервативности и изменчивости отдельных субъединиц могло происходить появление V-АТФаз с новыми свойствами, необходимыми для приспособления к меняющимся условиям окружающей среды. Таким образом, филогенетическое сравнение субъединиц демонстрирует возникновение баланса между изоформами, который позволяет растениям гибко адаптироваться к условиям окружающей среды и смене морфогенетических программ.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ (грант № 13-04-00945); а также государственного задания БИН РАН № 0126-2014-0028.
ЛИТЕРАТУРА
1. Adachi J., Waddell P. J., Martin W., Hasegawa M. (2000) Plastid genome phylogeny and a model of amino acid substitution for proteins encoded by chloroplast DNA. J. Mol. Evol. V. 50: P. 348-358.
2. Angiosperm Phylogeny Website, version 13. Cited 10.12.2015. URL: http://www.mobot.org/MOBOT/ research/APweb/.
3. Anisimova M., Gascuel O. (2006) Approximate likelihood ratio test for branchs: A fast, accurate and powerful alternative. Systematic Biology. V. 55 (4): P. 539-552.
4. Armbruster A., Hohn C., Hermesdorf A. et al. (2005) Evidence for major structural changes in subunit C of the vacuolar ATPase due to nucleotide binding. FEBS Letters. V. 579: Р. 1961-1967.
5. Bageshwar U. K., Taneja-Bageshwar S., Moharram H. M., Binzel M. L. (2005) Two isoforms of the A subunit of the vacuolar H+-ATPase in Lycopersicon esculentum: highly similar proteins but divergent patterns of tissue localization. Planta. V. 220: P. 632-643.
6. Basak S., Gayen S., Thaker Y. R. et al. (2011) Solution structure of subunit F (Vma7p) of the eukaryotic V1VO ATPase from Saccharomyces cerevisiae derived from SAXS and NMR spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta. V. 1808: Р. 360-368.
7. Beyenbach K. W, Wieczorek H. (2006) The V-type H+-ATPase: molecular structure and function, physiological roles and regulation. J. Exp. Biol. V. 209: Р. 577-589.
8. BLAST. Cited 10.12.2015. URL: http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi.
9. Bremberger C., Lüttge U. (1992) Dynamics of tonoplast proton pumps and other tonoplast proteins of Mesem-bryanthemum crystallinum L. during the induction of Crassulacean acid metabolism. Planta. V. 188 (4). Р. 575-580.
10.Cipriano D. J., Wang Y., Bond S. et al. (2008) Structure and regulation of the vacuolar ATPases. Biochimica et Biophysica Acta. V. 1777: Р. 599-604.
11.Dayhoff M. O., Schwarz R. M., Orcut B. C. (1978) A model of Evolutionary change in proteins In Day-hoff M. O., editor. Atlas of protein sequences. 5. National Biomedical Research Foundation; p. 345-352.
12.Dettmer J., Liu T. Y., Schumacher K. (2010) Functional analysis of Arabidopsis V-ATPase subunit VHA-E isoforms. Eur. J. Cell Biol. V. 89: Р. 152-156.
13. Diakov T. T., Kane P. M. (2010) Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. V. 285: Р. 23771-23778.
14.EMBL EBI MUSCLE. Cited 10.12.2015. URL: http:// www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle.
15.FigTree. Cited 10.12.2015. URL: http:/tree.bio.ed.ac. uk/software/figtree
16. Finbow M. E., Harrison M. A. (1997) The vacuolar H+-ATPase: a universal proton pump of eukaryotes. Bio-chem. J. V 324: P. 697-712.
17. Gaxiola R. A., Palmgren M. G., Schumacher K. (2007) Plant proton pumps. FEBS Letters. V. 581: Р 2204-2214.
18.Gene Bank. Cited 13.07.2015. URL: http://www.ncbi. nlm.nih.gov.
19.Gogarten J. P., Starke T., Kibak H. et al. (1992) Evolution and isoforms of V-ATPase Subunits. J. Exp. Biol. V. 172: P. 137-147.
20. Goodstein D. M., Shu S., Howson R. et al. (2012) Phy-tozome: a comparative platform for green plant genomics. Nucleic Acids Res. V. 40 (D1): D1178-D1186.
21.Guindon S., Gascuel O. (2003) A simple, fast and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood. Systematic Biology. V. 52 (5): P. 696-704.
22. Hanitzsch M., Schnitzer D., Seidel T. et al. (2007) Transcript level regulation of the vacuolar H+-ATPase subunit isoforms VHA-a, VHA-E and VHA-G in Arabidopsis thaliana. Molecular Membrane Biology. V. 24: Р. 507-518.
23. Hertweck K. L., Kinney M. S., Stuart S. A. et al. (2015) Phylogenetics, divergence times and diversification from three genomic partitions in monocots. Botanical Journal of the Linnean Society. V. 178: P 375-393.
24. Hirata T., Iwamoto-Kihara A., Sun-Wada G. H. et al. (2003) Subunit rotation of vacuolar-type proton pumping ATPase: relative rotation of the G and C sub-units. J. Biol. Chem. V. 278: Р. 23714-23719.
25. Hong-Hermesdorf A., Brüx A., Grüber A. et al. (2006) A WNK kinase binds and phosphorylates V-ATPase subunit C. FEBS Letters. V. 580: Р. 932-939.
26. Huelsenbeck J. P., Ronquist F. (2001) MRBAYES: Bayesian inference of phylogeny. Bioinformatics. V. 17: P. 754-755.
27. Jefferies K. C., Forgac M. (2008) Subunit H of the Vacuolar H+-ATPase Inhibits ATP Hydrolysis by the Free V1 Domain by Interaction with the Rotary Subunit F. J. Biol. Chem. V. 283: P. 4512-4519.
28. Jones D. T., Taylor W. R., Thornton J. M. (1992) The rapid generation of mutation data matrices from protein sequences. Computer Applications in the Biosciences. V. 8: P. 275-282.
29. Kibak H., Taiz L., Starke T. et al. (1992) Evolution of Structure and Function of V-ATPases. J. Bioenerg. Biomembr. V. 24 (4): P. 415-424.
30. Klink R., Lüttge U. (1992) Quantification of visible structural changes of the V0V1 -ATPase in the leaf tono-plast of Mesembryanthemum crystallinum by freeze-fracture replicas prepared during the C3-photosynthesis to CAM transition. Bot. Acta. V. 105: P. 414-420.
31. Kluge C., Lahr J., Hanitzsch M. et al. (2003) New insight into the structure and regulation of the plant vacuolar H+-ATPase. J. Bioenerg. Biomembr. V. 35: P 377-388.
32. Kramer D., Mangold B., Hille A. et al. (1995) The head of a higher plant V-type H+-ATPase is not always a hexamer but also a pentamer. J. Exp. Bot. V. 46: P 1633-1636.
33. Krisch R., Rakowski K., Ratajczak R. (2000) Processing of V-ATPase subunit B of Mesembryanthemum crystallinum L. is mediated in vitro by a protease and/or active oxygen species. Biol. Chem. V. 381: P. 583-592.
34. Lai S. P., Watson J. C., Hansen J. N., Sze H. (1991) Molecular cloning and sequencing of cDNAs encoding the proteolipid subunit of the vacuolar H+-ATPase from a higher plant. J. Biol. Chem. V. 266: P. 16078-16084.
35. Le S. Q., Gascuel O. (2008) LG: An Improved, General Amino-Acid Replacement Matrix Mol. Biol. Evol. V. 25 (7): P. 1307-1320.
36. Lehr A., Kirsch M., Viereck R. et al. (1999) cDNA and genomic cloning of sugar beet V-type H+-ATPase subunit A and c isoforms: evidence for coordinate expression during plant development and coordinate induction in response to high salinity. Plant Mol. Biol. V. 39: P 463-475.
37. Liu Q., Kane P. M., Newman P. R., Forgac M. (1996) Site-directed mutagenesis of the yeast V-ATPase B subunit (Vma2p). J. Biol. Chem. V. 271: P 2018-22.
38. Lüttge U., Fischer-Schliebs E., Ratajczak R. (2001) The H+-pumping V-ATPase of higher plants: a versatile eco-enzyme in response to environmental stress. Cell Biol. Mol. Lett. V. 6: P. 356-361.
39. Madden T. (2000) The BLAST Sequence Analysis Tool. In: J. McEntyre, J. Ostell, editors. The NCBI Handbook. Bethesda (MD). National Center for Biotechnology Information. Cited 10.12.2015. URL: http://www. ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21097/.
40. Manolson M. F., Rea P. A., Poole R. J. (1985) Identification of 3-O-(4-benzoyl)benzoyladenosine 5'-triphos-
phate- and N, N'-dicyclohexylcarbodiimide-binding subunits of a higher plant H+-translocating tonoplast ATPase. J. Biol. Chem. V. 260: P. 12273-12279.
41. Martinoia E., Maeshima M., Neuhaus H. E. (2007) Vacuolar transporters and their essential role in plant metabolism. J. Exp. Bot. V. 58: P. 83-102.
42. Martiny-Baron G., Manolson M. F., Poole R. J. et al. (1992) Proton transport and phosphorylation of tonoplast polypeptides from zucchini are stimulated by the phospholipid platelet-activating factor. Plant Physiol. V. 99: P. 1635-1641.
43. Nelson N. (1992) Structural conservation and functional diversity of V-ATPases. J. Bioenerg. Biomembr. V. 24 (4): P. 407-414.
44. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M., the UGENE team. (2012) Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. V. 28: P. 1166-1167.
45. Ouyang Z., Li Z., Zhang X. (2008) Cloning and sequencing of V-ATPase subunit d from mung bean and its function in passive proton transport. J Bioenerg Biomembr. V. 40: P. 569-576.
46. Padmanaban S., Lin X., Perera I. et al. (2004) Differential expression of vacuolar H+-ATPase subunit c genes in tissues active in membrane trafficking and their roles in plant growth as revealed by RNAi. Plant Physiol. V. 134: P. 1514-1526.
47. Rambaut A., Suchard M. A., Xie D., Drummond A. J. (2014) Tracer v1.6. Cited 10.12.2015. URL: http:// beast.bio.ed.ac.uk/Tracer.
48. Randall S. K., Sze H. (1987) Probing the catalytic subunit of the tonoplast H+-ATPase from oat roots. Binding of 7-chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3, — diazole to the 72-kilodalton polypeptide. J. Biol. Chem. V. 262: P. 7135-7141.
49. Ratajczak R. (2000) Structure, function and regulation of the plant vacuolar H+-translocating ATPase. Bio-chimica et Biophysica Acta. V. 1465: P. 17-36.
50. Ratajczak R., Richter J., Luttge U. (1994) Adaptation of the tonoplast V-type H+-ATPase of Mesembryanthemum crystallinum to salt stress, C3-CAM transition and plant age. Plant Cell Environm. V. 17: P 1101-1112.
51. Rockel B., Luttge U., Ratajczak R. (1998) Changes of message amount of V-ATPase subunits during salt-stress induced C3-CAM transition in Mesembryan-themum crystallinum. Plant Physiol. Biochem. V. 36: P. 567-573.
52. Rockel B., Ratajczak R., Becker A., Luttge U. (1994) Changed densities and diameters of intra-membrane tonoplast particles of Mesembryanthemum crystallinum in correlation with NaCl-induced CAM. J. Plant Physiol. V. 143: P. 318-324.
53. Schnitzer D., Seidel T., Sander T. et al. (2011) The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiol. V. 52: P. 946-956.
54. Schumacher K., Krebs M. (2010) The V-ATPase: small cargo, large effects. Current Opinion in Plant Biology. V. 13: P. 724-730.
55. Seidel T., Schnitzer D., Golldack D. et al. (2008) Or-ganelle-specific isoenzymes of plant V-ATPase as revealed by in oioo-FRET analysis. BMC Cell Biology. V. 9: P. 28.
56. Silvestro D., Cascales-Minana B., Bacon C. D., Anto-nelli A. (2015) Revisiting the origin and diversification of vascular plants through a comprehensive Bayesian analysis of the fossil record. New Phytologist. V 207: P. 425-436.
57. Song C. F., Papachristos K., Rawson S. et al. (2013) Flexibility within the rotor and stators of the vacuolar H+-ATPase. PLoS One. V. 8: e82207.
58. Starke T., Gogarten J. P. (1993) A conserved intron in the V-ATPase A subunit genes of plants and algae. FEBS Letters. V. 3: P. 252-258.
59. Strompen G., Dettmer J., Stierhof Y. D. et al. (2005) Arabidopsis vacuolar H+-ATPase subunit E isoform 1 is required for Golgi organization and vacuole function in embryogenesis. Plant J. V. 41: P. 125-132.
60. Sze H., Schumacher K., Müller M. L. et al. (2002) A simple nomenclature for a complex proton pump: VHA genes encode the vacuolar H+-ATPase. Trends Plant Sci. V. 7 (4): P. 157-161.
61. Tamura K., Stecher G., Peterson D. et al. (2013) MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol. V. 30: P. 2725-2729.
62. The UniProt Consortium. (2015) UniProt: a hub for protein information. Nucleic Acids Res. V 43: D204-D212.
63. Toei M., Saum R., Forgac M. (2010) Regulation and isoform function of the V-ATPases. Biochemistry. V. 49: P. 4715-4723.
64. Tzeng C. M., Hsu L. H., Pan R. L. (1992) Inhibition of tono-plast ATPase from etiolated mung bean seedlings by fluorescein 5'-isothiocyanate. Biochem J. V 285 (3): P 737-743.
65. Vasilyeva E., Liu Q., MacLeod K. J. et al. (2000) Cysteine scanning mutagenesis of the noncatalytic nucleotide binding site of the yeast V-ATPase. J. Biol. Chem. V. 275: P. 255-260.
66. Wang B., Luttge U., Ratajczak R. (2001) Effects of salt treatment and osmotic stress on V-ATPase and V-PPase in leaves of the halophyte Suaeda salsa. J. Exp. Bot. V. 52 (365): P. 2355-2365.
67. Wang Y., Sze H. (1985) Similarities and differences between the tonoplast-type and the mitochondrial H+-ATPases of oat roots. J. Biol. Chem. V. 260 (19): P. 10434-10443.
68. Ward J. M., Sze H. (1992) Subunit Composition and Organization of the Vacuolar H+-ATPase from Oat Roots. Plant Physiol. V. 99 (1): P. 170-179.
69. Zhigang A., Low R., Rausch T. et al. (1996) The 32 kDa tonoplast polypeptide Di associated with the V-type H+-ATPase of Mesembryanthemum crystallinum L. in the CAM state: A proteolytically processed subunit B? FEBS Letters. V. 389: P. 314-318.
MOLECULAR PHYLOGENETIC ANALYSIS OF THE TONOPLAST H+-ATPASE SUBUNITS
Chen T., Mikhaylova Yu. V., Shishova M. F.
C SUMMARY: Vacuolar H+-ATPase is a multi-subunit protein complex, which fulfills a number of crucial functions in plant cell. Different mechanisms are known to be important for the regulation of proton-transporting enzyme activity at transcriptional and post-translational levels. In this investigation we performed a comparison analysis of molecular phylo-geny of different subunits of vacuolar H+-ATPase directed in the elucidation of conservative rate of membrane and peripheral complexes of the enzyme. High rate of conservatism was shown for subunits c, d and B, as well as ancient duplications of subunit a.
C KEYWORDS: H+-ATPase; tonoplast; vacuole; enzyme activity; phy-logenetic tree.
C Информация об авторах
Чень Тинчжо — аспирант, кафедра физиологии и биохимии растений. ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет». 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9. E-mail: ctz1985@mail.ru.
Михайлова Юлия Владимировна — м. н. с., лаборатория биосистематики и цитологии. Ботанический институт им. В. Л. Комарова Российской академии наук. 193022, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 2. E-mail: YMikhaylova@binran.ru.
Шишова Мария Фёдоровна — профессор, кафедра физиологии и биохимии растений. ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет». 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9. E-mail: mshishova@mail.ru.
Chen Tingzhuo — PhD student, Department of plant physiology and biochemistry. Saint Petersburg State University. 199034, Saint Petersburg, Universitetskaya emb., 7/9, Russia. E-mail: ctz1985@mail.ru.
Mikhaylova Yulia Vladimirovna — junior reseacher, Laboratory of Biosystematics and Cytology. Komarov Botanical Institute, Russian Academy of Sciences. 193022, Saint Petersburg, Professora Popova St., 2, Russia. E-mail: YMikhaylova@binran.ru.
Shishova Maria Fiodorovna — Professor, Department of plant physiology and biochemistry. Saint Petersburg State University. 199034, Saint Petersburg, Universitetskaya emb., 7/9, Russia. E-mail: mshishova@mail.ru.
