CC BY
123
Молекулярно-биологическое типирование возбудителя в системе эпидемиологического надзора за вирусным гепатитом А
Плотникова К.Ю.1, Гудков В.Г.1 Дашкевич А.М.2, Фисенко Е.Г.2, Красько А.Г.1, Рогачева Т.А.3
1РНПЦ эпидемиологии и микробиологии, Минск, 2Минский городской центр гигиены и эпидемиологии, 31ородская клиническая инфекционная больница, Минск
Plotnikova K.U.1, Gudkov V.G.1, Dashkevich A.M.2, Fisenko E.G.2, Krasko A.G.1, Rogacheva TA.3
'Republican Scientific Practical Centre of Epidemiology and Microbiology, Minsk, Belarus,
2Minsk Center of Hygiene and Epidemiology, Belarus, 3City Clinical Infectious Diseases Hospital, Minsk, Belarus
Molecular-biological typing of causative agent in the system of epidemiological
inspection for viral hepatitis type A
Резюме. Исследовано 59 нуклеотидных последовательностей фрагмента VPI-P2A области генома вируса гепатита А (ВГА), полученных в результате секвенирования образцов РНК, выявленных в клинических образцах больных гепатитом А из г. Минска за период с августа по декабрь 2006 г. и с января 2008 г. по июнь 20'2 г. Показано, что в г. Минске циркулирует вирус трех субгенотипов: IA, IB и IIIA (37,3; '1,9 и 50,8% соответственно от общего числа изолятов, включенных в исследование). Анализ распределения различных субгенотипов по годам выявил существенные изменения структуры популяции ВГА во времени. На основании результатов исследования разработана инструкция по применению «Метод генотипирования вируса гепатита А» для использования в практике эпидемиологического надзора. Ключевые слова: вирус гепатита А, VPI-P2A, генотип, инструкция по применению.
Summary. 59 nucleotide sequences of the fragment VP'-P2A region of the genome of hepatitis A virus (HAV), derived from the sequencing of RNA samples identified in clinical samples of patients wtth hepatitis A in Minsk for the period from August to December2006 and January 2008 to June 20'2, were analyzed. It is shown that in Minsk three subgenotypes circulate: IA, IB and IIIA (37.3, ''.9 and 50.8% respectively of the total number of isolates included in this study). Analysis of the various subgenotypes distribution by year revealed significant changes in the HAV population structure in time. The application instructions «Hepatitis A virus genotyping method» was developed for using in the epidemiological surveillance practice. Keywords: hepatitis A virus, VP'-P2A, genotype, application instructions.
Вирусный гепатит А (ГА) является одной из самых распространенных инфекций в мире и сохраняет свою актуальность, несмотря на многолетнее снижение уровня заболеваемости и достигнутое в последние годы в результате проведения массовой вакцинопрофилак-тики и совершенствования противоэпидемических мероприятий относительное эпидемиологическое благополучие. Это обусловлено как наличием циркулирующей популяции возбудителя в нашей стране, так и завозом инфекции из других, в том числе эндемичных по этой инфекции стран.
Клиническая картина ГА может варьироваться от инаппарантных, субклинических, безжелтушных и легких форм, преимущественно у детей, что затрудняет раннее выявление больных, до случаев острого поражения и некроза печени у взрослых. Как правило, ГА не переходит в хроническую форму и редко дает осложнения, однако это заболевание может приводить даже к летальному исходу. Фульминантные формы ГА наблюдаются примерно в 6% случаев [2] и ре-
гистрируются при сочетанной инфекции у пациентов с вирусными гепатитами В, С, ВИЧ-инфекцией, а также у лиц, страдающих наркоманией и пожилых людей [4, 6, 9]. Суперинфицирование вирусом гепатита А (ВГА) зачастую может привести к осложнениям и увеличению тяжести заболеваний у пациентов с хроническими формами вирусных гепатитов В, С и другими инфекционными заболеваниями.
Поскольку ГА - типичная инфекция с фекально-оральным механизмом заражения, ее возбудитель передается преимущественно посредством конта-минированной им воды, пищи или так назваемым контактно-бытовым путем. Такой механизм передачи обуславливает возможность эпидемических подъемов заболеваемости, вероятность которых особенно возрастает при накоплении в популяции неимунной к вирусу прослойки населения. К ней в первую очередь относятся не болевшие (в условиях длительного периода эпидемиологического благополучия) ГА и не подвергавшиеся вакцинации лица средних и старших возрастных групп. Кроме того, восприимчи-
вая к вирусу прослойка населения может пополняться за счет лиц, напряженность иммунитета у которых не достигает про-тективного уровня.
В таких условиях определяющая роль в осуществлении контроля над гепатитом А оказывается за эпидемиологическим надзором, современная форма которого основана на осуществлении систематического молекулярно-эпидемиологиче-ского мониторинга за циркулирующей популяцией возбудителя. Мониторинг проводится с помощью вирусологических и молекулярно-биологических методов исследования: полимеразной цепной реакции (ПЦР) и реакции секвенирования, позволяющих получить сведения о геноме возбудителя. Установленные в ходе исследований нуклеотидные последовательности определенных фрагментов генома вируса размещаются в международной базе данных и являются важным инструментом для характеристики гено-типической структуры циркулирующей на определенной территории популяции ГА, определения путей и факторов распространения инфекции.
№12 • 2012
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ |бб
Генотипическая структура вируса гепатита А в г. Минске в динамике
%
2006 2008 2009 2010 2011 2012 ГоДь|
Генотипирование и филогенетический анализ циркулирующих вариантов ВГА в последние годы достаточно широко используются в экономически развитых странах мира в качестве важного элемента системы контроля (надзора) за ГА на национальном и региональном уровнях [10], аналогичные исследования проводились и в Беларуси [1, 5].
Цель исследования - разработка и апробация системы молекулярно-эпи-демиологического мониторинга за вирусным гепатитом А в Республике Беларусь.
Материалы и методы
Образцы. В работе использовались 103 образца клинического материала, полученных из городских инфекционных клинических больниц г. Минска от больных острым ГА: 11 сывороток за период с августа по декабрь 2006 г. (с положительным результатом на содержание РНК ВГА) и 90 сывороток и 2 фекальные пробы - с января 2008 г. по май 2012 г.
Праймеры. Использовались два прай-мера производства «Праймтех» (г. Минск, Беларусь) к VP1-2A области генома:
- прямой - 5' CTATTCAGATTG CAAATT-ACAAT-3'(2896-2918);
- обратный - 5' CCATTTCAAGAGT-CCACACACT-3' (3381-3360) [7, 8].
Получение фрагмента и реакция секвенирования. Выделение РНК проводилось с использованием коммерческих наборов для выделения РНК согласно инструкции либо с применением лизиру-ющего раствора, содержащего гуанидин-тиоцианат. В последнем случае после обработки пробы лизирующим раствором образец смешивался в пропорции 1:1 с изопропанолом для преципитации РНК. Полученный осадок отмывался последовательно этанолом и ацетоном, после чего растворялся в деионизированной воде.
Обратная транскрипция и амплификация осуществлялись с использованием соответствующих наборов реактивов производства «Fermentas» (Литва) согласно инструкциям. Обратная транскрипция проводилась со специфическим прай-мером при следующем температурном режиме: 42 °С в течение 1 ч, а затем при 70 °С в течение 10 мин. Режим амплификации: 2 мин при 94 °С - 1 цикл; 20 с при 94 °С, 10 с при 50 °С, 10 с при 72 °С - 5 циклов, 5 с при 94 °С, 5 с при 50 °С, 10 с при 72 °С - 30 циклов и заключительный этап элонгации при 72 °С в течение 7 мин.
Учет результатов амплификации проводился с помощью электрофореза продуктов амплификации в 2%-ном агароз-ном геле с использованием ДНК-маркера производства «Fermentas». При полу-
чении положительного результата соответствующая полоска геля вырезалась, фрагмент ДНК очищался с помощью набора для выделения ДНК «QIAquick Gel extraction kit» (Qiagen, GmbH, Германия). Секвенирование проводилось с помощью наборов Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start kit» (Beckman Coulter, CA) и «BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit» (Applied Biosystems, USA). Режим амплификации: 20 с при 96 "С, 20 с при 50 "С, 4 мин при 60 "С - 30 циклов. Продукты амплификации после очистки анализировались на приборах «Genetic Analysis System CEQ 8000» (Beckman Coulter, CA) и «3100 Avant Genetic Analyzer» (Applied Biosystems, USA).
Молекулярно-генетический анализ и генотипирование ВГА осуществлялись путем изучения фрагмента из 315 нуклео-тидных оснований, охватывающих VP1-2A соединение, с помощью программы MEGA (версия 5). Последовательности выравнивались с помощью алгоритма Clustal W. Выбор модели для расчета эволюционных дистанций осуществлялся с использованием инструмента, встроенного в программу. При проведении анализа использовалась модель с учетом возможности применять при обработке данных сопутствующие параметры (наличие инвариантных сайтов, значение гамма-параметра). Полученная с помощью выбранной модели матрица генетических расстояний далее использовалась для реконструкции филогенетических древ с помощью метода neighbor-joining (объединения ближайших соседей). Надежность построения оценивалась методом bootstrapping (всего анализировалось 1000 псевдореплик).
При проведении филогенетического анализа использовались следующие прототипные последовательности ге-
нома ВГА, содержащиеся в GenBank: AH1 (AB020564), H2 (EF406357), HAS-15 (X15464), GBM (X75214), Isolate 102 Germ (EU416233.1), MBB (M20273), HM-175 WT (NC_001489), HAF203 (AF268396), CF53 (AY644676), HA-JNG08-92 (AB279733), HA-JNG06-90F (AB258387), HA-JNG04-90 (AB279732), KRM003 (AB425339), Nor-10 (AF050231.1), Egypt_swS2 (FJ010835.2).
Результаты и обсуждение
В результате молекулярно-эпидемио-логического мониторинга в г. Минске. РНК ВГА была обнаружена в 67 сыворотках и 2 фекальных пробах при исследовании 92 образцов, полученных в период с января 2008 г. по июнь 2012 г. Нуклео-тидная последовательность была получена для 59 образцов, включая 11 сывороток второй половины 2006 г.
Филогенетический анализ и сравнение с прототипными последовательностями, представленными в международной базе данных GenBank, позволили установить, что в г. Минске циркулируют вирусы гепатита А трех субгенотипов: IA, IB и IIIA (37,3; 11,9 и 50,8% соответственно от общего числа изолятов, включенных в исследование).
В условиях низкой заболеваемости ГА в г. Минске регистрируются небольшие очаги инфекции, объединяющие 2-4 случая и вызванные одним штаммом вируса (исключения составляют только вспышки 2006 г. и конца 2008 - начала 2009 г., охватившие большее число людей). Кроме того, данные ряда лет указывают на возможность «возвращения» некоторых штаммов инфекционных агентов. Так, 100%-ное совпадение нуклеотидной последовательности фрагмента VP1-P2A генома оказалось у вирусов, вызывавших ГА в ноябре 2008 г. и феврале-марте 2011 г. (всего четыре случая), в мае 2010 г. и апреле-мае 2012 г. (всего три случая).
Анализ распределения различных субгенотипов по годам выявил существенные изменения структуры популяции ВГА во времени (см. рисунок). Так, в последние годы на фоне уменьшения доли субгенотипа IA, происходило увеличение удельного веса субгенотипа IIIA. При этом выявляемость субгенотипа IB не превышала двух случаев в год или не отмечалась вовсе.
В первые пять месяцев 2010 г. в Минске был отмечен рост заболеваемости ГА в 4 раза (по сравнению с аналогичным периодом 2009 г.), сопряженный с одновременным распространением различных вирусов субгенотипа IIIA. Рост заболеваемости ГА в г. Минске в 2010 г. (в 3,7 раза по сравнению с 2009 г.) был обусловлен преимущественным распространением различных штаммов ВГА субгенотипа IIIA: доля указанного субгенотипа была максимальной с начала проведения молекулярно-эпидемио-логического мониторинга и достигла 85,7%.
Начиная с 2011 г. наблюдается сокращение частоты регистрации субгенотипа IIIA, вплоть до отсутствия случаев в 2012 г. (сведения по состоянию на июнь 2012 г.). При этом явно обозначилась и тенденция к снижению уровня заболеваемости гепатитом А.
Определенной, по своему уникальной, особенностью обладают вирусы субгенотипа IB: все они связаны с завозными случаями гепатита А, причем страной происхождения вируса практически всегда является Египет (исключение составляет вирус 2006 г., происхождение которого установить не удалось). Интересен тот факт, что, несмотря на то что все штаммы из одного географического региона, анализируемый участок генома содержит от 3 до 7 нуклеотидных замен (на 315 пар нуклеотидов), в том числе и несинонимичных. В сентябре 2011 г. был выявлен случай гепатита А через 25 дней после возвращения из г. Одесса (Украина). Секвенирование показало, что вирус также относится к субгенотипу IB, причем установленная последовательность полностью совпадает с депонированным в базе GenBank фрагментом генома штамма Nor-10, вызвавшим завозной случай гепатита А в Норвегии в 1996 г. (указанная авторами страна происхождения - Израиль) и достоверно объединяется в один кластер с изолятом Egypt_ swS2, выделенном в Египте в 2007 г.
Затруднительным оказалось установление путей передачи для вирусов субгенотипа IIIA. Обусловленные одним и тем же вирусом случаи заболевания регистрируются в противоположных концах города либо, если в одном районе,
связывают незнакомых друг с другом людей. Тем не менее определенную надежду на установление источников инфекции дает формирование двух достоверных кластеров, каждый из которых содержит ВГА с установленной завозной природой. В обоих случаях группы включают вирусы из Таджикистана. Последнее позволяет предположить возможность завоза ВГА с продуктами питания из указанного региона (к примеру, у большинства заболевших имеются сведения об употреблении кураги и других сухофруктов без достаточной обработки). Однако для подтверждения или опровержения этой гипотезы необходимо проведение целевых исследований.
Закономерно выявление в семейных очагах вирусов с полностью совпадающими анализируемыми участками. Вместе с тем в некоторых случаях результаты молекулярных исследований исключают очевидную, на первый взгляд, эпидемиологическую связь между отдельными случаями заболевания. Так, например, в сентябре 2009 г., через месяц после возвращения из Таджикистана острым гепатитом А заболел мальчик шести лет. Секвенирование и филогенетический анализ полученного фрагмента показали близость выделенного вируса к штамму субгенотипа 111А, вызвавшему в 2007 г. вспышку в Южной Корее, что подтверждает завозную природу вируса. Спустя 27 дней с аналогичным диагнозом в инфекционную клиническую больницу поступил его двадцатилетний брат, а еще спустя 18 дней - близкая подруга брата. Причем оба молодых человека учились в одной группе одного из вузов г. Минска. Очевидность цепочки случаев была нарушена данными молекулярно-биологического исследования, согласно которым вирус, полученный из сыворотки девушки, не только не имел близкого сходства с вирусом из семейного очага, но и принадлежал к другому генотипу. Значительно позже, в марте 2011 г., был выявлен похожий ВГА у человека, за 22 дня до начала заболевания посещавшего г. Вильнюс (Литва). Оба вируса оказались близки к изоляту НА//^Е2007/08-234 (код доступа в ОепВапк Еи825860.1), детектированному в Германии в 2007 г. Таким образом, все зарегистрированные в 2011-2012 гг. в Минске случаи ГА, обусловленные первым генотипом возбудителя, оказались завозными: страной происхождения еще одного вируса субгенотипа 1А является Киргизия, субгенотипа 1В - Египет. В этом же году завозными из Таджикистана оказались и два случая ГА, вызванные вирусом субгенотипа 111А.
В целом проведенная работа показала, что только комплексная оценка данных эпидемиологического обследования и результатов молекулярно-биологиче-ских исследований позволяет с большей долей вероятности установить эпидемиологическую связь между случаями заболеваний ГА, пути и факторы распространения инфекции, существенно повысить эффективность эпидемиологического надзора за ГА. Вместе с тем следует отметить, что молекулярно-биологические исследования выявленных вариантов ВГА не всегда сопровождаются эпидемиологическими данными. Так, при сравнении выявленных нуклеотидных последовательностей ВГА с депонированными в международной базе вепВапк, нельзя не отметить наличие близкородственных вирусов в различных географических регионах без указания иногда даже базовых эпидемиологических сведений об инфекционном агенте, что затрудняет определение места происхождения вируса и молекулярно-эпидемиологическую интерпретацию полученных результатов.
С учетом полученных данных и с целью совершенствования системы эпидемиологического надзора за ГА в Республике Беларусь путем организации систематического молекулярно-эпиде-миологического мониторинга за циркулирующей популяцией возбудителя разработана соответствующая инструкция по применению [3]. Документ определяет содержание и порядок осуществления лабораторных молекулярно-биологических исследований, направленных на повышение эффективности контроля вирусного гепатита А. Инструкция предназначена для специалистов санитарно-эпидемиологической службы и других организаций здравоохранения, осуществляющих эпидемиологический надзор, лабораторную диагностику, молекулярно-эпидемиоло-гический и серологический мониторинг, противоэпидемические и профилактические мероприятия в отношении гепатита А. Она содержит следующие разделы и подразделы: общие положения; основные этапы мониторинга; перечень необходимого оборудования, реактивов, препаратов, изделий медицинской техники; отбор и обработка проб для генотипирования ВГА; молекулярно-биологические исследования; амплификация анализируемого фрагмента генома ВГА (выделение РНК ВГА, реакция обратной транскрипции, ПЦР учет результатов, очистка и измерение концентрации фрагмента ДНК); сек-венирование фрагмента ДНК; обработка и компьютерный анализ нуклеотидных
№12 • 2012
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ |б7
последовательностей фрагмента генома ВГА (первичная обработка нуклеотидных последовательностей, генотипирование ВГА, филогенетическая реконструкция); оценка и использование результатов мониторинга.
Таким образом, систематический молекулярно-эпидемиологический мониторинг вируса гепатита А является неотъемлемой частью современной системы эпидемиологического надзора за ГА. Он способствует установлению связи между источниками инфекциями (случаями заболеваний), определению путей и факторов распространения возбудителя, позволяет определять спектр
циркулирующих штаммов, их доминирующие субгенотипы, отслеживать их смену, осуществлять прогнозирование эпидси-туации. Кроме того, молекулярно-эпиде-миологическое исследование является важным инструментом при расшифровке вспышек инфекции и изучении путей миграции возбудителя в региональном и глобальном масштабе.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Гудков В.Г., Плотникова К.Ю., Зуева В.Л. // Здравоохранение. - 2010. - № 10. - С. 36-42.
2. Карпов И.А., Яговдик-Тележная Е.Н. // Мед. новости. - 2003. - № 7. - С. 64-66.
3. Метод генотипирования вируса гепатита А: инструкция по применению. Утв. 18.07.2012 г., рег. № 026-12 11. - Минск, 2012.
4. Михайлов М.И., Шахгильдян И.В. // Лечащий врач. - 2001. - № 8.- С. 50-53.
5. Плотникова К.Ю., Гудков В.Г. // Здравоохранение. - 2011. - № 12. - С. 30-35.
6. Akriviadis E.A., Redeker A.G. // Ann. Intern. Med. -1989. - Vol. 110, N 10. - P. 838-839.
7. Hutin YJ., Pool V., Cramer E.H. et. al. // N. Engl. J. Med. - 1999. - Vol. 340, N 8. - P. 595-602.
8. Nainan O.V, Armstrong G.L., Han X.H. et. al. // J. Infect. Dis. - 2005. - Vol. 191. - P. 957-963.
9. Vento S, Garofano T, Renzini C. et al. // N. Engl. J. Med. - 1998. - Vol. 338, N 5. - P. 286-290.
10. Viral Hepatitis Prevention Board meeting on Hepatitis A and E: Update on Prevention and Epidemiology, Antwerp, Belgium, March 12-13, 2009 // Viral hepatitis. - 2009. - Vol. 18, N 1. - P. 2-5.
Поступила 15.10.2012 г.
Диагностика и лечение заболеваний аногенитальной зоны, обусловленных папилломавирусной инфекцией
Вергейчик Г.И.
Гомельский государственный медицинский университет
Viarheichyk H.I.
Gomel State Medical University, Belarus
Diagnostics and treatment of anogenital zone lesions aroused
with human papillomavirus infection
Резюме. В статье представлены результаты обследования 102 пациенток с генитальными папилломами, лейкоплакией, дисплазией и раком вульвы и влагалища. Основываясь на полученных результатах, можно предположить важную роль вируса папилломы человека в развитии поражений вульвы и влагалища и пересмотреть значимость генотипов высокого и низкого онкогенного риска в развитии доброкачественных новообразований, предраковых состояний и злокачественных опухолей вульвы и влагалища. Ключевые слова: вирус папилломы человека, генитальные папилломы, рак вульвы и влагалища.
Summary. The author presents her results in examination of 102 patients wtth genttal warts, leykoplakia, dysplasia and cancer of vulva and vagina. Based on the analysis of the received results, the author supposes important role of Human papillomaviruses in development of vulval and vaginal lesions and should overestimate role of different types of papillomaviruses in development of different genttal diseases. Keywords: high and low oncogenous risk types of papillomaviruses, genttal warts, vulval and vaginal cancer.
Вирус папилломы человека (ВПЧ) является этиологическим фактором не только предрака и рака шейки матки, но и заболеваний аногенитальной зоны. Заболеваемость интраэпители-альными неоплазиями вульвы (VIN) резко возросла в последнее десятилетие. В США заболеваемость VIN3 увеличилась более чем на 400% с 1973 по 2000 г., а заболеваемость инвазивным раком вульвы возросла на 20%. Такие же тенденции отмечены и в ряде других стран. Особенно отмечен рост заболеваемости среди молодых женщин. В Великобритании доля женщин в возрасте до 50 лет с инвазивным раком вульвы почти удвоилась за период с 1975 по 2004 г. - с 6 до 11%. Рак вульвы, ассоциированный с ВПЧ-инфекцией, встречается гораздо
чаще у женщин младше 56 лет (около 77% случаев), чем у пациенток 56 лет и старше (41% случаев) [4, 5].
Основные типы ВПЧ, выявляемые при поражениях вульвы, влагалища, шейки матки и промежности, - 6, 11, 16 и 18; более 90% случаев генитальных бородавок связаны с ВПЧ типов 6, 11 [8]. В возрасте 15-49 лет около 40% мужчин и женщин инфицированы папилломавирусами, в 65% случаев генитальные папилломы развиваются у лиц младше 25 лет [7].
Вульварная интраэпителиальная нео-плазия ранее считалась патологией женщин старше 40 лет, однако все чаще в последние годы диагностируется и у молодых пациенток (25-40 лет). Одна из причин формирования дисплазии многослойного плоского эпителия (МПЭ)
вульвы - длительная персистенция ВПЧ. Установлена прямая корреляция между наличием ВПЧ 16-го и 18-го типов в тканях вульвы и наличием VIN у молодых женщин. Причем сочетание вульварной интраэпителиальной неоплазии и церви-кальной интраэпителиальной неоплазии наблюдается в 35-60% случаев [1, 2]. Риск прогрессии интраэпителиальной не-оплазии в инвазивную форму рака у женщин репродуктивного возраста составляет 6-7%. Сочетание VIN 3 и инвазивного плоскоклеточного рака наблюдается у 2-18% больных [2].
По данным ряда литературных источников, наиболее часто в случае предрака и рака вульвы выявляют ВПЧ типов 16, 18, 31, 33, из которых вирус 16-го типа является доминирующим [3]. Несмотря на то
