CC BY
43619:616-001.28/.29:615.373
молекулярно-биологические принципы разработки противорадиационных диагностических и лечебно-профилактических средств
Г.В.Конюхов - доктор биологических наук, профессор, зав. отделом; Н.Б.Тарасова - доктор биологических наук, завлабораторией; Р.Н.Низамов - доктор ветеринарных наук, профессор, гл.научный сотрудник; Н.М.Василевский - доктор ветеринарных наук, профессор, зам. директора;
Р.М.Асланов - доктор биологических наук, профессор, завлабораторией;
В.И.Великанов - доктор биологических наук, профессор.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420075, г.Казань, Научныйгородок-2, тел. +7(843)239-53-19, e-mail: vnivi@mail.ru).
Опыт применения лекарственных препаратов в практике по ликвидации последствий радиационных аварий и в зонах повышенного радиационного фона, необходимость использования более доступного сырья растительного и биологического происхождения, снижение себестоимости лечебных и профилактических средств при лучевых поражениях явились основой для проведения клинических испытаний на лабораторных и сельскохозяйственных животных. Материалы и методы. Хиноидные радиотоксины получали их облученных клубней картофеля, диагностические сыворотки - от гипериммунизированных кроликов и овец, эритроцитарные диагностикумы для РНГА и ИФА - на основе глобулинов из гипериммунных сывороток. Аутогемостимуляцию проводили предварительно облученной кровью. Терапевтическую активность сывороток оценивали по 30-суточной выживаемости облученных животных. Результаты исследований. Экспериментально установлено, что титры антигенов в РНГА и ИФА зависят от степени лучевой болезни и могут быть положены в основу ранней ее диагностики. После радиационного воздействия радиотоксины в сыворотке крови обнаруживаются уже на 1-3 сут в титрах 1:4-1:16, индекс флуоресценции в зависимости от тяжести лучевой болезни - выше или ниже 0,8, накапливаются иммуноглобулины класса Е, цитокины ИЛ-4 и ИЛ-5, нарушается иммунорегуляторный индекс Т-хелперов и Т-супрессоров. Установлены оптимальные схемы иммунизации овец, свиней, лошадей с целью получения гипериммунных и лечебных сывороток. Однократное подкожное введение микробного полиантигена из расчета 2,5*10 м.к/кг за 7-90 сут до летального облучения формировало в организме лабораторных и сельскохозяйственных животных радиорезистентность, обеспечивающую 60-80%-ную защиту их от радиационной гибели. Изготовлены 64 вида потенциальных радиопротекторов различного происхождения и проверена их лечебная и профилактическая эффективность. Заключение. Установлено, что сконструированные по новой технологии радиозащитные препараты обеспечивают высокоточную диагностику, эффективную терапию и профилактику радиозащитных поражений животных.
КлюЧЕВЫЕ СлоВА: лучевое поражение, гомеостаз, диагностика, лечение, профилактика, эффективность.
Известно, что радиационные поражения сопровождаются сложнейшим симптомокомплек-сом, включающим патологию трех важнейших звеньев гомеостаза организма: иммунной, нейроэндокринной и гемопоэтической. При этом ведущую роль играют индуцированные ионизирующими излучениями токсические комплексы (первичные и вторичные радиотоксины), ответственные за включение пусковых механизмов развития процессов лучевого поражения. Вклад радиотоксинов в общее поражающее действие радиации на животный организм существен. Первый - это общность основных механизмов радиационного поражения клеток живых организмов. Вторым существенным аргументом является факт, что все пути, направленные на снижение образования и удаление радиотоксинов из облученного организма приводят к значительному повышению выживаемости облученных животных.
Вопрос о времени образования радиотоксинов при лучевой болезни и их роли в начальных процессах, идущих в облученном организме и определяющих дальней-
шее течение и даже исход лучевого поражения, имеет значение для терапии лучевых поражений [4].
Своевременное обнаружение указанных радиотоксичных субстанций в первые часы после облучения, эффективная нейтрализация их в облученном организме и предупреждение образования указанных токсических веществ в макроорганизме должны лежать в основе разработки современных молекулярно-биоло-гических диагностических тест-систем, средств лечения и профилактики радиационных поражений.
Повышение биологической активности облученной крови происходит в результате радиационной интерфазной гибели клеток крови и повышения в ней продуктов распада этих клеток; радиационного разрушения какого-либо компонента плазмы крови; образования под влиянием облучения плазмы и форменных элементов крови биологически активных веществ - радиотоксинов. Последние, реагируя с аминогруппами глобулинов крови, будут давать устойчивые антигены с хиноидной детерминантной группой. При трансфу-
зии облученной крови в интактный организм образовавшиеся радиотоксины в силу большого разбавления будут воздействовать на мембраны клеток тканей как триггер-эффекторы, стимулируя размножение стволовых клеток, их дифференциацию, т.е. кроветворение в целом. Белковые антигены с хиноидными детерминантными группами будут вызывать образование аутоантител, направленных на нейтрализацию радиотоксинов, что и будет способствовать лучшему перенесению больными лучевой терапии, повышению неспецифического иммунитета к инфекции [4].
Ионизирующая радиация относится к числу агентов, которые вызывают значительные изменения в деятельности всех органов и систем. Установлено, что после облучения снижается эффективность иммунизации. Введение вакцин в первые дни после облучения не вызывает формирования активного иммунитета [5]. Повышения специфической резистентности удается добиться только иммунизацией через 1 мес после облучения в среднелетальных дозах. Было отмечено, что после облучения возрастает чувствительность организма к токсическому действию убитых вакцин, к инфекционному процессу, вызванному вакцинным штаммом возбудителя. При облучении вакцинированного организма повреждающее действие на формирование активного иммунитета менее выражено, и изменяется его реакция на воздействие ионизирующей радиации [1].
Материалы и методы. В качестве специфических лучевых антигенных и аллергенных субстанций использовали хиноидные радиотоксины фитогенного происхождения. Для получения последних использовали клубни картофеля, которые облучали на гамма-установке «Исследователь» в дозе 40 кГр и подвергали этаноловому экстрагированию по С.К.Мельниковой [6] с последующим удалением экстрагента на вакуумном испарителе. Концентрированный экстракт, разведенный в соотношении 1:24, использовали в качестве стандартного антигена в РНГА- и ИФА-тестах, иммунизирующего агента при получении гипериммунных диагностических сывороток, а также в качестве аллергенного препарата.
В полученных аллергенах-радиотоксинах определяли содержание хинонов и липидов по Кузину A.M. [3], а их идентификацию осуществляли методом парамагнитного резонанса (ЭПР) по Svistunenko D.H. et al. (1997) в нашей модификации [2].
Для получения диагностических сывороток кроликов и овец подвергали гипериммунизации лучевыми антигенами, используя различные (двух-, трех-, четырехцикличные) схемы иммунизации. Глобулины, полученные из гипериммунных сывороток, были использованы в качестве сенситина при изготовлении эритроцитарного диагностикума для РНГА и меченых пероксидазой иммуноферментных конъюгатов (ИФК) для ИФА. При этом мечение глобулинов ферментом проводили по Clark R., Engwall E. (1981), танизацию, формалинизацию и сенсибилизацию эритроцитов для
получения диагностикума - по Boyden St. (1961), мечение глобулинов флуорохромом - по Coons А.Н. (1959).
После проверки на активность, специфичность и стабильность изготовленные противорадиационные диагностикумы были использованы в иммунохимиче-ских тест-системах (МФА, ИФА и РНГА) для обнаружения лучевых антигенов-радиотоксинов облученных животных, а аллергенный препарат - в интрадермальной пробе для выявления радиосенсибилизации.
С целью конструирования противорадиационных лечебных препаратов проводили иммунизацию животных антигенами зоогенного, микробного и фитогенного происхождения с использованием различных схем гипериммунизации, а также проводили гемостимуляцию животных облученной аутокровью и облучение нормальных, гипериммунных сывороток и глобулинов. Противолучевую терапевтическую активность сывороток оценивали по 30-сут выживаемости летально-облученных лабораторных и сельскохозяйственных животных.
Для конструирования радиопротектора на основе веществ микробного происхождения использовали соматический, протективный антиген, анатоксин и радиотоксин кишечной палочки. Оптимальные соотношения компонентов микробного радиопротектора устанавливали экспериментальным путем. У полученного полиантигенного комплекса изучали токсические, раздражающие, сенсибилизирующие и радиозащитные свойства с использованием общепринятых в токсикологии и радиобиологии методик.
Результаты исследований. Результаты анализа проб периферической крови необлученных (отрицательный контроль), облученных (положительный контроль), иммунизированных бактериальными вакцинами (гетерологичные контроли) лабораторных (белые мыши, белые крысы, кролики, морские свинки) и сельскохозяйственных (овцы, свиньи, лошади) животных в динамике (через 1, 2, 3, 7, 10, 14, 21, 28 сут после облучения) показали, что уже на 1-3 сут после радиационного воздействия в сыворотке крови обнаруживаются радиоиндуцированные антигены-радиотоксины в титрах 1:4-1:16 в РНГА и ИФА и флуоресцирующие антигенсодержащие клетки мононуклеарных фагоцитов с индексом иммунофлуоресценции (ИФ) более 0,8 в МФА. Причем, титр антигенов-радиотоксинов в исследуемых тест-системах имел дозовую и временную зависимость, повышаясь с увеличением дозы и срока облучения, достигая пика к 3-7 и убывая к 10-15 суткам.
Сопоставительный анализ результатов МФА-, ИФА- и РНГА-тестов и клинических проявлений лучевой болезни показал, что облученные животные, имеющие индекс иммунофлуоресценции ниже 0,8 или титр антигенов в РНГА и ИФА до 1:8, легче переносили лучевую болезнь, имели тенденцию к выживанию. У животных, имеющих более высокие титры антигена (1:16-1:32) и индексы иммунофлюоресценции выше 0,8, лучевая болезнь протекала в тяжелой форме, которая в большинстве случаев заканчивалась леталь-
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ
№ 3/2016
ным исходом. Следовательно, диагностическими титрами антигенов-радиотоксинов в периферической крови животных в ИФА- и РНГА-тестах следует считать 1:8, а индекс иммунофлюоресценции - 0,8. Отрицательными прогностическими критериями исхода лучевой болезни следует считать 2-3-кратное превышение диагностических титров антигенов в РНГА и ИФА и индекса иммунофлуоресценции в МФА-тесте.
Параллельные аллергические исследования показали, что радиосенсибилизация животных гамма-лучами сопровождается развитием внутрикожной ги-перэргической реакции на введение специфического аллергена, накоплением 1д Е-антител, высвобождением медиатора аллергии - гистамина из клеток-мишеней аллергии - базофилов и достоверным увеличением концентрации цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-5, а также нарушением иммунорегуляторного индекса Т-хелпе-ров и Т-супрессоров (Тх/Тс).
На следующем этапе проводили опыты по разработке и усовершенствованию методов и средств терапии острой лучевой болезни животных. При этом на трех видах сельскохозяйственных (лошади, овцы, свиньи) животных испытывали 11 вариантов схем иммунизации с использованием 3 видов антигенов зоогенного и бактериального происхождения.
В результате проведенных исследований установлено, что 3 схемы оказались наиболее эффективными: овечья - схема №1, свиная - схема №4 и лошадиная - схемы №1, 2, которые обеспечивали получение гипериммунных лечебных сывороток, предотвращающих гибель 62,5-75% облученных в ЛД100 лабораторных животных.
Оптимальная схема ги10п0ериммунизации овец, обеспечивающая выживаемость 66,7% облученных в ЛД100 белых крыс (9,0 Гр), предполагала облучение в дозе 1,0 Гр, иммунизацию паратифозной вакциной через 21 день после первого облучения и повторное радиационное воздействие в дозе 3,0 Гр.
Высокоактивная лечебная свиная сыворотка, обеспечивающая выживание 66,7% облученных в дозе ЛД100 белых крыс, была получена по схеме №4, предполагающей облучение животных в дозе 1,0 Гр, через 21 сут 8-кратную с интервалом в 4-5 дней иммуниза-
цию тканевыми антигенами из органов облученных в дозе 9,0 Гр белых крыс.
Наиболее активная лечебная сыворотка была получена от лошадей, подвергнутых предварительной аутогемостимуляции (подкожное введение облученной экстракорпорально в дозе 250 Гр аутокрови и через 2 ч облучение в дозе 0,5 Гр), которая обеспечивала защиту от радиационной гибели 75% облученных в дозе ЛД100 белых крыс (1 схема). Применение схемы №2, предполагающей однократное подкожное введение облученной в дозе 250 Гр аутокрови, также обеспечивало получение весьма активной противолучевой лошадиной сыворотки, которая защищала от радиационной гибели 66,6% облученных в ЛД100 лабораторных животных, что значительно облегчает и упрощает технологию получения лечебной сыворотки.
Для более полной оценки противолучевой эффективности полученных по вышеописанным схемам сывороток эксперименты проведены на 3 видах лабораторных (80 белых мышей, 80 белых крыс и 24 кролика) животных. Животные каждого вида были разделены на 8 групп и подвергнуты гамма-облучению на установке «Пума» при мощности экспозиционной дозы 3,13x10-5 Кл/(кг*с) в дозах 7,7; 9,0 и 11,0 Гр соответственно.
Через 24 ч после облучения животным 1-й группы однократно подкожно вводили гемостимулированную сыворотку, полученную путем подкожного введения облученной в дозе 250 Гр аутокрови, 2-й группе - иммунную сыворотку, полученную на 15 сут после вакцинации радиозащитным микробным полиантигеном; животным 3-й группы - нормальную сыворотку (контроль препаратов), животным 4-й группы препараты не вводили (контроль облучения), 5-я группа служила биологическим контролем. Дозы вводимых препаратов для белых мышей составляли 0,1 мл, для белых крыс - 0,5, для кроликов - 1,0 мл.
Радиозащитную эффективность испытуемых средств оценивали по 30-суточной выживаемости облученных животных, регистрируя в динамике количество выживших и павших животных .
Результаты изучения эффективности испытанных средств приведены в таблице 1.
Таблица 1
Выживаемость животных, леченных после облучения испытуемыми препаратами
Препарат Белые мыши Белые крысы Кролики
к п в % к п в % к п в %
Гемостимулированная сыворотка 10 3 7 70 10 3 7 70 3 1 2 66,6
Сыворотка против радио-защитного полиантигена 10 4 6 60 10 4 6 60 3 2 1 33,3
Нормальная сыворотка 10 7 3 30 10 7 3 30 3 2 1 33,3
Контроль облучения 10 10 0 0 10 10 0 0 3 3 0 0
Биологический контроль 10 0 10 100 10 0 10 10 3 0 3 100
Примечание: к - количество животных в опыте, п - пало, в - выжило, % - выживаемость
Из представленных в таблице 1 данных видно, что под влиянием испытанных средств выживаемость белых мышей, белых крыс и кроликов, облученных в дозах ЛД80-100/30, увеличивалась до 70 (белые мыши и белые крысы) и 60 % (кролики). Наиболее высокой радиозащитной активностью для всех трех видов животных обладали гемостимулированная и антибактериальная сыворотки.
В опытах на белых мышах и белых крысах по препаратам 1, 2, 3 получены идентичные данные, в опытах на кроликах при применении препарата 2 результаты были менее выраженными.
Повторные опыты проводили на 60 белых мышах-самцах, живой массой 20-22 г, которых облучали в дозе 7,7 Гр. Через 24 ч после радиационного воздей-
Примечание: * - Р <0,05; ** - Р <0,01
Из данных таблицы 2 видно, что лечение облученных животных сывороточными препаратами предупреждало развитие панцитопении у облученных животных, что выражалось меньшим снижением клеток как лейкоцитарного, так и эритроцитарного ряда. Хотя в период разгара лучевой болезни у облученных и ле-
ствия им подкожно однократно вводили гемостимули-рованную сыворотку (1 группа), иммунную сыворотку против радиозащитного полиантигена (2 группа). Животные 3-й и 4-й групп служили контролем облучения и биологическим контролем.
Терапевтическую эффективность испытуемых препаратов оценивали по изменению гематологических показателей, содержанию миелокариоцитов в костном мозге, эндогенных колоний в селезенке, малонового диальдегида, а их биологическую активность - по кислотной устойчивости эритроцитов (ПУЭР).
Результаты изучения влияния испытанных лечебных средств на гематологические показатели белых мышей представлены в таблице 2.
ченых животных эти показатели были сниженными по сравнению с контролем, однако количество лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов у леченых животных было достоверно выше, чем у облученных животных без лечения. У последних, на протяжении всего опыта вплоть до их радиационной гибели, восстановление
Таблица 2
изменение показателей периферической крови белых мышей после облучения и лечения
Препарат Время после облучения, сут
3 5 7
Лейкоциты (х109/л)
Гемостимулированная сыворотка 3,70+0,49** 3,9+0,5 4,7+0,7**
Контроль облучения 0,95±0,1* 1,0+0,3** 1,0+0,5*
Биологический контроль 6,40+0,58 6,5+0,6 6,3+0,6
Нейтрофилы (х109/л)
Гемостимулированная сыворотка 0,70+0,05 0,73+0,08 0,71+0,07
Контроль облучения 0,50+0,09* 0,40+0,07* 0,43+0,05*
Биологический контроль 0,90+0,01 0,91+0,09 0,89+0,07
Лимфоциты (х109/л)
Гемостимулированная сыворотка 1,30+0,10** 1,40+0,30** 1,41+0,50**
Контроль облучения 0,40+0,08* 0,43+0,07* 0,41+0,05*
Биологический контроль 1,80+0,02 1,90+0,10 1,70+0,20
Тромбоциты (х109/л)
Гемостимулированная сыворотка 297,0+27,9 299,3+29,5 289,1+27,7
Контроль облучения 186,0+35,1* 177,5+37,0* 169,3+40,5*
Биологический контроль 315,3+29,2 311,7+35,3 313,3+26,4
Эритроциты (х1012/л)
Гемостимулированная сыворотка 4,97+0,11 4,99+0,30 5,01+0,20
Контроль облучения 4,30+0,14 4,50+0,26 4,40+0,13
Биологический контроль 5,96+0,05 6,01+0,79 5,89+0,07
гематологических показателей не происходило. У животных, леченных гемостимулированной сывороткой, восстановление сдвигов как эритроцитарного, так и лейкоцитарного рядов наступало на 28-30 сут после облучения после применения.
Результаты исследований показали, что полученные биологические препараты обладали и высоким профилактическим эффектом. Гипериммунную сыворотку вводили подкожно за 1-10 сут до облучения в сублетальных и летальных дозах из расчета 100-125 мг/кг живой массы молодым и 200-250 мг/кг - взрослым животным. Гомологичные препараты вводили однократно, а гетерологичные - в 3 приема. Использование вышеуказанных препаратов с профилактической целью оказывает на облученный организм радиозащитный эффект, основанный на нейтрализации радиотоксинов, радиоиндуцированных антигенов и других агрессивных метаболитов, нормализуя сдвиги хелперно/супрессорного соотношения Т-лим-фоцитов, стимулируя В-лимфоциты и усиливая сопротивляемость организма к разрушительному действию ионизирующего излучения.
Результаты проведенных исследований показали, что как свиные и овечьи, так и лошадиные сыворотки, полученные по вышеприведенным оптимальным схемам иммунизации, являются достаточно эффективными и пригодными для получения активных лечебных сывороток. При этом оптимальными продуцентами гипериммунных противолучевых сывороток с учетом биологии животных-доноров и технологических особенностей производства сывороток следует считать лошадей, хотя отдельные схемы иммунизации овец и свиней позволяют получать активные сыворотки, однако прижизненное получение последних от этих животных крайне ограничено и экономически невыгодно.
На следующем этапе работы проводили исследования по разработке средств специфической профилактики радиационных поражений. Поиск радиопротекторов был проведен среди препаратов бактериальной природы, исходя из общеизвестного факта о том, что микробы-представители нормальной микрофлоры кишечника (кишечные палочки, шигел-лы и т.д.) являются основными возбудителями эндогенной инфекции при ОЛБ. Поэтому в теоретическом плане представляет интерес определить возможности проведения иммунизации облученных животных против отдельных представителей эндогенной инфекции с целью снижения тяжести течения лучевой болезни.
Литература
В процессе работы методами термо- и радиоинактивации, водно-солевого, этанолового и эфирно-ацетонового экстрагирования изготовлены 64 вида потенциальных биорадиопротекторов - антигенов микробного (экзо-, эндотоксины, радиотоксин, протек-тивный антиген) происхождения.
Для получения протективного антигена, анатоксина и радиотоксина в качестве оптимального продуцента отобран штамм «ПЛ-6» кишечной палочки, обладающий широким спектром антигенов.
С учетом биологической активности и механизма действия отдельных компонентов сконструирован полиантигенный комплекс, включающий протективный антиген, анатоксин и радиотоксин в следующем соотношении компонентов: 90 частей протективного антигена (2,5х1010 м.к./мл), 5 частей 1 %-ного анатоксина и 5 частей 0,1 %-ного радиотоксина.
Полученный полиантигенный комплекс не обладал раздражающими, сенсибилизирующими и токсическими свойствами для теплокровных животных, а при однократном подкожном введении индуцировал образование антиадгезивных, протективных и антирадио-токсических антител.
Однократное подкожное введение микробного полиантигена из расчета 2,5х109 м.к/кг за 7-90 сут до летального облучения формировало в организме лабораторных и сельскохозяйственных животных радиорезистентность, обеспечивающую 60-80%-ную защиту их от радиационной гибели.
Заключение. Формирование радиорезистентности у привитых микробным полиантигеном животных осуществлялось за счет синтеза антиадгезивных, протективных, антитоксических и антирадиотокси-ческих антител, а также усиления синтеза цитокинов, стимулированных соответствующими компонентами использованного радиозащитного препарата.
Лечебная, профилактическая и диагностическая эффективность разработанных препаратов была подтверждена в межведомственных комиссионных испытаниях с положительной оценкой.
Результаты проведенных исследований и комиссионной апробации с положительным результатом легли в основу разработанных нами нормативных документов (ТУ, Инструкции, Наставления) по изготовлению, контролю и применению противорадиационных диагностикумов и лечебно-профилактических средств, которые утверждены Департаментом ветеринарии МСХ рФ.
1. Препараты на основе продуктов метаболизма Е.соИ при радиационных поражениях животных / К.Н.Вагин [и др.] // Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации: мат. 3 съезда вет. фармакологов и токсикологов России, г. СПб., 8-10 июня 2011 г. - СПб., 2011. - С. 88-90.
2. Исследование радиотоксинов в крови животных методом ЭПР / М.И.Ибрагимова, В.Ю.Петухов, Г.В.Конюхов, Р.Н.Низамов // Материалы Международного. семинара по современному состоянию ЭПР. - Казань, 2001. - С. 79-83.
3. Кузин, А.М. Образование и роль хинонов в начальных процессах при радиационных поражениях животных / А.М.Кузин // Радиобиология. - 1966. - Т. 2, Вып. 5. - С. 681-684.
4. Кузин, А.М. Радиотоксины / А.М.Кузин, В.А.Копылов. - М.: Наука, 1983. - 174 с.
5. Радиация и вакцинация / В.Н.Мальцев, О.В.Смирнова, В.А.Стрельников, Л.И.Муравьева. - М.: Медицина, 1976. - 192 с.
6. Мельникова, С.К. Количественные закономерности образования хинонов в гамма-облученной растительной ткани / С.К.Мельникова // ДАНН СССР. - 1965. - Т. 164, Вып. 6. - С. 1409-1412.
7. Boyden, S. The adsorption of proteins on erythrocytes treated with tannic acid and subsequent hemagglutination by antiprotein sera / St.Boyden // J. Exp. Med. - 1961. - V. 93. - Р. 107-109.
8. Clark, R. Enzime-linked immunoagar - Bent assay (ELISA) / R.Clark, E.Eugwall // Enzym - Immunoassay / E.T.Maggio ed. - Florida: Boca Raton, 1981. - Р. 167-179.
9. Coons, A.H. The diagnose application of fluorescent antibodies / A.H.Coons // Z.Pathel. Ract. - 1959. -№ 22. - Р. 700-723.
MOLECULAR AND BIOLOGICAL PRINCIPLES OF DEVELOPING DIAGNOSTIC, THERAPEUTIC AND PREVENTIVE MEANS AGAINST RADIATION SICKNESS
Konyuhov G.V. - Doctor of Biology, professor; Tarasova N.B. - Doctor of Biology; Nizamov R.N. - Doctor of
Veterinary Medicine, professor; Vasilevsky N.M. - Doctor of Biology, professor; Aslanov R.M. - Doctor of
Biology, professor; Velikanov V.I. - Doctor of Biology, professor.
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: vnivi@mail.ru).
An experience of using therapeutic drugs to eradicate the consequences of radiation and accidents and areas with higher radiation background, the necessity of using cheaper materials of herbal and biological origin, lower cost of drugs treating and preventing irradiation sickness were fundamental for clinical trials on laboratory and livestock animals. Materials and methods: quinoid radiotoxins were produced from irradiated potato crops, diagnostic serum -from hyperimmunized rabbits and sheep; erythrocyte diagnostic tools for indirect hemagglutination test and ELISA were produced basing on globulins from hyperimmune sera. Autohemotherapy was carried out using preliminary irradiated blood. The therapeutic efficiency of sera was evaluated according to 30-day survival rate of the irradiated animals. The investigation results showed that after exposure to radiation indirect hemagglutination test and ELISA detected radiotoxins in serum already at 1-3 days in titers of 1:4-1:16, the index fluorescence was more or less than 0.8depending on the severity of radiation sickness, class E immunoglobulins, IL-4 and IL-5cytokines accumulate, immunoregulatory index of T-helper and T-suppressor was misbalanced. The immunization optimal schedule for sheep, pigs, horses to obtain therapeutic and hyperimmune sera was developed. A single subcutaneous introduction of microbial polyantigen in ratio of 2.5x10s v/kg at 7-90 days before the lethal exposure to radiation formed radioresistance in body of laboratory and livestock animals and allowed 60-80% protection from radiation. 64 kinds of potential radioprotective agents of different origin and their therapeutic and prophylactic efficacy was verified. Conclusion: the designed radioprotective agents provide a highly accurate diagnosis, effective treatment and prevention of animal radiation injuries.
KEYwORDS: radiation injury, homeostasis, diagnostics, treatment, prevention measures, efficiency.
References
1. Vagin, K.N. Preparaty na osnove produktov metabolizma E.coli pri radiatsionnyh porazheniyah zhivotnyh [Using drugs from E.coli metabolic products at animal radiation injuries] / K.N.Vagin [et al.] // Aktualniye problemy veterinarnoy farmakologii, toksikologii, i farmatsii - Current problems of veterinary pharmacology, toxicology and pharmacy: proceedings from 3rd meeting of veterinary pharmacologists and toxicologists of Russia, St. Petersburg, June 8-10, 2011 - St. Petersburg, 2011. - P. 88-90.
2. Issledovaniye radiotoksinov v krovi zhivotnyh metodom EPR [Studying radiotoxins in animal blood using the method of electron spin resonance] / M.I.Ibragimova, V.Yu.Petuhov, G.V.Konyuhov, R.N.Nizamov // Proceedings from international workshop on current state of EPR]. - Kazan, 2001. - P. 79-83.
3. Kuzin, A.M. Obrazovaniye i rol hinonov v nachalnyh protsessah pri radiatsionnyh porazheniyah zhivotnyh [Formation and a role of quinines in initial processes at animal radiation injuries] /A.M.Kuzin // Radiobiologiya. - 1966. - Vol. 2 - №.5. - P. 681-684.
VA ЕТЕРМНАРНЫЙ
Врач
4. Kuzin, A.M. Radiotoksiny [Radiotoxins] / A.M.Kuzin, V.A.Kopylov. - Moscow: Nauka, 1983. - 174 p.
5. Radiatsiya i vaktsinatsiya [Radiation and vaccination] / V.N.Maltsev, O.V.Smirnova, V.A.Strelnikov, L.I.Muravyova. - Moscow: Meditsina, 1976. - 192 p.
6. Melnikova, S.K. Kolichestvenniye zakonomernosti obrazovaniya hinonov v gamma-obluchennoyrastitelnoytkani [Quantitative laws of quinine formation in gamma-irradiated plant tissue] /S.K.Melnikova //DANN SSSR. - 1965. -Vol. 164. Issue 6. - P. 1409-1412.
7. Boyden, S. The adsorption of proteins on erythrocytes treated with tannic acid and subsequent hemagglutination by antiprotein sera / St.Boyden // J. Exp. Med. - 1961. - V. 93. - P. 107-109.
8. Clark, R. Enzime-linked immunoagar - Bent assay (ELISA) / R.Clark, E.Eugwall // Enzym - Immunoassay / E.T.Maggio ed. - Florida: Boca Raton, 1981. - P. 167-179.
9. Coons, A.H. The diagnose application of fluorescent antibodies / A.H.Coons // Z.Pathel. Ract. - 1959. -№ 22. - P. 700-723.
использование радиационных технологий для удлинения сроков хранения продуктов и кормов
Я.М.Курбангалеев - кандидат биологических наук, ст.научный сотрудник; Р.Н.Низамов - доктор ветеринарных наук, профессор, гл.научный сотрудник; Г.В.Конюхов - доктор биологических наук, профессор, зав.отделом; Н.Б.Тарасова - доктор биологических наук, зав.лабораторией;
Р.Р.Гайзатуллин -доктор биологических наук; Р.М.Асланов - доктор биологических наук, профессор.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420075, г.Казань, Научныйгородок-2, тел. +7(843)239-53-20, e-mail: vnivi@mail.ru).
Лучевая обработка пищевых продуктов и кормов требует, наряду с оптимальной их сохранностью, обеспечения безопасности облученных продуктов. Определение количества токсических соединений в облученных продуктах растительного и животного происхождения невозможно без использования высокочувствительных и специфичных методов, позволяющих определять незначительные количества радиотоксинов (РТ) в указанных объектах. Целью работы явилась разработка и апробация метода контроля качества пищевых продуктов, подвергнутых гамма-облучению, по содержанию в нихрадиоиндуцированных токсических соединений. Материалы и методы. Содержание хиноидныхрадиотоксинов (ХРТ) в продукции животного и растительного происхождения, подвергнутой лучевой обработке в различных дозах, определяли в РНГА с использованием антительного эритро-цитарного диагностикума, приготовленного на основе иммуноглобулина, полученного путем гипериммунизации овец хиноидным радиотоксином растительного происхождения. ХРТ получали по методике С.К.Мельниковой и В.А.Копылова (1966). Облучение растительного сырья проводили на гамма-установке «Исследователь» в дозе 400 Гр. Результаты исследований. Установлено, что титры радиотоксинов в облученных продуктах зависят от дозы облучения и сроков хранения продуктов после радиационного воздействия. При дозах, применяемых по технологии для удлинения сроков хранения картофеля (50-150 Гр), титры колеблются в пределах 1:8-1:74,7, лука (50-100 Гр) - от 1:10,7 до 1:85,3 в течение 3-30 сут после облучения. С повышением дозы до 800 Гр титры ХРТ в картофеле и луке в первые 15 сут после облучения повышались на 1-2 log2. В зерне пшеницы и овса, облученных в дозах 300-700 Гр, этот показатель составляет 1:6,7-1:37,3 при 1:0,7-1:2 в контрольной продукции. Титры радиотоксинов в мясе (баранина и говядина), облученном в дозах 1-104 и 1,6-10 Гр, составляли 1:6,7-1:26,7 в течение 3-30 сут после облучения с максимумом на 7-14 сутки. В печени уровни ХРТ были выше, чем в мясе, на 1-2 log2. Повышенный уровень ХРТ в указанных облученных продуктах регистрировался в течение первых 45 сут после облучения. На 60 сут титры радиотоксинов были на уровне контроля и не превышали 1:0,7-1:3,3. Заключение. Разработанный метод выявления хиноидных радиотоксинов в РНГА-тесте позволяет определять содержание хиноидных радиотоксинов в продукции животного и растительного происхождения: титры радиотоксинов 1:8 (3 log2) и выше при отрицательных контролях свидетельствуют о факте проведения лучевой обработки продукции в течение 1-45 сут до взятия проб, а 3-5-кратное превышение диагностического титра радиотоксинов (1:32-1:64 или 5-6 log2) указывает на то, что после радиационной обработки продукта в дозах, применяемых для удлинения сроков хранения, прошло от 3 до 30 суток.
клюЧЕВЫЕ слоВА: радиотоксины, методы обнаружения, контроль безопасности облученных продуктов.
УДК 619:616-001.28/.29:614.31: 637.071: 636.085.3
