CC BY
55
Молекулярная структура бокового амиотрофического склероза
в российской популяции
Н.Ю. Абрамычева, Е.В. Лысогорская, Ю.С. Шпилюкова, А.С. Ветчинова, М.Н. Захарова, С.Н. Иллариошкин
ФГБНУ«Научный центр неврологии»; Россия, 125367Москва, Волоколамское шоссе, 80
Контакты: Сергей Николаевич Иллариошкин snillario@gmail.com
Материалы и методы. Были обследованы 285российских пациентов с боковым амиотрофическим склерозом (БАС), включая 260 пациентов со спорадической и 25 с семейной формой, на предмет носительства мутаций в генах SOD1, C9orf72, TARDBP, ANG и др., а также на наличие ассоциаций с полиморфными сайтами в генах ATXN2 (полиCAG) и VEGF(-2578С/А). Молекулярно-генетический анализ выполняли с использованием методов прямого секвенирования, фрагментного анализа и поли-меразной цепной реакции в режиме реального времени. На последнем этапе оценивали редкие кандидатные гены БАС с использованием секвенирующей панели нового поколения (nextgeneration sequencing, NGS).
Результаты. Суммарная частота выявленных мутаций в обследованной когорте пациентов с БАС составила 9,5 %. Наиболее частыми оказались повреждения в генах SOD1 (24,0 % при семейной форме БАС и 4,6 % при спорадической) и C9orf72 (патологическая экспансия гексануклеотидных повторов в нем обнаружена в 1,8 % случаев БАС, все случаи спорадические). Мутаций в гене TARDBP не обнаружено, однако в группе БАС значимо чаще по сравнению с контролем встречалась делеция c.715-126delG, локализованная в интроне 5 гена TARDBP, — 38,0 % против 26,6 % (х2 = 13,17; р = 0,002). Мутации в гене ANG выявлены у 1,05 % обследованных больных БАС (все случаи спорадические). В 1 (0,35 %) спорадическом случае выявлена мутация G1082A в гене DCTN1. В обследованной группе значимо чаще по сравнению с контролем встречается носительство рискового аллеля гена ATXN2 с «промежуточным» (28—33) числом копий CAG-повторов — 5,0 % против 1,7 % (х2 = 3,89; р = 0,0486). У российских пациентов с БАС выявлена ассоциация болезни с носительст-вомрискового А-аллеля и гомозиготного генотипа А/А по полиморфизму -2578С/А в гене VEGF (соответственно х2 = 7,14;р = 0,008 их2 = 13,46;р = 0,001 при сравнении частот у больных БАС и в контроле), что подтверждается анализом отношения шансов. Заключение. В работе раскрыта молекулярная структура БАС в российской популяции, установлены частота отдельных генетических форм и спектр мутаций, что имеет большое значение для медико-генетического консультирования и профилактики заболевания в отягощенных семьях.
Ключевые слова: боковой амиотрофический склероз, генетика, мутационный скрининг, молекулярная структура, российская популяция
DOI: 10.17 650/2222-8721-2016-6-4-21-27
Molecular structure of amyotrophic lateral sclerosis in Russian population
N.Yu. Abramycheva, E.V. Lysogorskaya, Yu.S. Shpilyukova, A.S. Vetchinova, M.N. Zakharova, S.N. Ularioshkin
Research Center of Neurology; 80 Volokolamskoe Shosse, Moscow 125367, Russia
Materials and methods. 285 Russian patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) including 260patients with a sporadic form and 25 with a familial form were examined for mutations in SOD1, C9orf72, TARDBP, ANG and other genes and the presence of associations among polymorphic sites in ATXN2 (polyCAG) and VEGF (-2578С/А) genes.
Molecular genetic analysis was performed using direct sequencing, fragment analysis and real-time polymerase chain reaction. On the last stage, rare ALS candidate genes were evaluated using a next generation sequencing (NGS) panel.
Results. Total rate of the identified mutations in the examined ALS cohort was 9.5 %. The mostfrequently observed defects were mutations in the SOD1 (24.0 % in familial ALS and 4.6 % in sporadic ALS) and C9orf72 (pathological hexanucleotide repeat expansion was identified in 1.8 % cases of ALS, all sporadic) genes. The TARDBP gene didn't contain any mutations, though in the ALS group deletion c. 715-126delG located in intron 5 of the TARDBP gene was significantly over-represented — 38.0 % vs. 26.6 % (х2 = 13.17; р = 0.002). Mutations in the ANG gene were identified in 1.05% of ALS patients (all cases were sporadic). In 1 (0.35%) sporadic case a G1082A mutation in the DCTN1 gene was identified. The examined group significantly more frequently carried a risk allele of the ATXN2 gene with an "intermediate" (28—33) number of CAG repeats — 5.0 % vs. 1.7% in the control group (х2 = 3.89; р = 0.0486). In Russian ALS patients, an association between the disease and the presence of a riskА-allele andhomozygotegenotype А/А of -2578С/Аpolymorphism in the VEGF gene was identified (х2 = 7.14;р = 0.008andх2 = 13.46; р = 0.001 for the rates in the ALS population and in the control population, respectively), which is confirmed by the odds ratio. Conclusion. In the current article, molecular structure of ALS in the Russian population was examined, rates of individual geneticforms and mutation spectrum were established. This work is of considerable significancefor medical genetic counseling and prevention of the disease in the affectedfamilies.
Key words: amyotrophic lateral sclerosis, genetics, mutation screening, molecular structure, Russian population
сэ >
VD
S о
Введение
Боковой амиотрофический склероз (БАС) — тяжелое, некурабельное нейродегенеративное заболевание, характеризующееся поражением верхнего и нижнего мотонейронов и смертельными исходами больных, как правило, от нарастающих дыхательных нарушений. Выделяют более 25 генетических локусов, ассоциированных с семейными и спорадическими формами заболевания [1]. Выяв-ляемость мутаций в тех или иных генах у пациентов с БАС варьирует в зависимости от исследуемой популяции [2], при этом идентифицировать генетический дефект удается в 68 % семейных случаев заболевания и лишь у 11 % больных со спорадической формой БАС [3].
Наиболее часто развитие заболевания связано с мутациями в генах SOD1, TARDBP и C9orf72 [1]. Первым при БАС был открыт ген, кодирующий Cu/Zn-супер-оксиддисмутазу (SOD1); проведенные исследования показали, что мутации в нем возникают в 15—20 % случаев при семейной форме БАС и значительно реже — при спорадической [4, 5]. Ген TARDBP, кодирующий белок TDP-43, вовлекается в 0,7—8,0 % случаев семейного БАС [6, 7]. Экспансия гексануклеотидных повторов GGGGCC в интроне 1 гена C9otf72 считается самым частым повреждением в европейской и североамериканской популяциях: она выявляется при семейной форме БАС в среднем в 40 % случаев, при спорадической — в 7—11 % случаев [8—10]. Вовлечение других генов является значительно более редким.
Цель исследования. Проведение детального мутационного скрининга кандидатных генов с оценкой частоты встречаемости отдельных молекулярных форм и установлением ведущих генетических факторов риска развития БАС у пациентов в российской популяции.
Материалы и методы
Были обследованы 285 пациентов с достоверным или вероятным диагнозом БАС по критериям El Escorial [11]. Все пациенты принадлежали преимущественно славянской этнической группе и проживали на европейской территории России. Группа обследованных лиц включала 260 пациентов со спорадической формой заболевания и 25 неродственных пациентов с положительным семейным анамнезом по БАС (8,8 % семейных случаев). Заболевание было распространено во всех возрастных подгруппах и манифестировало чаще на 5-7-м десятилетии жизни. Тяжесть неврологических проявлений БАС определяли с помощью шкалы ALS FRS-R (revised ALS functional rating scale).
Молекулярно-генетический анализ включал секве-нирование кодирующей области гена SOD1, 6-го (наиболее мутирующего) экзона гена TARDBP, единственного экзона гена ANG, исследование частоты тандемных тринуклеотидных (CAG^-повторов в гене ATXN2 и гек-сануклеотидных повторов (GGGGCC)n в гене C9orf72, а также типирование однонуклеотидного полиморфизма -2578С/А (rs699 947) в гене VEGF.
Прямое секвенирование экзонов изучаемых генов проводили на капиллярном генетическом анализаторе ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США) с помощью программного обеспечения Data Collection Software версии 3.0, Sequencing Analysis Software версии 5.2 и SeqScape Software версии 2.5.
Количество тандемных CAG-повторов в гене ATXN2 оценивали методом фрагментного анализа на генетическом анализаторе ABI Prism 3130 с помощью программного обеспечения Data Collection Software версии 3.0. Полученные результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения GeneMapper v. 4.0 (Applied Biosystems, США).
Контрольная группа для сопоставления аллельных частот включала 357 клинически здоровых лиц.
Скрининг GGGGCC-повторов в гене C9orf72 проводили в 2 этапа. На 1-м этапе на генетическом анализаторе ABI Prism 3130 с помощью программы GeneMapper v. 4.0 (Applied Biosystems, США) анализировали длины ампли-конов, содержащих гексануклеотидную область. На 2-м этапе для всех образцов ДНК, идентифицированных как гомозиготные, точный анализ ампликона с большим количеством повторов проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции с дополнительным обратным праймером на область повторов [12, 13].
Типирование полиморфизма -2578С/А в гене VEGF выполняли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. В качестве контроля использовали 149 образцов ДНК лиц славянской этнической группы, сопоставимой с группой БАС по половому и возрастному составу.
Генетический анализ с применением секвенирования нового поколения (next generation sequencing, NGS) проводили с помощью оригинальной мультигенной панели, созданной совместно с ЗАО «Синтол» (Россия) [14].
Статистическую обработку результатов выполняли с использованием пакета компьютерных прикладных программ Statistica 8.0. При этом применяли методы описательной статистики, непараметрические методы: анализ 2 групп по количественному признаку с использованием U-критерия Манна—Уитни, анализ таблиц сопряженности, сопоставление наблюдаемой и ожидаемой частот, анализ отношения шансов (ОШ) с применением логистической регрессии. Для проведения ROC-анализа (receiver operating charasteristic) использовали онлайн-калькулятор Simple ROC Curve Analysis (http://www.vassarstats.net/roc1. html). При оценке малых выборок вносили поправку Йейтса. Данные были представлены в виде медианы, 25 и 75 % квартилей (Ме (25 %; 75 %)). Результаты считали статистически достоверными прир < 0,05.
Результаты
Ген SOD1. При секвенировании SOD1 в обследованной группе из 285 лиц выявлено 12 гетерозиготных мутаций у 21 неродственного пациента с БАС, в том числе 9 мутаций у 17 человек в кодирующей области гена и 3 мутации у 4 пациентов в некодирующих областях
Таблица 1. Выявленные кодирующие мутации в гене SOD1 Table 1. Identified coding mutations in the SOD1 gene
№ пациента Мутация Область гена Возраст/пол Форма заболевания
Mutation Gene region Disease form
187 Gly16Ala Экзон 1 Exon 1 31/женский 31 /female Шейно-грудная, спорадическая Cervical thoracic, sporadic
246 Gly16Ala Экзон 1 Exon 1 32/женский 32/female Шейно-грудная, семейная Cervical thoracic, familial
15 His48Arg Экзон 2 Exon 2 50/мужской 50/male Шейно-грудная, спорадическая Cervical thoracic, sporadic
120 Leu84Val Экзон 4 Exon 4 39/мужской 39/male Бульбарная, семейная Bulbar, familial
145 Leu84Val Экзон 4 Exon 4 29/мужской 29/male Шейно-грудная, семейная Cervical thoracic, familial
247 Leu84Val Экзон 4 Exon 4 37/мужской 37/male Шейно-грудная, семейная Cervical thoracic, familial
155 Asn86Ser Экзон 4 Exon 4 54/женский 54/female Шейно-грудная, спорадическая Cervical thoracic, sporadic
224 Asn86Ser Экзон 4 Exon 4 50/женский 50/female Пояснично-крестцовая, семейная Lumbosacral, familial
206 Asp90Ala Экзон 4 Exon 4 62/женский 62/female Пояснично-крестцовая, спорадическая Lumbosacral, sporadic
346 Asp90Ala Экзон 4 Exon 4 61/женский 61 /female Шейно-грудная, спорадическая Cervical thoracic, sporadic
116 Ser105Leu Экзон 4 Exon 4 46/мужской 46/male Пояснично-крестцовая, семейная Lumbosacral, familial
255 Ser108fr Экзон 4 Exon 4 59/мужской 59/male Шейно-грудная, спорадическая Cervical thoracic, sporadic
176 Glu133Gly Экзон 5 Exon 5 34/женский 34/female Шейно-грудная, спорадическая Cervical thoracic, sporadic
17 Leu144Phe Экзон 5 Exon 5 44/женский 44/female Пояснично-крестцовая, спорадическая Lumbosacral, sporadic
62 c.-46C>T Область промотора Promotor region 42/мужской 42/male Пояснично-крестцовая, спорадическая Lumbosacral, sporadic
130 c.169+50delAACAGTA Интрон 2 Intron 2 63/женский 63/female Бульбарная, спорадическая Bulbar, sporadic
163 c.169+50delAACAGTA Интрон 2 Intron 2 65/женский 65/female Шейно-грудная, спорадическая Cervical thoracic, sporadic
191 c.*249T>C 5'-область 5'-region 46/женский 46/female Шейно-грудная, спорадическая Cervical thoracic, sporadic
\Q
О >
VO
S о
SOD1 (табл. 1, рис. 1). Таким образом, суммарная частота мутаций в гене SOD1 составила 7,4 %, в том числе в семейных случаях БАС — 36 % (9 семей из 25 человек), в спорадических случаях — 4,6 %.
Из 9 выявленных кодирующих мутаций 8 (01у16Л1а, Ы1848Л^, Ьеи84Уа1, Лзи868ег, ЛБр90Л1а, 8ег105Ьеи, 01и13301у и Ьеи144РИе) встречаются в других популяциях мира и описаны в базе данных http://a1sod.iop.kc1.ac.uk/. Кодирующая мутация 8ег1081т (делеция 2 нуклеотидов
КС_000021.9: g.31667340de1ТС со сдвигом рамки) является новой. В числе некодирующих мутаций были выявлены: делеция 7 пар нуклеотидов c.169+50de1AACAGTA в интроне 2, замена с.-46С>Т в промоторной области гена и замена с.*249Т>С (ге16 988 412) в интроне 5 в области сплайсинга. Делеция c.169+50de1AACAGTA была обнаружена в 2 неродственных случаях спорадического БАС. У обеих пациенток-носительниц заболевание дебютировало в возрасте после 60 лет, однако феноти-
О >
VD
S о
c.50G>C Gly16Ala
c.260A>G c.272A>C Asn86Sef Asp90Ala
c.317G>A c.401A>G Ser105Leu Glu133Gly
c.435G>C NC_000021.9:g.31667340delTC Leu144Phe Ser108fr
I этап / Stage I II этап / Stage II
Анализ длины фрагментов / Полимеразная цепная реакция Fragment length analysis с дополнительным праймером на область повторов / Polymerase chain reaction with an additional 100 200 300 400 primer for the repeat region 2/7
100 200 300 400
2/16
2/>60
Рис. 1. Обнаруженные кодирующие мутации в гене SOD1 Fig. 1. Identified coding mutations in the SOD1 gene
пические проявления БАС были различными: в одном случае — медленно прогрессирующая шейно-грудная форма, в другом — быстро прогрессирующая бульбар-ная форма. При исследовании 100 контрольных образцов ДНК (здоровые лица) ни одного случая носитель-ства данной делеции не выявлено.
Ген C9orf72. У 5 пациентов (2 мужчин и 3 женщины) со спорадической формой БАС выявлена гетерозиготная мутация по типу гексануклеотидной GGGGCC-экспансии в интроне 1 гена C9orf72 (рис. 2). Во всех случаях число повторов превышало патологический порог в 50 копий (по 1 больному — 54 и 55 повторов и 3 пациента с 61 повтором). Возраст дебюта болезни варьировал от 38 до 65 лет и не имел четкой связи с числом копий GGGGCC-повторов; у 1 пациента была пояснично-крестцовая форма БАС, у 1 — шейная и у 2 — бульбарная. Все больные с данным типом мутации имели быстрое прогрессирование заболевания с генерализацией процесса уже к концу 1-го года. Таким образом, общая частота мутаций в гене C9orf72 составила 1,8 %.
В контрольных образцах (203 здоровых добровольца) экспансии GGGGCC-повторов в данном гене не обнаружено.
Ген TARDBP. В работе был исследован экзон 6 гена TARDBP, в котором расположено подавляющее число описанных при БАС мутаций. У российских пациентов с БАС (n = 208) при прямом секвенирова-нии экзона 6 гена TARDBP кодирующих мутаций не выявлено. У 1 пациента была обнаружена замена c.*44A>G (*NT_021 937.19) и у 79 (38 %) больных -делеция c.715-126delG (rs3 835 416), в том числе у 72 пациентов в гетерозиготном и у 7 - в гомозиготном состоянии. Указанная замена c.*44A>G не выявлена в контроле (203 образца ДНК); частота носительства делеции c.715-126delG в контроле составила 26,6 %
Рис. 2. Двухэтапное определение GGGGCC-экспансии в гене C9orf72: а — норма (на Iэтапе видны 2 пика от аллелей с числом копий тандем-ных повторов 2 и 7); б — норма (на I этапе видны 2 пика от аллелей с числом копий тандемных повторов 2 и 16, на IIэтапе — «малая» решетка с ограниченным числом амплифицируемых пиков); в — экспансия повторов (на I этапе виден только пик от аллеля с числом копий повторов 2, на II этапе — «протяженная» решетка с большим числом амплифицируемых пиков, соответствующих экспансии GGGGCC-по-второв > 60 копий)
Fig. 2. Two-stage identification of GGGGCC expansion in the C9orf72gene: a — norm (2 peaks from the alleles with 2 and 7 tandem repeats are evident in stage I); б — norm (2 peaks from the alleles with 2 and 16 tandem repeats are evident in stage I, a "small" array with a limited number of amplification peaks in stage II); в — repeat expansion (a single peak from the allele with 2 repeat copies is evident in stage I, an "extended" array with a large number of amplification peaks corresponding to GGGGCC repeat expansion > 60 copies is evident in stage II)
(49 человек — гетерозиготы, 5 — гомозиготы). При исследовании распределения аллелей и генотипов по локусу rs3835416 путем сравнения наблюдаемой и ожидаемой частот наблюдалось статистически значимое увеличение частоты встречаемости данной делеции в группе пациентов с БАС (х2 = 13,17; р = 0,002) (табл. 2).
При анализе ОШ было установлено, что в группе больных с БАС шанс носительства описанной делеции в 1,7 раза выше, чем у носителей других аллелей (доверительный интервал (ДИ) 1,11—2,57; р = 0,013). Анализ частоты встречаемости данной делеции в других популяционных когортах пациентов с БАС ранее не проводился.
Ген ANG. При исследовании единственного кодирующего экзона гена ANG были выявлены 2 гетерозиготные мутации у 3 неродственных пациентов, страдающих спорадической формой БАС (рис. 3). У 2 неродственных пациентов была обнаружена замена в области сигнальной последовательности Pro21Ser, у 1 больной — мутация Ile46Val. Таким образом, частота мутаций при спорадическом БАС в обследованной группе составила 1,05 %. Среди пациентов, страдающих семейной формой заболевания, носительства мутаций в гене ANG не выявлено.
и
б
в
Таблица 2. Частота встречаемости генотипов в локусе rs3835416гена TARDBP Table 2. Genotype incidence rate in locus rs3835416of the TARDBP gene
Показатель Число пациентов с БАС,n (%) Число лиц в группе контроля, n (%) X2 P
Parameter Number of ALS patients, Number of patients
n (%) in the control group, n (%)
Аллели Alleles G delG 331 (80,0) 85 (20,0) 347 (85,5) 59 (14,5) 13,17 0,002
Генотипы
Genotypes
G/delG 71 (34,0) 49 (24,0)
delG/delG 7(3,4) 5 (2,5) 14,24 0,008
GG 130 (62,6) 149 (73,5)
\Q
О >
VO
S о
Примечание. Здесь и в табл. 3: БАС — боковой амиотрофический склероз. Note. Here and in table 3: ALS — amyotrophic lateral sclerosis.
c.61C>T c.208A>G
Pro21Ser Ile46Val
Рис. 3. Кодирующие мутации в гене ANG Fig. 3. Coding mutations in the ANG gene
Рис. 4. Мутация G1082A в гене DCTN1 (стрелкой указана область мутации): а — мутантный сиквенс; б — контроль (нормальный сиквенс) Fig. 4. Mutation G1082A in the DCTN1 gene (arrow shows the mutation region): a — mutant sequence; б — control (normal sequence)
Ген ATXN2. Экзон 1 гена ATXN2 несет участок CAG-повторов, определяющий полиглутаминовую последовательность его продукта — белка атаксина 2. Значительная степень CAG-экспансии (> 33 копий) в данном гене обусловливает развитие спиноцеребел-лярной атаксии 2-го типа. Изменение копийности CAG при БАС соответствует экспансии промежуточного числа повторов («предэкспансии») — в диапазоне от 24 до 33. Для оценки порогового значения числа CAG-повторов, ассоциированного с развитием забо-
левания у российских пациентов, нами был выполнен ЯОС-анализ. Результаты показали, что для развития заболевания значимым является носительство 28 и более CAG-повторов в гене ЛТХЫ2. В обследованной группе больных (п = 208) было выявлено 10 (5,0 %) случаев «предэкспансии» у пациентов со спорадической формой БАС. В контрольной группе (п = 357) обнаружено 6 (1,7 %) случаев «предэкспансии» в гене ЛТХЫ2. Частота встречаемости данной мутации гена ЛТХК2 среди больных была статистически значимо выше (х2 = 3,89; р = 0,0486). При анализе ОШ установлено, что шанс развития заболевания у носителей «предэкспансии» CAG составляет 3,36 (ДИ 1,1—10,4; X2 = 4,98; р = 0,026).
Ген 1)СТЫ1. У 1 пациента со спорадической формой БАС при панельном NGS-анализе была выявлена мутация G1082A в гене DCTN1. Данная замена была подтверждена стандартным прямым секвенированием (рис. 4).
Ген УБОГ. Анализ ассоциации БАС с полиморфизмом -2578С/А гена УЕОЕ проведен у 192 пациентов; группу сравнения составили 149 клинически здоровых лиц. При оценке распределения аллелей и генотипов по данному локусу в 2 группах были получены статистически значимые различия как для рискового алле-ля А (х2 = 7,14; р = 0,008), так и для рискового гомозиготного генотипа А/А (х2 = 13,46; р = 0,001).
При анализе ОШ было установлено, что у носителей рискового генотипа А/А шанс развития заболевания в 1,7 раза выше, чем у носителей других аллелей (ДИ 1,05-2,93; х2 = 4,85; р = 0,027). При этом в подгруппе мужчин у носителей генотипа А/А наблюдалось увеличение шанса развития заболевания до 2,1 раза (ДИ 1,06-4,17; х2 = 4,7; р = 0,03).
Обсуждение
В настоящей работе нами впервые представлены результаты комплексного молекулярно-генетическо-
сэ >
VD
S о
Таблица 3. Частота встречаемости аллелей и генотипов в локусе rs69994 гена VEGF
Table 3. Allele and genotype incidence rates in locus rs69994 of the VEGF gene
Показатель Число пациентов с БАС, n (%) ^ИОТТТмтЯЯ Число лиц в группе контроля, n (%) X2 Р
Parameter ofALS patients, n (%) of patients in the control group, n (%)
Аллели Alleles А С 196 (51,0) 188 (49,0) 132 (44,3) 166 (55,7) 7,14 0,008
Генотипы Genotypes СА АА СС 82 (42,7) 57 (29,7) 53 (27,6) 74 (49,7) 29 (19,4) 46 (30,9) 13,46 0,001
го анализа невыборочной российской когорты пациентов с БАС. Внимание было сфокусировано на 3 генах (80Б1, С9ог[72 и ТЛКОБР), признаваемых наиболее значимыми в патогенезе БАС для большинства популяций мира [1]. Был проанализирован вклад ЛТХК2 в развитие БАС в российской популяции, поскольку данный ген, наряду с ТЛРВБР и С9ог[72, вовлечен в ключевое звено молекулярного патогенеза БАС — нарушение метаболизма РНК [14, 15]. Гены ЛМО и УЕОР, кодирующие гипоксия-индуцибельные ангиогенные факторы, привлекают внимание исследователей при разработке подходов к терапии БАС, поскольку эти пептиды являются критическими факторами выживаемости мотонейронов в условиях гипоксии [16, 17].
В данном исследовании суммарная частота обнаруженных в различных генах мутаций у пациентов с БАС составила 9,5 %. При этом мутации были выявлены в 24,0 % случаев семейной формы заболевания (во всех случаях — ген 80Б1) и в 8,1 % случаев спорадического БАС. Мы наблюдали клиническую и моле-кулярно-генетическую гетерогенность заболевания как при семейной, так и при спорадической его форме,
поскольку у носителей мутации отмечены все известные фенотипы БАС.
Частота семейной формы заболевания в нашей когорте пациентов составила 8,8 %, что несколько ниже, чем описано в других европейских популяциях [5, 18]. У всех носителей мутаций, имеющих семей -ный анамнез заболевания, был обнаружен дефект гена SOD1. Мы выявили 9 кодирующих и 3 некодиру-ющие мутации в данном гене. Общая частота мутаций SOD1 составила 4,6 % для спорадического БАС и возрастала до 6,3 % во всей обследованной когорте пациентов.
В проведенном исследовании было показано, что C9orf72 является 2-м после SOD1 по частоте повреждения геном в российской выборке больных с БАС. Частота повреждения в нем составила 1,8 %. Также в данном исследовании в 1,05 % случаев были обнаружены мутации в гене ANG и в 0,35 % — в гене DCTN1. Выявленные нами частоты мутаций для вышеназванных генов сопоставимы с таковыми для других европейских популяций [19, 20].
В выполненной работе не обнаружены мутации в гене TARDBP. Однако выявленные ассоциации развития заболевания с носительством делеции c.715-126delG могут свидетельствовать о вовлечении данного гена в патогенез БАС. В нашей когорте пациентов также наблюдалась ассоциация заболевания с полиморфизмом в гене VEGF и носительством промежуточного числа повторов в гене АTXN2.
Заключение
Таким образом, в настоящей работе раскрыта молекулярная структура БАС в российской популяции, установлены частота отдельных генетических форм и спектр мутаций, что имеет большое значение для медико-генетического консультирования и профилактики заболевания в отягощенных семьях. Планируемые в дальнейшем молекулярно-генетические исследования российской когорты пациентов с БАС будут включать мутационный скрининг дополнительных генов FUS, а также применение стремительно развивающейся технологии полноэкзомного секвенирования, что позволит найти новые мишени для развития терапевтических стратегий БАС.
Конфликт интересов
Авторы статьи заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование исследования
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 16-04-01662).
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
О >
VO
1. Ingre C., Roos P.M., Piehl F. Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis. Clin Epidemiol 2015;12(7):181-93.
DOI: 10.2147/CLEP.S37505. PMID: 25709501.
2. Kenna K.P., McLaughlin R.L., Byrne S. et al. Delineating the genetic heterogeneity of ALS using targeted high-throughput sequencing. J Med Genet 2013;50(11): 776-83.
DOI: 10.1136/jmedgenet-2013-101795. PMID: 23881933.
3. Renton A., Chiô A., Traynor B. State of play in amyotrophic lateral sclerosis genetics. Nat Neurosci 2014;17(1):17-23. D0I:10.1038/nn.3584. PMID: 24369373.
4. Rosen D.R., Siddique T., Patterson D. et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature 1993;362(6415):59-62.
DOI: 10.1038/362059a0. PMID: 8446170.
5. Kaur S.J., McKeown S.R., Rashid S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Gene 2016;577(2):109-18.
DOI: 10.1016/j.gene.2015.11.049. PMID: 26657039.
6. Corrado L., Ratti A., Gellera C. et al. High frequency of TARDBP gene mutations in Italian patients with amyotrophic lateral sclerosis. Hum Mutat 2009;30(4):688-94. DOI: 10.1002/humu.20950.
PMID: 19224587.
7. Daoud H., Valdmanis P.N., Kabashi E. et al. Contribution of TARDBP mutations to sporadic amyotrophic lateral sclerosis.
J Med Genet 2009;46(2):11-4. DOI: 10.1136/jmg.2008.062463. PMID: 18931000.
8. Liu Y., Yu J.-T., Zong Y. et al. C9orf72 mutations in neurodegenerative diseases. Mol Neurobiol 2014;49(1):386-98. DOI: 10.1007/s12035-013-8528-1. PMID: 23934648.
9. Gijselinck I., van Langenhove T., van der Zee J. et al. A C9orf72 promoter repeat expansion in a Flanders-Belgian
cohort with disorders of the frontotemporal lobar degeneration-amyotrophic lateral sclerosis spectrum: a gene identification study. Lancet Neurol 2012;11(1):54-65. DOI: 10.1016/S1474-4422(11)70261-7. PMID: 22154785.
10. Majounie E., Renton A.E., Mok K. et al. Frequency of the C9orf72 hexanucleotide repeat expansion in patients with amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia: a cross-sectional study. Lancet Neurol 2012;11(4):323-30. DOI: 10.1016/S1474-4422(12)70043-1. PMID: 22406228.
11. Brooks B.R., Miller R.G., Swash M. El Escorial revisited: revised criteria
for the diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis. Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord 2000;1(5):293-9. PMID: 11464847.
12. Warner J.P., Barron L.H., Goudie D. et al. A general method for the detection of large CAG repeat expansions
by fluorescent PCR. J Med Genet
1996;33(12):1022-6.
PMID: 9004136.
13. DeJesus-Hernandez M., Mackenzie I.R., Boeve B.F. et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron 2011;72(2):245-56. DOI: 10.1016/j.neuron.2011.09.011. PMID: 21944778.
14. Абрамычева Н.Ю., Федотова Е.Ю., Устинова В.В., Алексеев Я.И. Секвениро-вание нового поколения в диагностике заболеваний, сопровождающихся расстройствами движений. Бюллетень Национального общества по изучению болезни Паркинсона и расстройств движений 2016;(2):16-23. [Abramycheva N.Yu., Fedotova E.Yu., Ustinova V.V., Alekseev Ya.I. Next generation sequencing in diagnostics of diseases accompanied by movement disorders. Bulleten' Natsional'nogo obschestva po izucheniyu bolezni Parkinsona i rasstroystv dvizheniy = Bulletin of the Russian National Society
of Parkinson's Disease and Movement Disorders 2016;(2):16-23. (In Russ.)].
15. Caballero-Hernandez D., Toscano M.G., Cejudo-Guillen M. et al. The 'Omics'
of amyotrophic lateral sclerosis. Trends Mol Med 2016;22(1):53-67. DOI 10.1016/j.molmed.2015.11.001. PMID: 26691296.
16. Benatar M., Boylan K., Jeromin A. et al. ALS biomarkers for therapy development: State of the field and future directions. Muscle Nerve 2016;53(2):169-82.
DOI: 10.1002/mus.24979. PMID: 26574709.
17. Vijayalakshmi K., Ostwal P., Sumitha R. et al. Role of VEGF and VEGFR2 receptor in reversal of ALS-CSF induced degeneration of NSC-34 motor neuron cell line. Mol Neurobiol 2015;51(3):995-1007.
DOI: 10.1007/s12035-014-8757-y. PMID: 24880751.
18. Исмаилов Ш.М., Барыкова Ю.А., Шмаров М.М. и др. Экспериментальный подход к генной терапии болезни двигательного нейрона на основе использования генов гипоксия-индуцибельных факторов. Генетика 2014;(5):591—601. [Ismailov S.M., Barykova Yu.A., Shmarov M.M. et al. Experimental approach to gene therapy of motor neuron disease based on hypoxia-inducible factors genes. Genetika = Genetics 2014;(5):591-601.
(In Russ.)].
19. Chio A., Calvo A., Mazzini L. et al. Extensive genetics of ALS: a population-based study in Italy. Neurology 2012;79(19):1983-9. DOI: 10.1212/WNL.0b013e3182735d36. PMID: 23100398.
20. Greenway M.J., Andersen P.M., Russ C. et al. ANG mutations segregate with familial and 'sporadic' amyotrophic lateral sclerosis. Nat Genet 2006;38(4):411-3.
DOI: 10.1038/ng1742. PMID: 16501576.
21. Pfister T., Sekhon R., White M. et al. Familial amyotrophic lateral sclerosis
in Alberta, Canada. Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener 2013;14(4):273—7. DOI: 10.3109/21678421.2012.754044. PMID: 23286750.
