CC BY
37
УДК 577.2:575.8
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭВОЛЮЦИЯ СТРУКТУРЫ ГЕНА, КОНТРОЛИРУЮЩЕГО СИНТЕЗ УРАТОКСИДАЗЫ
© 2011 г. К.В. Азарин1, \Е П- Гуськое, А.В. Усатое1
',2
1Научно-исследовательский институт биологии Южного федерального университета, пр. Стачки, 194/1, г. Ростов н/Д, 344090, niib@sfedu.ru
2Южный федеральный университет, ул. Б. Садовая, 105/42, г. Ростов н/Д, 344006, decanat@bio. sfedu.ru
1Scientific Research Institute of Biology of Southern Federal University, Stachki Ave, 194/1, Rostov-on-Don, 344090, niib@sfedu.ru
2Southern Federal University, B. Sadovaya St., 105/42, Rostov-on-Don, 344006, decanat@bio. sfedu.ru
У человека и некоторых приматов активность уриказы заингибирована. Анализ структурной организации гена уриказы показал, что он представлен системой коротких консервативных регионов, стабильных у всех исследованных позвоночных. Генетические дистанции в группе приматов не превышают расстояние между близкими видами M. мusculus и Rattus norvegicus. Однако и в группе позвоночных ген уратоксидазы не является константным, и в ходе эволюции происходит постепенное изменение его нук-леотидного и аминокислотного состава.
Ключевые слова: уриказа, L-гулонолактоноксидаза, генетические дистанции, консервативный регион.
Urica.se activity is absent in humans and other certain primates. Analysis of structural organization of uox gene showed, that uox gene consists of a short conservative region unchanging in all investigated vertebrates. The genetic distances in primates group do not exceed the distances between close species ofM. мшеШш and Rattus norvegicus. However, uox gene is not constant and occurring the evolutionary change of the uox gene.
Keywords: uricase, L-gulonolactone oxidase, genetic distances, conservative region.
Белок-кодирующие гены характеризуются неоднородной скоростью эволюционной изменчивости. Наибольшая консервативность свойственна генам и белкам «домашнего хозяйства», т.е. молекулам, контролирующим базовые и наиболее древние жизненные функции и процессы, которые идентичны или генетически подобны у многих форм жизни. Одним из таких базовых метаболических путей является процесс катаболизма пуринов. Ключевой фермент пуринового метаболизма уриказа (иох) катализирует трансформацию мочевой кислоты в аллантоин. Доказательством древности и фундаментальной роли этого фермента является его наличие как у прокариот, так и у эукариотных организмов. Фермент ура-токсидаза у разных видов животных имеет идентичную тканевую и субклеточную локализацию, сходный молекулярный вес и вследствие этого общее эволюционное происхождение [1].
Несмотря на это, уриказная активность, характерная для метаболизма большинства позвоночных, не обнаружена у человека и некоторых приматов. Ранее было показано, что причиной инактивации гена иох у гоминид
является нонсенс-мутация во втором экзоне, и что в функциональном гене приматов наблюдается строгий отбор против несинонемичных мутаций [2]. В связи с чем особый интерес вызывает анализ молекулярной структуры и закономерностей в последовательности ДНК гена uox и мутационных преобразований гена уратоксидазы в эволюции позвоночных животных.
Материалы и методы
Материалом исследования служили нуклеотидные последовательности генов уратоксидазы и L-гулоно-лактоноксидазы, хранящиеся в базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Для множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали программу CLUSTAL W [3] пакета программ BioEdit Sequence Alignment Editor [4]. Уровень изменчивости оценивали исходя из отношения числа полиморфных позиций к размеру гена. Число различий для всех исследованных видов позвоночных измеряли относительно нуклеотидной последовательности вида Mus musculus.
Статистический расчет значимости отклонения для консервативных регионов проводили с помощью t-крите-рия по формуле для оценки разности между долями [5].
Результаты и обсуждение
В табл. 1 приведены результаты скрининга полиморфных вариантов гена уратоксидазы у различных видов относительно последовательности мыши Mus musculus. Количественное содержание различий в выровненных по Mus musculus последовательностях Нomo sapience равняется 47^49. Разброс среди приматов по количеству несинонимичных мутаций варьиру-
ется от 21 (Hylobates concolor) до 48 (Hylobates lar) (табл. 1). В ходе анализа выявлены 2 мутации, характерные только для Нomo sapience: однонуклеотидные замены 334(G-A) и 362(A-G). Наибольшее количество индивидуальных маркеров характерно для последовательности Pongo pygmaeus (7 уникальных замен) и Ao-tus trivirgatus (5 мутаций). Такое относительно большое число уникальных мутаций для орангутана, вероятно, связано с более ранней в эволюционном плане инактивацией гена уриказы после отделения от общего «ствола» приматов Старого света.
Таблица 1
Анализ молекулярной структуры генов uox различных видов позвоночных
Вид Размер нуклеотидных пар (н.п.) Количество несинонимичных мутаций Степень изменчивости Генетические дистанции Виды мутаций Количество уникальных замен
Н. sapience 915 49 Q,Q54 Q,1734 14 трансверсий, 34 транзиции 2
Н. sapience 915 47 Q,Q52 Q,17Q7 13 трансверсий, 34 транзиции Q
P. troglodytes 915 31 Q,Q34 Q,173Q 12 трансверсий, 19 транзиций 2
G. gorilla 915 39 Q,Q43 Q,17Q9 14 трансверсий, 23 транзиции Q
G. gorilla 912 42 Q,Q46 Q,1712 13 трансверсий, 28 транзиций Q
P.hamadryas 915 27 Q,Q3Q Q,1627 11 трансверсий, 16 транзиций 2
P.hamadryas 915 24 Q,Q26 Q,1611 9 трансверсий, 15 транзиций Q
P.pygmaeus 915 34 Q,Q37 Q,1727 10 трансверсий, 24 транзиции 7
M.mulatta 915 25 Q,Q27 Q,1637 9 трансверсий, 16 транзиций 1
M.fascicularis 915 24 Q,Q26 Q,1623 9 трансверсий, 15 транзиций Q
H. agilis 6QQ 3Q Q,Q5 Q,1668 5 трансверсий, 20 транзиций 2
H.lar 912 48 Q,Q53 Q,1682 10 трансверсий, 33 транзиции б
H.mueleri 6QQ 3Q Q,Q5 Q,1693 7 трансверсий, 18 транзиций 1
H.syndactylus 6QQ 33 Q,Q55 Q,1845 7 трансверсий, 22 транзиции 5
H. concolor 6QQ 21 Q,Q35 Q,1737 6 трансверсий, 13 транзиций 1
A.trivirgatus 915 35 Q,Q38 Q,1733 9 трансверсий, 25 транзиций 5
R. norvegicus 912 1б Q,Q18 Q,Q63Q 3 трансверсии, 13 транзиций -
C. familiaris 915 34 Q,Q37 Q,1646 11 трансверсий, 22 транзиции -
X. tropiclis 915 27 Q,14 Q,4747 61 трансверсия, 65 транзиций -
В свою очередь уникальные мутации Aotus trivirgatus могли возникнуть после дивергенции приматов на обезьян Старого и Нового света, тогда как общие мутации являются либо предковыми, либо возникшими независимо. В этой связи обращает на себя внимание наличие 5 однонуклеотидных замен в сайтах 452(С-А), 619(G-A), 652(С-А), 716(A-G) и 752(А-С), выявляющих общность происхождения и выделяющих в отдельную группу виды Нomo sapience, Gorilla gorilla, Pan troglodytes.
Степень изменчивости, которая является показателем генетического разнообразия, может выражать филогенетическое расстояние или степень деградации
в случае формирования псевдогена. Из табл. 1 видно, что относительно Mus musculus наибольшее отличие обнаружено в последовательностях Нomo sapience и 4 видов Hylobates. Следующими по количеству полиморфных позиций на ген являются последовательности uox Gorilla gorilla (0,046, 0,043). Остальные приматы характеризуются меньшей степенью полиморфизма, не превышающей таковую для функционально активного гена уриказы Canis familiaris. Наименьшая степень отличия наблюдается у Rattus norvegicus.
Параллельно с утратой уриказной активности в процессе эволюции возникли мутации, в результате которых высшие приматы утратили способность эндо-
генного синтеза другого витамина - аскорбата [6]. Ал-лантоин и аскорбат - это водорастворимые молекулы, активные тушители внутриклеточных свободноради-кальных процессов, обладающие значительным сходством как по квантово-химическим параметрам, так и по биологическим эффектам [7]. Поэтому инактивация генов, ответственных за синтез аллантоина и аскорба-та, резко изменила биохимический статус систем анти-оксидантной защиты высших приматов.
Проведённый сравнительный анализ гена L-гулоно-лактоноксидазы, терминального фермента, необходимого для синтеза эндогенного аскорбата, Mus musculus и Ното sapience выявил более высокое значение степени различий (0,11) по сравнению с таковой для уриказы. То есть скорость накопления мутаций для гена glo в 2 раза выше, чем для uox. Причиной этого явления может быть более ранняя в эволюционном плане инактивация гена glo (время превращения гена L-гулонолактоноксидазы в псевдоген 25 млн лет) [6]. В отношение uox это время может быть менее 10 млн лет, так как, возможно, общий предок гоминид имел функциональный ген uox.
Среди нуклеотидных замен в uox-гене приматов преобладают транзиции (табл. 1). Их преобладание над трансверсиями характеризует лишь начальную стадию дивергенции гомологичной нуклеотидной последовательности видов и должно постепенно заменяться на 2-кратное преобладание трансверсий над транзициями, которое является равновесным в соотношении типов замен [8]. Представленные здесь результаты анализа межсайтовой изменчивости гена uox приматов указывают на эволюционную «близость» по сравнению с Xenopus tropicalis, где количество трансверсий практически равно количеству транзиций (табл. 1).
Все вышеперечисленные факты свидетельствуют, что, несмотря на древность и выполнение одной функции в различных таксономических группах, ген uox не является константным, и в ходе эволюции происходит постепенное изменение его нуклеотидного и, соответственно, аминокислотного состава без потери функциональной активности фермента. Ранее на 53 неповторяемых (уникальных) ДНК-сегментах было показано, что среднее число различий составляет между человеком и шимпанзе 1,24±0,07 %, между человеком и гориллой - 1,62±0,08, между человеком и орангутаном - 3,08±0,11 % [9]. Эти данные коррелируют с полученными нами результатами для гена уриказы, где степень деградации равняется 1,2 % для человека и шимпанзе, 1,86 - человека и гориллы и 2,62 % - человека и орангутана. В противовес этому степень попарных различий для гена L-гулонолак-тоноксидазы составляет для человека - шимпанзе 2,42 %, для человека - орангутана - 5,50.
В ходе анализа были выявлены 12 консервативных регионов гена уриказы, которые практически неизменны у всех исследованных позвоночных, включая как несинонимичные, так и синонимичные мутации (табл. 2).
Данные регионы могут и входить в состав активного центра, и быть ответственными за формирование пространственной структуры. Присутствие таких консервативных участков может свидетельствовать о давлении отбора, направленного как на активный, так и на псевдоген uox.
Хотя Homo sapiens и другие высшие приматы синтезируют различные эндогенные антиоксиданты, они не полностью компенсируют отсутствие эндогенного
аскорбата и аллантоина, вследствие чего антиокси-дантная емкость клеток недостаточна для полного тушения свободнорадикальных производных и их метаболитов, инициирующих перекисное окисление липидов, вследствие чего повышается вероятность возникновения индуцируемых ими мутаций [6, 10]. С другой стороны, повышение концентрации мочевой кислоты в организме человека позволяет поддерживать повышенную концентрацию аллантоина, в который она превращается в результате свободноради-кальной атаки молекул урата. Кроме того, все еще обсуждаема гипотеза о том, что избыток мочевой кислоты определил новые пути социальной и интеллектуальной эволюции [10]. Существует предположение, что имевшее место увеличение индивидуальной продолжительности жизни в ходе эволюционного развития приматов во многом было обусловлено прогрессивным ростом уровня урата [11]. Высокая концентрация мочевой кислоты в крови приматов привела к молекулярной коэволюции. Избыток урата в пурино-вом метаболизме можно снизить за счет транскрипционной активности гена ксантин оксидоредуктазы (Хог), катализирующего превращение гипоксантина и ксантина в мочевую кислоту. Известно, что ферментная активность гена Хог человека намного ниже, чем у мыши и крысы [2].
Таблица 2
Консервативные регионы гена уриказы
Длина н.п. Сегмент
16 53GAACTGGCTATGGGAA68
17 79AAAGTTCTCCATATTCA96
11 100 GATGGAAAATA 110
14 202 ACAGACACCATCAA 215
11 415 CACTTCTGTGA 424
14 463 TCTGGAATCAAAGA 476
14 523 AAGGACCAGTTCAC 536
11 562 TGCTTTGCCAC 572
16 664 GCTGGGCCCTATGACA 679
14 763 ATGGAAATCAGCCT 776
17 802 GACATGTCCAAAATGGG 818
14 820 CTGATCAACAAGGA 833
Таким образом, в результате данного анализа выявлен ряд закономерностей в последовательности ДНК-гена uox в ходе эволюции позвоночных.
Литература
1. Varela-Echavarria A., Montes de Oca-Luna R., Barrera-Saldana H.A. Uricase protein sequences: conserved during vertebrate evolution but absent in humans // FASEB J. 1988. Vol. 15. P. 3092-3096.
2. Loss of urate oxidase activity in hominoids and its evolutionary implications / M. Oda [et al.] // Mol. Biol. and Evol. 2002. Vol. 19. P. 640-653.
3. Tompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions - specific gap penalties and weight matrix choice // Nucl. Acids Res. 1994. Vol. 22. P. 4673-4680.
4. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucl. Acids. Symp. 1999. Vol. 41. P. 95-99.
5. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1990. 350 с.
6. Challem J.J. Did the loss of endogenous ascorbate propel the evolution of Anthropoidea and Homo sapiens? // Med. Hypotheses. 1997. Vol. 5. P. 387-392.
7. Аллантоин как витамин / Е.П. Гуськов [и др.] // Докл. АН. 2004. T. 6. C. 1-6.
8. Holmquist R. Transition and trasversions in evolutionary descent: an approach to understanding // J. Mol. Evol. 1983. Vol. 19. P. 134-144.
9. Chen F.C., Li W.H. Genomic divergences between humans and other hominoids and the effective population size of the common ancestor of humans and chimpanzees // Am J. Hum Genet. 2001. Vol. 2. P. 444-56.
10. Haldane J.B.S. Origin of man // Nature. 1955. Vol. 176. P. 169-170.
11. Uric acid provides an antioxidant defense in humans against oxidant- and radical-caused aging and cancer: a hypothesis / B.N. Ames [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. Vol. 11. P. 6858-6862.
Поступила в редакцию 30 июля 2010 г.
