CC BY
32
УДК: 636.2.034:636.2.082.2
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ КАНДИДАТОВ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ НА ПРИМЕРЕР ПЛЕМЗАВОДА «РАССВЕТ» КУКМОРСКОГО РАЙОНА РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН
*Юльметьева Ю.Р. - к.б.н., зав. лабораторией; *Шакиров Ш.К.- д.с.-х.н., руководитель
отдела; Ахметов Т.М. - д.б.н., доцент *Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства, г. Казань, Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: молочная продуктивность, ПЦР-ПДРФ, каппа-казеин, пролактин, бета-лактоглобулин.
Key words: milk yield, PCR-RFLP, Kappa-casein, prolactin, beta-lactoglobulin.
Полиморфизм генов,
ассоциированных с параметрами молочной продуктивности, позволяет вести селекцию домашних животных с учетом ценных генотипов в отношении хозяйственно полезных признаков. Установленный для крупного рогатого скота (КРС) спектр генов-кандидатов на связь с признаками молочной продуктивности включает в себя гены основных белков молока (лактальбуминов и казеинов), гены гормонов, стимулирующих их экспрессию, а также гены, продукты которых регулируют обмен протеинов и липидов в организме [6]. Среди них особое место занимают гены каппа-казеина, бета-лактоглобулина и пролактина [4, 7].
Каппа-казеин обеспечивает
оптимальные технологические свойства молока при производстве сыра, поэтому его ген рассматривают в качестве одного из основных маркеров племенной ценности КРС [4]. Ген каппа-казеина (CSN3) у представителей вида Bos taurus L. находится на 6-й хромосоме. Из десяти описанных аллелей этого гена наиболее часто встречаются аллельные варианты A и B, которые отличаются двумя аминокислотными заменами в 136-м Thr(A)/Ile(B) и 148-м Asp(A)/Ala(B) положениях полипептидной цепи. Многими зарубежными [8] и отечественными [5] исследователями установлена ассоциация B-аллеля гена CSN3 с более высоким содержанием белка в молоке и выходом сыра, а также с лучшими коагуляционными свойствами молока у КРС.
Пролактин (PRL) - один из самых универсальных гормонов гипофиза с точки
зрения его биологической активности. Он участвует в дифференцировке
эпителиальных клеток молочной железы, инициации и поддержании лактации, регуляции синтеза молочных белков и жиров. Таким образом, ген пролактина является потенциальным генетическим маркером признаков молочной
продуктивности в животноводстве. У КРС ген РЯЪ расположен на 23-й хромосоме и состоит из пяти экзонов и четырёх интронов. Установлено, что синонимичная A-G замена, возникающая в кодоне для 103 аминокислоты, приводит к появлению полиморфного К^аЬсайта. Во многих исследованиях [2, 3, 7] показана связь Я^аЬ генотипов гена РЯЪ у КРС с параметрами молочной продуктивности.
Ген лактоглобулина (BLG) — располагается на 11 хромосоме коров и имеет 12 известных вариантов. Лактоглобулин является основным сывороточным белком жвачных животных. Установлена тесная взаимосвязь между технологическими свойствами и
биохимическим полиморфизмом белков молока. Целью работы послужило изучить частоту встречаемости генотипов по генам-маркерам CSN3, PRL и BLG, установить их влияние на молочную продуктивность и воспроизводительные качества коров.
Материал и методика
исследований. Для анализа состояния селекционно-генетической работы в племзаводе «Рассвет» Кукморского района Республики Татарстан генотипировано 271 коров из племенного ядра и 61 коров -первотелок холмогорской породы татарстанского типа. Материалом для
исследований являлись пробы крови животных. Выделение ДНК проводили с помощью набора «ДНК-Сорб-В» (АмплиСенс®, Россия) согласно методике, представленной изготовителем.
Полиморфизм генов выявляли методом ПЦР-ПДРФ. Для чего, фрагменты ДНК амплифицировали на программируемом термоциклере MyCycler (Bio-Rad, США). Рестрикцию проводили на
программируемом термоциклере в соответствии с рекомендациями
изготовителя. Анализ результатов
проводили методом гель-электрофореза в агарозном геле с последующей документацией результатов с помощью видеосистемы GelDoc (Bio-Rad, США). Статистическую обработку проводили по общепринятым методикам.
Результаты собственных
исследований. Для более полной картины анализа частоты встречаемости аллелей по изучаемым маркерам подгруппы коров и коров-первотелок были объединены в одну группу.
Рисунок 1. Частота встречаемости аллелей генов-маркеров молочной продуктивности
маточного поголовья
Изучая частоту встречаемости по аллелей по маркерам CSN3, PRL, видно, преобладание аллеля А, наличие которого составляет, соответственно по генам, 0,97, 0,77. По гену BLG соотношение аллелей распределяется примерно поровну, что равно 0,44 и 0,56.
Исследованиями установлена
взаимосвязь между генотипами по изучаемым генам с молочной продуктивностью коров (табл. 1).
После проведения реакции рестрикции и оценки полиформизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) распределение лактирующих коров по генотипам локуса гена бета-лактоглобулин было следующим: из 271 исследованных животных имели генотип АА - 62 гол. (23%), генотип АВ - 131 гол. (48%) и
генотип ВВ - 78 гол. (293%). По гену каппа-казеин генетическое равновесие смещено в сторону генотипа АА - 212 гол. (78%), генотип АВ - 44 гол. (16%), животных с желательным генотипом ВВ оказалось всего 15 гол. (6%).
Аналогичная ситуация наблюдается при анализе большинства генов-маркеров. Методом ПЦР-ПДРФ было изучено распределение частот аллелей гена пролактин, обусловленных молчащей А^-транзицией, возникающей в 103 кодоне (экзон 3) и приводящей к появлению полиморфного RsaI-сайта. Распределение частот полиморфных вариантов гена PRL следующее - коров с генотипом АА обнаружено 165 гол. (61%), АВ - 83 гол. (31%), ВВ - 23 гол. (8%).
Таблица 1 - Генотип, продуктивность и качество молока коров СХПК «Рассвет» Кукморского района
Генотип Поголовье Продуктивность
№ лактации ж.м., кг удой, кг качество молока
гол. % жир, % белок, % СОМО плотность
CSN3
AA 212 78 2,7±4,9 542±5,9 6466±73,24 3,55±0,084 3,23±0,061 9,07±0,017 30,4±0,245
AB 44 16 2,7±0,26 557±10,1 6237±177,2 3,46±0,18 3,25±0,16 9,15±0,03 32,2±0,402
BB 15 6 3,9±0,56 586*±21,07 6200±348,9 3,79±0,32 3,09±0,22 8,79±0,105 29,8±0,74
PRL
AA 165 61 2,7±0,14 538±5,7 6394±88,6 3,48±0,101 3,21±0,020 9,02±0,070 30,4±0,292
AB 83 31 3,0±0,19 550±7,14 6459±112,9 3,41±0,112 3,26±0,093 9,12±0,99 30,5±0,398
BB 23 8 2,7±0,33 556±17,88 6379±245,6 3,65±0,242 3,21±0,064 9,17±0,251 31,0±0,473
BLG
AA 62 23 3,1±0,24 557±10,64 6583±154,8 3,47±0,177 3,24±0,029 9,09±0,135 30,8±0,44
AB 131 48 2,7±0,14 540±6,21 6451±97,5 3,54±0,17 3,24±0,47 9,02±0,121 30,6±0,46
BB 78 29 2,7±0,20 539±7,28 6217±109,23 3,61±0,10 3,21±0,02 9,12±0,08 30,1±0,41
В среднем по стаду 2,7±0,10 542±4,32 6401±66,0 3,49±0,072 3,23±0,014 9,06±0,054 30,45±0,218
Примечание: *- Р<0,05, ** - Р<0,01, *** - Р<0,001
В нашем исследовании коровы с генотипом ВВ по CSN3, в сравнении с животными с генотипом АА достоверно более крупные, разница в живой массе составила 44 кг или 7,5% (Р<0,05). В этой же группе наблюдается наибольшая средняя продолжительность лактации - 3,9 лактации, разница между животными указанных групп составила 1,2 лактаций. По остальным генам так же выявлена зависимость полиморфизма с величиной живой массы. Так по гену-гормону пролактин коровы с гомозиготным генотипом по аллелю А имели преимущество по отношению к животным с генотипом ВВ на 18 кг, или 3,2%.
Наибольшей
живой
массой
ВВ
установлена генотипами по с молочной
отличались коровы с генотипами CSN3 , PRLВВ, BLGАА по отношению к животным с другими генотипами.
Исследованиями взаимосвязь между изучаемым генам продуктивностью и живой массой лактирующих коров. Так, система бета-лактоглобулина представленная в нашем исследовании двумя аллелями, где аллель В влияет на жирность молока коров, отвечает за белковомолочность и показатель биологической ценности молока. Однако высокие надои молока обнаружены у коров с генотипом BLGАА по отношению к особям с генотипом LGBВВ и составила с разницей на 366 кг молока или 5,6%.
По локусу гена каппа-казеина (CSN3) преимущество имели коровы гомозиготные
по аллелю А, по сравнению с гомозиготными по аллелю А животными. От них получено на 266 кг больше молока или 4,1%, однако содержанием жира ниже на 0,24%.
Выявлена закономерность высокой продуктивности с полиморфизмом гена пролактина. Коровы с гетерозиготным генотипом, превосходили животных с генотипом PRLАА, по удою на 65 кг или 1,0%. По качественным показателям молока превосходство составило по жиру на 0,13% и по белку - 0,05%.
В настоящее время влияние генов-маркеров молочной продуктивности на воспроизводительную способность в литературе освещен недостаточно. Поэтому для оценки воспроизводительной способности животных нами проведены исследования, которые показывают, что телки по гену каппа-казеин с гомозиготным генотипом по аллелю А, осеменялись раньше на 1,4 месяца в среднем, чем телки с генотипом ВВ (табл. 2). Однако животные с генотипом ВВ имели более короткий сервис-период, чем коровы с гетерозиготным генотипом на 39,8 дней, что соответственно повлияло на продолжительность межотельного периода, разница между сравниваемыми
подвыборками составила 7,9 дней. По пролактину у животных гомозиготных по аллелю В возраст первого осеменения меньше, чем у особей с генотипом АА на 2,2 месяца.
Таблица 2 - Генотип, воспроизводительные качества коров СХПК «Рассвет» Кукморского _района_
Генотип Поголовье Первое осеменение Последняя законченная лактация
гол. % возраст ж. м. сервис-период МОП
CSN3
AA 212 78 15,9±0,356 384,0±0,6 108,2±4,47 379,2±4,39
AB 44 16 16,0±0,76 383,0±1,17 138,6±12,79 375,7±11,75
BB 15 6 17,3±1,12 384,6±2,63 98,8±17,16 367,8±12,013
PRL
AA 165 61 16,6±0,320 384,1±0,66 110,7±5,34 378,9±5,75
AB 83 31 15,7±0,68 383,2±0,88 115,4±8,09 376,9±5,14
BB 23 8 14,4±1,21 384,0±1,95 113,5±11,71 376,9±15,6
BLG
AA 62 23 15,8±0,68 383,8±1,12 95,7±6,88 377,0±6,45
AB 131 48 16,3±0,49 383,9±0,84 116,1±6,23 379,9±6,93
BB 78 29 15,6±0,66 384,1±0,97 119,1±8,40 376,2±5,39
В среднем по стаду 16,0±0,31 384,0±0,51 111,6±4,13 377,7±3,90
Изучая закономерности влияния полиморфизма гена пролактин и бета-лактоглобулин, обнаружены сходные закономерности. У особей с генотипом АА, в сравнении с коровами с генотипом ВВ наблюдается меньшая продолжительность сервис-периода, разница численно равна 2,8 дней и 23,4 дней соответственно.
Вывод. Таким образом, установлено наличие зависимости параметров молочной продуктивности коров от полиморфизма генов-маркеров молочной продуктивности CSN3, BLG, PRL.
Животные с генотипами CSN3AA, BLGAA и PRL^ превосходили коров с генотипами АВ и ВВ по уровню удоя и количеству молочного белка. По воспроизводительным качествам коровы с коротким сервис-периодом являлись, в основном, носителями аллеля А по генам BLG и PRL. Однако более жирномолочное молоко обнаружено у коров с преобладанием аллеля В анализируемых генов в геноме животного. Результаты проведенных исследований
свидетельствуют о целесообразности использования генетических маркеров в качестве критерия при отборе и подборе животных.
ЛИТЕРАТУРА:
1.ДНК-полиморфизм генов гормона роста и пролактина у ярославского и чёрно-пёстрого скота в связи с молочной продуктивностью / СР. Хатами, О.Е. Лазебный, В.Ф. Максименко, Г.Е. Сулимова // Генетика. - 2005. - Т. 41, № 2. - С. 229-236.
2. Долматова И.Ю., Гареева И.Т., Ильясов А.Г. ДНК-технологии в животноводстве // Достижения науки и техники АПК. - 2010. - № 2. - С. 42-43.
3.Использование ДНК технологий
вживотноводстве / Ф.С. Сибагатуллин, Т.Х. Фаизов, Г.С. Шарафутдинов, Ш.З. Валидов, Р.Р. Шайдуллин // Вестник Казанского государственного аграрного университета.
- 2010. - Том 15, № 1. - С. 130-132.
4. Калашникова Л.А., Труфанов В.Г. Влияние генотипа каппа-казеина на молочную продуктивность и технологические свойства молока коров холмогорской породы // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2006. - № 4.
- С. 43-44.
5. Полиморфизм генов гормона роста bGH и пролактина bPRL и изучение его связи с процентным содержанием жира в молоке у коров костромской породы / И.В. Лазебная, О.Е. Лазебный, М.Н. Рузина, Г.А. Бадин, Г.Е. Сулимова // Сельскохозяйственная биология. - 2011. -№ 4. - С. 46-51.
6. Роль ДНК-маркеров признаков продуктивности сельскохозяйственных животных / Н.А. Зиновьева, О.В. Костюнина, Е.А. Гладырь, А.Д. Банникова, В.Р. Харзинова, П.В. Ларионова, К.М. Шавырина, Л.К. Эрнст // Зоотехния. - 2010.
- № 1. - С. 8-10.
7. Association of genetic variants of bovine prolactin with milk production traits of Black-and-White and Jersey cattle / A. Dybus, W. Grzesiak, H. Kamieniecki, I. Szatkowska, Z. Sobek, P. Blaszczyk, E. Czerniawska-Piatkowska, S. Zych, M. Muszynska // Arch. Tierz., Dummerstorf. - 2005. - Vol. 48, № 2. -P. 149-156.
8. Dybus A. Associations between Leu/Val polymorphism of growth hormone gene and milk production traits in Black-and-White cattle // Arch. Tierz., Dummerstorf. -2002. - Vol. 45, № 5. - P. 421-428.
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ КАНДИДАТОВ МОЛОЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ НА ПРИМЕРЕР ПЛЕМЗАВОДА «РАССВЕТ» КУКМОРСКОГО РАЙОНА РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН
Юльметьева Ю.Р., Шакиров Ш.К., Ахметов Т.М.
Резюме
Проведенный краткий обзор перспективных генов-маркеров продуктивности животных показывает целесообразность более широкого внедрения ДНК-маркеров в животноводческую практику. Преимущество ДНК-маркеров заключается в том, что можно определить генотип животного независимо от пола, возраста и физиологического состояния особей, что позволяет значительно повысить эффективность селекционно-племенной работы и, соответственно, выхода животноводческой продукции.
MOLEKULYARNAYA DIAGNOSIS OF GENETIC POLYMORPHISM OF GENES CANDIDATES MILK PRODUCTIVITY ON PRIMERED PLEMZAVOD "DAWN" KUKMOR REGION OF THE REPUBLIC OF TATARSTAN
Yulmetyev Y. R., Shakirov W. K., Akhmetov So M Summary
An overview of promising genetic markers productivity of animals shows the feasibility of a wider introduction of DNA markers in animal practice. The advantage of DNA markers is that you can determine the genotype of the animal regardless of sex, age and physiological state of individuals that can significantly improve the efficiency of breeding efforts and, consequently, the output of livestock products.
УДК 619:616.98:578.833.31
РАЗРАБОТКА АНТИГЕННОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО КОНЪЮГАТА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ
МЕТОДОМ ИФА
Юсупова Г.Р. - д.б.н., доцент, *Юсупов Р.Х. - д.в.н., профессор, зав. отделом Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана *Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности,
г.Казань, тел.: (843) 273-96-56
Ключевые слова: классическая чума свиней, иммуноферментный анализ, антитела, антиген.
Key words: classic swine fever, immune and enzyme analysis, antibody, antigen.
Классическая чума свиней (КЧС) -это высококонтагиозное вирусное заболевание, которое является предметом особого контроля государственных и ветеринарных служб во всем мире [5, 6, 2]. Диагностика КЧС осуществляется на основании выявления антигена и антител. Для определения вирусоспецифических антител существуют различные варианты непрямого и прямого сэндвич ИФА, которые используют антивидовые антитела, меченые ферментом. Но эти методы многостадийны, имеется узковидовая зависимость, требуется значительное время (18-20 часов) для анализа и из-за повышенного фона оптической плотности двойных антител снижается
чувствительность метода [3, 1, 7, 8].
Целью нашей работы являлась усовершенствование тест-системы на основе ИФА для выявления вирусоспецифических антител в сыворотке крови свиней с использованием безопасного в инфекционном отношении аттенуированной вирусовакцины ЛК-ВНИИВВиМ.
Материалы и методы. Для
получения специфического антигенного конъюгата использовали вирусвакцину против чумы свиней ЛК-ВНИИвВиМ из штамма «К» (ТУ46-21-796-78) и фермент периоксидазы из корней хрена производства Великобритании.
Для конъюгирования антигена вируса КЧС с ферментом проводили активирование углеводных остатков фермента пероксидазы до альдегидных форм периодатным методом по M.Wilson, P. Nakane (1978). К раствору активированного фермента (20 мг/мл) добавляли различные концентрации от 10 до 50 мг белка культурального вакцинного вируса КЧС. Для оптимальной конъюгации и восстановления иминовой связи добавляли боргидрит натрия. Все условия, необходимые для оптимального
соотношения фермента и вирусного белка в конъюгате найдены опытным путем.
Испытание полученного конъюгата фермента с антигеном вируса КЧС проводили прямым ИФА в модификации Г.Ф. Ильясовой и др. (2003), в основе
