10ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ xrn1
ДЛЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
https://doi.org/10.29296/2618723X-2020-01-05
Модуляция экспрессии молекул адгезии на клетках периферической крови у мышей СВА при гепатоканцерогенезе
О.А. Бочарова1, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией иммунофармакологии,
Р.В. Карпова1, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунофармакологии,
Е.В. Бочаров1, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунофармакологии,
А.А. Вершинская1, кандидат медицинских наук, младший научный сотрудник лаборатории иммунофармакологии, М.А. Барышникова1, кандидат фармацевтических наук, заведующий лабораторией экспериментальной диагностики и
биотерапии опухолей,
Д.А. Девриш42ов3, доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАН, заведующий кафедрой иммунологии и
биотехнологии,
И.В. Казеев1, кандидат технических наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунофармакологии,
В.Г. Кучеряну2, доктор медицинских наук, главный научный сотрудник лаборатории общей патологии нервной
системы,
М.В. Киселевский1, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией клеточного иммунитета
1ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России,
115478, Россия, Москва, Каширское шоссе, 24;
2ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии», 125315, Россия, Москва, ул. Балтийская, д. 8;
3ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»,
109472, Россия, Москва, ул. академика Скрябина, 23 E-mail: planta39@rambler.ru
Резюме. Цель работы - изучение экспрессии молекул адгезии LFA-1 (CD11a/ CD18) и Mac-1 (CD11b/CD18) на клетках периферической крови у мышей-самцов СВА (сублиния CBA/LacY) при гепатоканцерогенезе под воздействием сухого экстракта комплексного фитоадаптогена.
Контрольные мыши получали воду в качестве питья. Животные опытной группы - 0,3% водный раствор сухого экстракта комплексного фитоадаптогена в течение 1-го месяца жизни (профилактическое применение). Препарат был изготовлен по технологии сублимирования из жидкой формы комплексного фитоадаптогена, включающего компоненты экстрактов 40 растений, в том числе Panax ginseng, Eleutherococcus senticosus, Rhodiola rosea и другие адаптогены. Уровень экспрессии CD11a и CD11 b антигенов на клетках периферической крови определяли в реакции непрямой иммунофлюоресценции. Параметры фиксировали у мышей в возрасте 4, 8, 22 мес. Статистический анализ результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0.
Спонтанный гепатоканцерогенез у мышей СВА сопровождался снижением экспрессии CD11a и CD11 b антигенов на клетках периферической крови. Воздействие сухого экстракта комплексного фитоадаптогена способствовало повышению уровня экспрессии CD11a и CD11 b антигенов по сравнению с контрольными животными. Эффективность сухого экстракта сравнима с таковой для жидкой формы фитоадаптогена, выявленной в предыдущем исследовании.
Повышение уровня молекул LFA-1 и Mac-1 на клетках периферической крови у мышей при спонтанном гепатоканцерогенезе под воздействием нетоксичного иммуномодулятора в ранний период жизни животных на примере сухого экстракта комплексного фитоадаптогена может иметь значение для усиления адгезии между иммунными эффекторами и опухолевыми клетками.
Ключевые слова: молекулы адгезии LFA-1 и Mac-1, адгезионные взаимодействия, противоопухолевый иммунитет, гепатоканцерогенез, фитоадаптогены, фитокомпозиция.
Для цитирования: Бочарова О.А., Карпова Р.В., Бочаров Е.В., Вершинская А.А., Барышникова М.А., Девришов Д.А., Казеев И.В., Кучеряну В.Г., Киселевский М.В. Модуляция экспрессии молекул адгезии на клетках периферической крови у мышей СВА при гепатоканцерогенезе. Лабораторные животные для научных исследований. 2020; 1: 42-46. https://doi.org/10.29296/2618723X-2020-01-05
Modulation of the adhesion molecules expression on peripferal blood cells in
cba mice during hepatocarcinogenesis
O.A. Bocharova1, R.V. Karpova1, E.V. Bocharov1, A.A. Vershinskaya1, M.A. Baryshnikova1, D.A. Devrishov3, I.V. Kazeev1,
V.G. Kucheryanu2, M.V. Kiselevsky1 1N.N. Blokhin National Medical Research Center of oncology, Ministry of Health of Russia, Kashirskoe shosse, 24, 115478, Moscow, Russia; institute of general pathology and pathophysiology,
(42 2020 LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE № 1
ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ xrn1
^U^U для НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Baltiyskaya St., 8, 125315, Moscow, Russia; K.I. Scriabin Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology, Аcad. Scriabin St., 23, 109472, Moscow, Russia E-mail: planta39@rambler.ru
Summary. The aim of this investigation was to evaluate the expression of LFA-1 (CD11a / CD18) and Mac-1 (CD11b / CD18) adhesion molecules on peripheral blood cells in CBA male mice (subline CBA/LacY) during hepatocarcinogenesis under the phytoadaptogen complex dry extract administration. Control mice received water as a drink. The experimental mice received 0.3% phytoadaptogen complex dry extract water-solution during the first month of life (preventive administration). Preparation was produced by a desiccation technology of forty medical herbs (including Panax ginseng, Eleutherococcus senticosus, Rhodiola rosea) water-ethanol extracts components.
The CD11a and CD11b antigens expressions on peripheral blood cells were analyzed by indirect immunofluorescence reaction at the age of 4, 8, 22 months. Statistical analysis was performed with the program Statistica 6.0.
Spontaneous hepatomas formation in CBA mice was accompanied by a decrease in the expression of CD11a and CD11b antigens on peripheral blood cells. Phytoadaptogen complex dry extract preventive administration revealed the CD11a and CD11b antigens up-regulated expression. The effect of the phytoadaptogen complex dry extract is comparable to that for the liquid form of phytoadaptogen complex previously identified.
Up-regulated LFA-1 and Mac-1 molecules on peripheral blood cells in mice during spontaneous hepatocarcinogenesis using phytoadaptogen complex dry extract as non-toxic immunomodulator example in the early life of animals is essential for enhance the adhesion interactions between immune effectors and tumour cells.
Key words: LFA-1, Mac-1, adhesive interaction, anti-tumour immunity, hepatocarcinogenesis, phytoadaptogenes, herbal formula.
For citation: Bocharova O.A., Karpova R.V., Bocharov E.V., Vershinskaya A.A., Baryshnikova M.A., Devrishov D.A., Kazeev I.V., Kucheryanu V.G., Kiselevsky M.V. Modulation of the adhesion molecules expression on peripferal blood cells in CBA mice during hepatocarcinogenesis. Laboratory Animals for Science. 2020; 1: 42-46. https://doi.org/10.29296/2618723X-2020-01-05
Введение
Р2-Интегрины, в частности LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen-1, CD11a/CD18) и Mac-1 (monocyte adhesion complex CD11b/CB18), играют существенную роль в привлечении активированных цитотоксических лимфоцитов из периферической крови в опухолевую ткань. Контррецепторами LFA-1 и Mac-1 являются гистонеспецифические молекулы адгезии ICAM-1, участвующие также в поддержании гомотипической интеграции тканей [1].
Согласно исследованиям ряда авторов, ослабленная экспрессия ICAM-1 на мембранах опухолевых клеток представляет собой механизм, подавляющий экспрессию LFA-1 и Mac-1 на клетках периферической крови, что снижает прикрепление иммунных эффекторов к клеткам-мишеням, а также приводит к внутриопухолевой инфильтрации лейкоцитов [2; 3]. Очевидно, что изучение возможности восстановления адгезионных контактов при опухолевом процессе может внести вклад в реализацию противоопухолевого эффекта.
Интерес в этой связи представляют фитоа-даптогены, нормализующие межклеточную адгезию, усиливая процессы дифференцировки тканей и иммунологическую реактивность организма [4, 5].
На модели спонтанного гепатоканцерогенеза у мышей СВА ранее было выявлено, что кратковре-
менное в раннем онтогенезе воздействие на примере комплексного фитоадаптогена (КФА) в форме жидкого экстракта приводит к усилению экспрессии LFA-1 и Мас-1 интегринов на клетках периферической крови. Оно сопровождается признаками лейкоцитарной инфильтрации и деструкции гепатом, подавлением сывороточного уровня им-муносупрессивных интерлейкинов 6 и 10. Эти результаты оказались существенными для снижения частоты спонтанного опухолеобразования и увеличения продолжительности и качества жизни животных [6-9].
Однако остался невыявленным фенотип клеток, инфильтрирующих опухоль, а также не ясно, экспрессированы ли на этих клетках, в частности, адгезионные молекулы LFA-1 и Мас-1 при использовании комплексного фитоадаптогена. При этом с фармакологической точки зрения более современной и перспективной является сухая форма экстракта, практически субстанция препарата.
Таким образом, исследование возможности модуляции экспрессии молекул адгезии LFA-1 и Мас-1 на клетках периферической крови у мышей СВА при гепатоканцерогенезе на примере нетоксичного иммуномодулятора сухого экстракта комплексного фитоадаптогена (СКФА), а также оценка значимости коррекции нару-
2020 LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE № 1
2020
ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ ДЛЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
шении для усиления адгезии между иммунными эффекторами и опухолевыми клетками весьма актуальны.
Цель исследования - изучение экспрессии молекул адгезии LFA-1 (CD11a/ CD18) и Mac-1 (CD11b/ CD18) на клетках периферической крови у мышеИ-самцов СВА (сублиния CBA/LacY) при гепато-канцерогенезе на под воздействием СКФА.
Материал и методы
Работа проведена на мышах-самцах высокораковой линии СВА, сублиния СВА/Lac Y [10]. Животных содержали и выводили из эксперимента в соответствии с требованиями Европейской директивы по охране животных, используемых в научных целях. Контрольные животные (n = 33) получали в качестве питья воду, животные опытной группы (n = 36) - 0,3% водный раствор СКФА в 1-й месяц жизни (профилактическое воздействие).
КФА представляет собой нетоксичную фармацевтическую композицию на основе компонентов экстрактов 40 растений, в том числе фитоадапто-генов (женьшеня, элеутерококка, аралии и др). В составе КФА определены тритерпеновые сапонины, флавоноиды, эфирные масла, аминокислоты, витамины и другие соединения. Разработаны способы его биологической и физико-химической стандартизации [11-13].Выявлены антиокси-дантные, антистрессорные, гормономодулиру-ющие, антимутагенные, противоопухолевые и им-муномодулирующие, в том числе адгезиогенные и интерфероногенные свойства [14-17]. СКФА был приготовлен из жидкой формы с использованием технологии сублимирования.
У контрольных и опытных животных в возрасте 4, 8, 22 мес на клетках периферической крови исследовали уровни экспрессии СD11a и CD11b антигенов методом непрямой иммунофлюоресценции. Оставшиеся животные находились под наблюдением вплоть до их естественной гибели.
Статистический анализ данных проводили с использованием программы «STATISTICA 6.0», применяя дисперсионный анализ ONE-WAY ANOVA. Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Для оценки различий между группами применяли критерий Newman-Keuls. Статистически значимым считали различия при p <0,05.
Результаты и обсуждение
Результаты воздействия СКФА на экспрессию CD11a антигена клетками крови у мышей-самцов СВА в онтогенезе представлены в табл. 1, из которой видно, что в возрасте 4 и 8 мес у мышей
обеих групп количество клеток, экспрессирующих СБ11а антиген, статистически не различалось (р>0,5). К 22-месячному возрасту у мышей контрольной группы выявлено статистически достоверное снижение этого показателя с 45,9±3,4% (в возрасте 8 мес) до 36,5±1,9% (р8-22=0,03). У мышей опытной группы к 22 мес изменение экспрессии СБ11а антигена по сравнению с ранним периодом онтогенеза происходит статистически не значимо (52,3±3,0 и 44,6±2,1% соответственно, р4-22=0,05). По сравнению с 8 месячным возрастом этот показатель статистически не различался (р8-22=0,2). Отметим, что значение этого показателя оказалось выше в сравнении с аналогичным периодом онтогенеза (22 мес) у контрольных мышей (р1-2=0,01).
Результаты воздействия СКФА на экспрессию СБ11Ъ антигена клетками крови мышей СВА в онтогенезе представлены в табл. 2, из даееых которой следует, что у мышей контрольной группы количество клеток, экспрессирующих СБ11Ъ антиген, в возрасте 8 мес (12,1±1,7%) достоверно не отличалось от такового у 4-месячных животных (13,4±1,7%; р4-8=0,6). В возрасте 22 мес этот показатель статистически достоверно снизился до 6,8±1,1% (р8-22=0,02; р4-22=0,004). У опытных мышей уровень экспрессии СБ11Ъ антигена в возрасте 4 и 8 мес не различался (17,2±1,5 и 15,6±1,4%; р4-8=0,5), но имел тенденцию к повышению по сравнению с контрольными животными в аналогичные периоды онтогенеза (р1-2=0,1). К 22-месячному возрасту уровень экспрессии снизился до 12,1±1,1% (р8-22=0,06; р4-22=0,01). Вместе с тем в позднем онтогенезе в данной группе уровень экспрессии СБ11Ъ антигена достоверно превышал таковое у мышей контрольной группы в этом возрасте (р1-2=0,003).
Таким образом, согласно полученным результатам, при профилактическом воздействии СКФА у опытных мышей число клеток крови, экспрессирующих молекулы LFA-1 (СБ11а/СБ18) и Мас-1 (СБ11Ъ/СБ18), выше по сравнению с таковым показателем у контрольных животных.
Так как лигандами LFA-1 являются молекулы межклеточной адгезии ICAM-1, ICAM-2, возможно, что увеличение числа клеток периферической крови, экспрессирующих интегрин СБ11а, под воздействием СКФА будет способствовать более высокой иммунореактивности таких животных в осуществлении киллинга клеток-мишеней эффекторами иммунитета (ЫК-клетками, цитотоксиче-скими лимфоцитами) [18, 19].
При этом молекула Мас-1 экспрессируется на нейтрофилах, лимфоцитах и ЫК-клетках, являясь лигандом, в том числе ICAM-1. Поэтому аналогичные выводы уместны и в отношении повышенного
2020
LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE
№ 1
ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ хгл1
¿и ¿и ДЛЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Л- 1
Таблица 1
Экспрессия CD11a антигена на клетках периферической крови у мышей СВА при воздействии сухого экстракта комплексного фитоадаптогена
Группа животных 4 мес CD 11a+ клетки, %
8 мес 22 мес Р
1 Контроль (интактные) 49,4±3,6 45,9±3,4 36,5±1,9 р4-8=0,5 р8-22=0,03 р4-22=0,005
n=33 n=11 n=10 n=11
2 Опыт (воздействие СКФА) 52,3±3,0 49,0±2,9 44,6±2,1 р4-8=0,4 р8-22=0,2 р4-22=0,05
n=36 n=12 n=12 n=12
Р р1-2=0,5 р1-2=0,5 р1-2=0,01
Примечание. Здесь и в табл. 2: п - количество животных; р1-2 - различие показателя между группами; р4-8 - различие показателя в 4 и 8 мес.; р8-22 - различие показателя в 8 и 22 мес.; р4-22 - различие показателя в 4 и 22 мес.
Таблица 2
Экспрессия CD11b антигена на клетках периферической крови у мышей СВА при воздействии сухого экстракта комплексного фитоадаптогена
Группа животных 4 мес CD 11b+ клетки, %
8 мес 22 мес Р
1 Контроль (интактные) 13,4±1,7 12,1±1,7 6,8±1,1 р4-8=0,6 р8-22=0,02 р4-22=0,004
n=33 n=12 n=12 n=12
2 Опыт (воздействие СКФА) 17,2±1,5 15,6±1,4 12,1±1,1 р4-8=0,5 р8-22=0,06 р4-22 = 0,01
n=36 n=12 n=12 n=12
Р р1-2=0,1 р1-2=0,1 р1-2 =0,003
уровня экспрессии СБ11Ъ антигена у мышей опытной группы по сравнению с контрольными животными. В данном случае также возможна активация способности иммунных эффекторов инфильтрировать опухоль, контактировать с клетками-мишенями, что способствует гибели последних [20].
Заключение
На основании предшествующих и настоящих исследований можно полагать, что у мышей при спонтанном гепатоканцерогенезе сниженная активность Т-лимфоцитов обусловлена, в том числе недостатком экспрессии молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Мас-1 на эффекторах иммунитета. Фитоадаптогены, оказывающие адгезио-генное действие, способны нормализовать указанные показатели.
Таким образом, при введении СКФА в течение 1-го месяца постнатального онтогенеза высокоге-патомным мышам, включая завершающий период дифференцировки нормальной ткани печени (515-й день постнатального развития) можно обеспе-
чить длительный по времени эффект повышения экспрессии на клетках крови молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1.
Вместе с тем, эффективность профилактического воздействия СКФА на уровень экспрессии лейкоцитарных интегринов сравнима с таковой для жидкой формы фитоадаптогена, выявленной в предыдущем исследовании [6].
Повышение экспрессии лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на клетках периферической крови при профилактическом воздействии сухого экстракта мультифитоадаптогена может иметь значение для усиления контактных взаимодействий иммунных эффекторов с опухолевыми клетками.
Вклад авторов: все авторы внесли существенный вклад в работу над статьей и несут ответственность за ее содержание.
Authors Contribution: all the authors have made substantive contributions to the article and assume full responsibility for its content.
2020 LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE № 1
2020
ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ ДЛЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
Литература
1. Schttenhelm L., Hilkens C.M., Morrison V.L. 2-Integrins as regulators of dendritic cell, monocyte, and macrophage function. Front Immunol 2017; 20 (8): 186677. Doi: 10.3389/fimmu.2017.01866.
2. Бочарова О.А. Адгезионная концепция в биологии злокачественного роста. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2014; (2): 87-90.
3. Takeichi T., Mocevicius P., Deduchovas O. et al. aLe2-integrin is indispensable for CD8+ T-cell recruitment in experimental pancreatic and hepatocellular cancer. Int. J. Cancer 2012; 130 (9): 2067-76. Doi: 10.1002/ijc.26223.
4. Бочарова О.А. Профилактическая онкология и фитоадаптогены. Вестник РАМН. 2009; (7): 41-5.
5. Shikov A.N., Pozharitskaya O.N., Makarov V.G. Aralia elata var. mandshurica (Rupr. & Maxim.) J.Wen: An overview of pharmacological studies. Phytomedicine 2016; 23 (12): 1409-21. Doi: 10.1016/j.phymed.2016.07.011.
6. Бочарова О.А., Карпова Р.В., Ильенко В.А. и др. Лейкоцитарные интегрины при гепатоканцерогенезе мышей высокораковой линии СВА. Российский биотерапевтический журнал/ 2013; 12 (3): 53-6.
7. Бочарова О.А., Бочаров Е.В., Карпова Р.В. и др. Снижение возникновения гепатом при воздействии фитоадаптогена у высокораковых мышей СВА. Российский биотерапевтический журнал/ 2014; 13 (2): 73-6.
8. Бочаров Е.В., Карпова Р.В., Вершинская А.А. и др. Лимфоцитарная инфильтрация гепатокарцином мышей высокораковой линии СВА при воздействии мультифитоадаптогена в раннем постнатальном онтогенезе. Российский биотерапевтический журнал/ 2015; 14 (2): 85-90.
9. Бочаров Е.В., Карпова Р.В., Бочарова О.А. и др. Воздействие мультифитоадаптогена в раннем постнатальном онтогенезе, улучшающее выживаемость и соматическое состояние мышей высокораковой линии.
Российский биотерапевтический журнал. 2017; 16 (1): 76-81. Doi: 10.17650/1726-9784-2017-16-1-76-81
10. Модянова Е.А., Бочарова О.А., Маленков А.Г. Профилактическое действие контактинов-кейлонов на спонтанный канцерогенез у линейных мышей. Экспериментальная онкология. 1983; 5 (3): 39-42.
11. Бочарова О. А., Барышников А. Ю. Фитоадаптогены в онкологии. М.: ЗооМедВет, 2004: 138 с.
12. Шейченко В.И., Бочарова О.А., Шейченко О.П. и др. Аналитические возможности метода ЯМР для определения компонентов препарата Фитомикс-40. Заводская лаборатория. Диагностика материалов 2006; 72 (8): 15-23.
13. Шейченко О.П., Бочарова О.А., Крапивкин Б.А. и др. Исследование комплексного фитоадаптогена методом ВЭЖХ. Вопр. биол. мед. фарм. химии. 2012; (10): 52-9.
14. Бочарова О.А., Пожарицкая М.М., Чекалина Т.Л. и др. Роль адгезионных нарушений в патогенезе лейкоплакии и возможности их коррекции неспецифическим иммуномодулятором. Иммунология. 2004; 25 (1): 36-43.
15. Бочаров Е.В., Кучеряну В.Г., Крыжановский Г.Н. и др. Влияние комплексного фитоадаптогена на МФТП-индуцированный паркинсонический синдром у мышей. Бюлл экспер биол и мед. 2006; 141 (5): 495-8.
16. Бочарова О.А., Давыдов М.И., Клименков А.А. и др. Перспективы применения фитоадаптогена в лечении распространенного рака желудка. Бюлл экспер биол и мед. 2009; 148 (7): 96-9.
17. Куренная О.Н., Карпова Р.В., Бочарова О.А. и др. Антимутагенез мультифитоадаптогена в клетках дрожжей-сахаромицетов. Генетика. 2013; 49 (12): 1364-9. Doi: 10.1134/S1022795413120053
18. Li N., Yang H., Wang M. et al. Ligand-specific binding forces of LFA-1 and Mac-1 in neutrophil adhesion and crawling. Mol Biol Cell. 2018; 29 (4): 408-418. Doi: 10.1091/mbc.E16-12-0827.
19. Sharma A., Lawry S.M., Klein B.S. et al. LFA-1 Ligation by high-density ICAM-1 is sufficient to activate IFN- release by innate T-lymphocytes. J. Immunol. 2018; 201 (8): 2452-61. Doi: 10.4049/jimmunol.1800537
20. Sasada, T., Suekane S. Variation of tumor-infiltrating lymphocytes in human cancers: controversy on clinical significance. Immunotherapy. 2011; 3 (10): 1235-51.
2020 LABORATORY ANIMALS FOR SCIENCE № 1
