CC BY
12
УДК 577.151.4
МОДУЛЯЦИЯ ДЕЙСТВИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ НУКЛЕАЗЫ КРОЛИКА S-АДЕНОЗИЛ-Х-МЕТИОНИНОМ
Д.Е. Соболев1, Б.Ф. Ванюшин2
(кафедра биохимии; e-mail: [email protected])
В экстракте из митохондрий печени кролика обнаружена эндонуклеазная активность, которая по свойствам сходна с животной эндонуклеазой G. Эта активность выявлена в белковой фракции с молекулярной массой около 30 кДа, она стимулируется ионами Mg2+ и ингибируется ионами Zn2+. В отличие от растительных эндонуклеаз WEN1 и WEN2 она не чувствительна к статусу метилирования субстратных ДНК и ингибируется S-аденозил-L-метионином.
Ключевые слова: митохондрии, эндонуклеаза G, S-аденозил-Ь-метионин, метилирование.
Эндонуклеаза G, изначально обнаруженная в ядрах незрелых куриных эритроцитов, получила свое название за предпочтительное расщепление последовательностей (dG)n • (dC)n при n > 9 [1]. Позже было показано, что фермент локализован в межмембранном пространстве митохондрий [2, 3]. Эндонуклеаза G кодируется в ядре и содержит на N-кон-це сигнальную последовательность, обеспечивающую транспорт фермента в митохондрии [4]. Она найдена у животных и грибов, есть также указания на возможное ее наличие у растений [5].
Эндонуклеаза G принадлежит к семейству ßßa-Ме-finger ДНК/РНК-неспецифичных нуклеаз. Она присутствует в клетке в форме гомодимера с молекулярной массой субъединиц около 29 кДа [3, 6]. Активность эндонуклеазы G зависима от ионов Mg2+ и Mn2+ и ингибируется ЭДТА, ионами Zn2+ и Fe2+ и высокой ионной силой (свыше 50—75 мМ KCl). Фермент активен в широком диапазоне pH (от 5 до 9). Эндонуклеаза G расщепляет РНК, одно- и двухцепо-чечные ДНК с образованием 3'-OH и 5'-фосфатной группы [1, 3, 7, 8].
Предполагается, что эндонуклеаза G может участвовать в репликации и репарации мтДНК [9—11]. Она участвует в деградации ядерной ДНК при запрограммированной гибели клеток (ЗГК). Высвобождение эндонуклеазы G из межмембранного пространства митохондрий (совместно с цитохромом c и другими белками) происходит при воздействии продуцированного каспазой-8 белка tBID [12]. Высвобожденная эндонуклеаза G осуществляет межнуклеосомную фрагментацию ядерной ДНК [13]. Роль эндонук-леазы G в ЗГК подтверждается фенотипическими
изменениями у нокаутных по ее гену организмов, в том числе нарушениями фрагментации ДНК при ЗГК [14, 15].
Ранее мы выделили и охарактеризовали эндонуклеазы WEN1 и WEN2 из содержащих митохондрии везикул, образующихся в гибнущих клетках колеоптиля пшеницы Triticum aestivum L. [16, 17]. Предположительно, они могут принимать участие в запрограммированной гибели клеток колеоптиля. Мы показали их чувствительность к статусу метилирования субстратной ДНК и регуляцию их активности S-аденозил-Х-метионином и его аналогами, что характерно также для бактериальных эндонук-леаз рестрикции [18]. По некоторым своим свойствам (молекулярная масса, зависимость ферментативной активности от ионов двухвалентных металлов, предположительно митохондриальная локализация) эндонуклеаза пшеницы WEN1 сходна с эндонуклеазой G. До сих пор не было убедительно доказано наличие эндонуклеазы G у растений, хотя сходный по свойствам фермент был обнаружен в межмембранном пространстве митохондрий растений Arabidopsis thaliana и частично охарактеризован [5].
До сих пор о возможной модуляции действия эндонуклеаз животных S-аденозил-Х-метионином сведения в литературе отсутствуют.
В настоящей работе мы иследовали влияние S-аде-нозил-Х-метионина (SAM) и его лишенного метиль-ной группы аналога S-аденозил-Х-гомоцистеина (SAH) на эндонуклеолитическую активность, выделенную из митохондрий печени кролика, а также изучили зависимость этой активности от статуса метилирования расщепляемой ДНК.
1 ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, 127550 Москва, ул. Тимирязевская, 42.
2НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва.
Сокращения: БСА — бычий сывороточный альбумин, ДТТ — дитиотреитол, ЗГК — запрограммированная гибель клеток, TBE — Tris-боратный буфер, содержащий ЭДТА, ФМСФ — фенилметилсульфонилфторид, SAH — S-аденозил-Х-гомоцистеин, SAM — S-аде-нозил-Х-метионин.
Материалы и методы
Выделение митохондрий и экстракция белка
Выделение митохондрий производили при 4°С. Ткань свежеизвлеченной печени кролика Oryctola-gus cuniculus L. помещали в буфер для гомогенизации (25 мМ HEPES-NaOH pH 7,5, 150 мМ NaCl, 300 мМ сахароза, 5 мМ ЭДТА • Na, 2,5 мМ ДТТ, 1 мМ ФМСФ), 5 мл буфера/г ткани. Ткань гомогенизировали в ножевом гомогенизаторе и затем в поршневом стеклянном гомогенизаторе. Гомогенат дважды фильтровали через 4 слоя марли.
Отфильтрованный гомогенат дважды центрифугировали 10 мин при 750 g для удаления тяжелых органелл и недоразрушившихся клеток и полученные осадки отбрасывали. Супернатант фильтровали через 2 слоя марли.
Супернатант центрифугировали 15 мин при 17 500 g. Полученный супернатант отбрасывали, предварительно удалив с его поверхности остатки липи-дов. Верхнюю коричневую часть осадка ресуспенди-ровали в небольшом объеме буфера для гомогенизации, переносили в чистые центрифужные стаканы и дважды промывали буфером для гомогенизации. Промытый осадок ресуспендировали в буфере хранения (50 мМ HEPES-NaOH pH 7,5, 100 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА • Na, 2,5 мМ ДТТ, 1 мМ ФМСФ, 15% глицерин), 0,1 мл буфера/г исходной ткани печени.
Для экстракции белков из полученной суспензии митохондрий к ней добавляли 1 объем буфера лизиса (50 мМ HEPES-NaOH pH 7,5, 500 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА • Na, 2,5 мМ ДТТ, 1 мМ ФМСФ, 1%-й Тритон X-100). Смесь гомогенизировали в стеклянном поршневом гомогенизаторе и инкубировали при 4°С в течение 20 мин при помешивании. Полученный лизат центрифугировали 120 мин при 48 400g и отбирали супернатант — суммарный экстракт митохондрий.
Определение эндонуклеазной активности
В качестве субстрата для определения эндонук-леазной активности использовали dam, dcm-мети-лированную (+) и неметилированную (—) ДНК фага X (Fermentas) или их смесь в пропорции 1: 1 (в опытах, где статус метилирования субстратной ДНК не указан). Метилированная фаговая ДНК содержит остатки 5-метилцитозина в последовательностях Cm5CWGG и ^-метиладенина в последовательностях Gm6ATC. Реакционная смесь объемом 10 мкл содержала 0,6 мкг ДНК, 10 мМ HEPES-NaOH pH 7,5, 0,5 мкл мито-хондриального экстракта (контроль), а также, где это указано, S-аденозил-Х-метионинхлорид, S-аденозил-Z-гомоцистеин, MgCl2 и ZnSO4 (опыт). Смеси инкубировали при 37°С в течение 2 ч, добавляли 2 мкл 6х буфера для нанесения на гель (10 мМ Трис-HCl pH 7,6, 0,03% бромфеноловый синий, 0,03% ксилен-цианол, 60% глицерин, 60 мМ ЭДТА) (Fermentas) и наносили на 0,75%-й агарозный гель в трис-борат-
ном буфере pH 8,3, содержащем 0,0005%-й бромистый этидий. Электрофорез проводили при напряжении 7,5 В/см до пробега бромфенолового синего 7 см в геле и продукты гидролиза ДНК визуализировали в УФ-свете.
Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Разделение белков производили по методике Laemmli (Laemmli 70) в 4%-м концентрирующем и 12%-м разделяющем гелях. Гели окрашивали нитратом серебра по методике [20].
Определение эндонуклеазной активности в геле. В разделяющий полиакриламидный гель для вертикального электрофореза белков при его приготовлении добавляли ДНК из тимуса теленка до конечной концентрации 40 мкг/мл. После электрофореза гель для удаления SDS однократно промывали в 0,5%-м растворе Тритон X-100 в течение 20 мин и четырехкратно в дистиллированной воде в течение 20 мин. Затем гель переносили в буфер, содержащий 25 мМ Трис-HCl pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 10 мМ CaCl2, и инкубировали в течение ночи в закрытой чашке Петри при 37°С. Затем в буфер с гелем добавляли бромистый этидий до концентрации 0,0025% и после 15 мин инкубации зоны гидролиза ДНК в визуализировали в УФ-свете.
Определение концентрации белка производили по микроварианту метода Bradford [21] с использованием БСА в качестве стандарта.
Результаты и их обсуждение
Митохондрии печени кролика были выделены при помощи дифференциального центрифугирования на основе описанных в литературе методик [22, 23]. В экстракте из них была обнаружена нуклеазная активность с кажущейся молекулярной массой около 30 кДа (рис. 1), что соответствует массе мономера эндонуклеазы G [3]. Эндонуклеазная активность, присутствующая в митохондриальном экстракте, стимулируется ионами Mg2+ и ингибируется ионами Zn2+ (рис. 1), что тоже характерно для эндонуклеазы G [7].
Исследована зависимость действия эндонукле-азной активности митохондриального экстракта на субстратные ДНК от статуса их метилирования и от S-аденозил-Х-метионина и S-аденозил-Х-гомо-цистеина. В качестве субстрата использованы не-метилированная (dam—, dcm—) и метилированная по сайтам Gm6ATC и Cm5CWGG (dam+, dcm+) ДНК фага X. Эти ДНК идентичны по длине, нукле-отидной последовательности и концентрации в реакционной смеси. Найденная эндонуклеаза расщепляет оба эти субстрата примерно одинаково (рис. 2), что отличает ее от эндонуклеаз пшеницы WEN1 и WEN2, предпочтительно расщепляющих соответственно метилированную и неметилированную ДНК [16, 17].
S-аденозил-Х-метионин заметно подавляет расщепление субстратных ДНК в присутствии ионов Mg2+. S-аденозил-Х-гомоцистеин, который по сравнению с SAM не имеет метильной группы, не влияет
К Mg Е Mg
+
Рис. 1. А — эндонуклеазная активность суммарного белкового экстракта митохондрий в 12% ПААГ с вплавленной в гель тимусной ДНК; Б — зависимость эндонуклеазной активности суммарного белкового экстракта митохондрий (800 нг белка) от ионов Mg2+ и Zn2+ (5 мМ). K — контроль, E — ионы металлов не добавлялись
на эндонуклеазную активность (рис. 2). Это отличает изученную животную митохондриальную эндонуклеазную активность от пшеничной эндонуклеа-зы WEN1, которая, напротив, активируется SAM, SAH и SiBA [16].
Таким образом, эндонуклеазная активность из экстракта митохондрий кролика, соответствующая по свойствам эндонуклеазе G, не различает субстратные ДНК по статусу их метилирования. Чувствительность к статусу метилирования субстратной ДНК известна для охарактеризованных нами эндонукле-аз проростков пшеницы WEN1 и WEN2 [16, 17]
К SAM SAH
. + - + - + - +
Рис. 2. Зависимость эндонуклеазной активности суммарного белкового экстракта митохондрий (800 нг белка) от SAM и SAH (2 мМ) и статуса метилирования субстратной ДНК (—, dam, dcm-неметилированная ДНК; +, dam, dcm-метилированная ДНК) в присутствии Mg2+ (5 мМ). К — контроль
и некоторых бактериальных эндонуклеаз рестрикции (в том числе принадлежащих, как и эндонук-леаза G, к рра-Ме-А^ег-семейству) [24, 25]. Реакция митохондриального фермента животных на SAM (ингибирование активности) противоположна характерной для SAM-зависимых эндонуклеаз рестрикции и WEN1 активации под действием SAM. Поэтому, в отличие от известных растительных и бактериальных эндонуклеаз, SAM не является позитивным алло-стерическим эффектором для животной митохонд-риальной эндонуклеазы.
CnHCOK ËHTEPATyPH
1. Ruiz-Carrillo A., Renaud J. Endonuclease G: a (dG)n • (dC)n-specific DNase from higher eukaryotes // EMBO Journal. 1987. Vol. 6. N 2. P. 401-407.
2. Ohsato T., Ishihara N., Muta T., Umeda S., Ikeda S., Mihara K., Hamasaki N., Kang D. Mammalian mitochondrial endonuclease G. Digestion of R-loops and localization in intermembrane space // Eur. J. Biochem. 2002. N 269. P. 5765-5770.
3. Davies A.M., Hershman S., Stabley G.J., Hoek J.B., Peterson J., Cahill A. A Ca2+-induced mitochondrial permeability transition causes complete release of rat liver endonuclease G activity from its exclusive location within the mitochondrial intermembrane space. Identification of a novel endo-exonuclease activity residing within the mitochondrial matrix // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31. N 4. P. 1364-1373.
4. Oda K, Kawasaki N, Fukuyama M., Ikeda S. Ectopic expression of mitochondria endonuclease Pnulp from Schizo-saccharomyces Pombe induces cell death of the yeast //J. Bio-chem. and Mol. Biol. 2007. Vol. 40. N 6. P. 1095-1099.
5. Balk J., Chew S.K., Leaver C.J., McCabe P.F. The intermembrane space of plant mitochondria contains a DNase activity that may be involved in programmed cell death // Plant J. 2003. N 34. P. 573-583.
6. Loll B., Gebhardt M., Wahle E., Meinhart A. Crystal structure of the EndoG/EndoGI complex: mechanism of EndoG inhibition // Nucleic Acids Res. 2009. Vol. 37. N 21. P. 7312-7320.
7. Widlak P., Li L.Y., Wang X., Garrard W.T. Action of recombinant human apoptotic endonuclease G on naked DNA and chromatin substrates: cooperation with exonuc-lease and DNase I // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. N 51. P. 48404-48409.
8. Widlak P., Garrard W.T. Discovery, regulation, and action of the major apoptotic nucleases DFF40/CAD and endonuclease G // J. Cell. Biochem. 2005. N 94. P. 1078-1087.
9. Côté J., Ruiz-Carrillo A. Primers for mitochondrial DNA replication generated by endonuclease G // Science. 1993. Vol. 261. N 5122. P. 765-769.
10. Zassenhaus H.P., Denniger G. Analysis of the role of the NUC1 endo/exonuclease in yeast mitochondrial DNA recombination // Current Genetics. 1994. Vol. 25. N 2. P. 142-149.
11. Ikeda S., Ozaki K. Action of mitochondrial endonuclease G on DNA damaged by L-ascorbic acid, peplomy-cin, and cis-diamminedichloroplatinum (II) // Biochem. and Biophys. Res. Comm. 1997. Vol. 235. N 2. P. 291-294.
12. van Loo G., Schotte P., van Gurp M., Demol H., Hoo-relbeke B., Gevaert K., Rodriguez I., Ruiz-Carrillo A., Van-dekerckhove J., Declercq W., Beyaert R., Vandenabeele P. Endonuclease G: a mitochondrial protein released in apop-tosis and involved in caspase-independent DNA degradation // Cell Death and Differentiation. 2001. Vol. 8. N 12. P. 1136-1142.
13. Li L.Y., Luo X., Wang X. Endonuclease G is an apop-totic DNase when released from mitochondria // Nature. 2001. Vol. 412. N 6842. P. 95-99.
14. Parrish J., Li L, Klotz K, Ledwich D, Wang X., Xue D. Mitochondrial endonuclease G is important for apop-tosis in C. elegans // Nature. 2001. Vol. 412. N 6842. P. 90-94.
15. Büttner S., Eisenberg T., Carmona-Gutierrez D., Ruli D., Knauer H., Ruckenstuhl C., Sigrist C., Wissing S, Kollroser M., Fröhlich K.U., Sigrist S., Madeo F. Endonuclease G regulates budding yeast life and death // Mol. Cell. 2007. Vol. 25. N 2. P. 233-246.
16. Fedoreyeva L.I., Sobolev D.E., Vanyushin B.F. Wheat endonuclease WEN1 dependent on S-adenosyl-L-methionine and sensitive to DNA methylation status // Epigenetics. 2007. Vol. 2. N 1. P. 50-53.
17. Федореева Л.И., Соболев Д.Е., Ванюшин Б.Ф. S-AäeH03Hn-L-MeTH0HHH3aBHCHMaK и чувствительная к статусу метилирования ДНК эндонуклеаза WEN2 из колеоп-тилей пшеницы // Биохимия. 2008. Т. 73. № 9. С. 1243—1251.
18. Sistla S., Rao D.N. S-Adenosyl-L-methionine-depen-dent restriction enzymes // Critical reviews in biochemistry and molecular biology. 2004. Vol. 39. N 1. P. 1—19.
19. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. N 5259. P. 680—685.
20. Merril C.R., Goldman D., Sedman S.A., Ebert M.H. Ultrasensitive stain for proteins in polyacrylamide gels shows regional variation in cerebrospinal fluid proteins // Science. 1981. Vol. 211. N 4489. P. 1437—1438.
21. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248—254.
22. Cummings O.W., King T.C., Holden J.A., Low R.L. Purification and characterization of the potent endonuclease in extracts of bovine heart mitochondria //J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. N 5. P. 2005—2015.
23. Low R.L., Gerschenson M. Endonuclease G isolation and assays // Methods in Molecular Biology. 2002. Vol. 197. P. 331—349.
24. Yang W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism // Quarterly Rev. of Biophys. 2011. Vol. 44. N 1. P. 1—93.
25. Sir Richard J. Roberts. REBASE — The Restriction Enzyme Database. (URL: http://rebase.neb.com 01.12.2011).
Поступила в редакцию 15.05.12
MODULATION OF THE RABBIT MITOCHONDRIAL ENDONUCLEASE ACTION
BY S-ADENOSYL-Z-METHIONINE
D.E. Sobolev, B.F. Vanyushin
Endonuclease activity found in rabbit liver mitochondrial extract is similar to known endonuclease G: it has an apparent molecular mass value of about 30 kDa, it depends on Mg2+ and is inhibited with Zn2+. Unlike WEN1 and WEN2 plant endonucleases it is unsensitive to DNA methylation status and inhibited with S-adenosyl-L-methionine.
Key words: mitochondria, endonuclease G, S-adenosyl-L-methionine, methylation.
Сведения об авторах
Соболев Дмитрий Евгеньевич — специалист, науч. сотр. ГНУ ВНИИСБ Россельхозакадемии. Тел.: 8-495-939-54-12, +7-903-204-48-27; e-mail: [email protected]
Ванюшин Борис Федорович — докт. биол. наук, проф., чл.-корр. РАН, зав. отделом молекулярных основ онтогенеза, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ. Тел.: 8-495-939 54-12, e-mail: [email protected]
