CC BY
8
Анестезиология и реаниматология 2018, №3, с. 86-94
https://doi.org/10.17116/anaesthesiology201803186
The Russian Journal of Anaesthesiology and Reanimatology 2018, №3, pp. 86-94 https://doi.org/10.17116/anaesthesiology201803186
Модифицированный тест с батроксобином для определения активного фибриногена методом тромбоэластографии
© Г.М. ГАЛСТЯН*, О.А. ПОЛЕВОДОВА, А.Л. БЕРКОВСКИЙ, Е.В. СЕРГЕЕВА, В.Г. САВЧЕНКО
ФГБУ «Национальным медицинским исследовательским центр гематологии» Минздрава России, Москва, Россия
Цель исследования — разработать метод определения уровня активного фибриногена (АФ) с помощью тромбоэластографии (ТЭГ), не подверженный влиянию количества тромбоцитов крови и гепаринотерапии, а также адаптированный для выполнения у постели больного.
Материал и методы. В качестве индуктора фибринового сгустка использован батроксобин (фермент из яда гремучей змеи Bothrops atrox). Кровь у больных получали путем венепункции одной из периферических вен и собирали в пробирки S-Monovette (SARSTEDT, Германия) с 3,2% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9 (1 часть раствора цитрата натрия, 9 частей крови) и в пробирки S-Monovette с антикоагулянтом литий-гепарин (концентрация гепарина 10—30 ед/мл крови). Уровень функционального фибриногена (FF) исследовали на тромбоэластографе TEG 5000 («Haemoscope Corporation», США) с реактивом Haemonetics («Haemonetics Corporation», США) по величине максимальной амплитуды (МА) — MAFF; АФ определяли на TEG 5000 с добавлением 10 мкл раствора батроксобина к 340 мкл гепаринизированной крови по величине МАбатрокс. Результаты. В результате хроматографической очистки тромбиноподобная активность батроксобина распределялась по 2 фракциям: 1-я фракция батроксобина не влияла на МА в обедненной и обогащенной тромбоцитами плазме, 2-я фракция приводила к большей МА в обогащенной тромбоцитами плазме; поэтому в дальнейшем использовали только 1-ю фракцию. Исследованы 30 образцов крови, полученных у 17 пациентов. Плазменная концентрация фибриногена варьировала от 0,5 г/л до 8,7 г/л, величина МАбатрокс — от 2,3 до 62,5 мм. Выявлена сильная корреляция между МАбатрокс и плазменной концентрацией фибриногена по Клауссу (r=0,83; р<0,001), а также между МАбатрокс и МА^ (r=0,88; р<0,001). На клинических примерах показано, что исследование с батроксобином отражало концентрацию АФ у больных с гипо- и гиперфибриноге-немией. На определение АФ не влияло количество тромбоцитов крови, в то время как МА^ зависела от количества тромбоцитов крови, завышая уровень FF при тромбоцитозе.
Выводы. МА на тромбоэластограмме, выполненной с гепаринизированной кровью и добавлением батроксобина, коррелирует с плазменной концентрацией фибриногена, определенной методом Клаусса, а также с МА на тромбоэластограмме, выполненной с реактивом Haemonetics для исследования уровня FF, и отражает концентрацию АФ у больных с гипофибри-ногенемией и тромбоцитозом.
Ключевые слова: тромбоэластография; функциональный фибриноген; активный фибриноген; батроксобин; абциксимаб.
Для корреспонденции: Галстян Геннадий Мартинович, доктор мед. наук, зав. отд. реанимации и интенсивной терапии ФГБУ НМИЦ гематологии МЗ РФ, 125167, Москва. E-mail: gengalst@gmail.com.
Для цитирования: Галстян Г.М., Полеводова О.А., Берковский А.Л., Сергеева Е.В., Савченко В.Г. Модифицированный тест с батроксобином для определения активного фибриногена методом тромбоэластографии. Анестезиология и реаниматология. 2018;(3): 86-94. (In Russ.). https://doi.org/10.17116/anaesthesiology201803186
A new method for determining active fibrinogen using thromboelastography
© G.M. GALSTYAN, O.A. POLEVODOVA, A.L. BERKOVSKIY, E.V. SERGEEVA, V.G. SAVCHENKO
'National Research Center for Hematology, Moscow, Russia
We are various methods to evaluate plasma fibrinogen level. Thromboelastography (TEG) allows estimating functional fibrinogen level by Functional Fibrinogen test (Haemonetics). The principle of the Functional Fibrinogen test is based on the inhibition of platelets. We propose the TEG-batroxobin test for valuation of fibrinogen level. In TEG-batroxobin test the platelets are suppressed by heparin, and the formation of fibrin clot is achieved by cleaving of fibrinopeptide A from fibrinogen. The aim of our study was to develop the TEG method for evaluation of active fibrinogen level in blood.
Material and methods. Batroxobin was obtained from the poison of the rattlesnake Bothrops atrox. Two fractions with thrombin-like activity were isolated from batroxobin by chromatography. 30 blood samples were obtained from 17 patients. The fibrinogen concentration (Clauss method), functional fibrinogen levels (TEG, Functional Fibrinogen Reagent, Haemonetics) and active fibrinogen levels (TEG with batroxobin) were estimated.
Results. The plasma concentrations of fibrinogen varied from 0.5 to 8.7 g/l. The values of MAbatrox varied from 2.3 to 62.5 mm and MA in Functional Fibrinogen test varied from 7.6 to 54.5 mm. There were strong correlations between MAbatrox and fibrinogen concentrations (r=0.83; p<0.001), between MAbatrox and MA in Functional Fibrinogen test (r=0.88; p<0.001). The TEG with batroxobin reflected the concentrations of active fibrinogen in patients with hypo- and hyperfibrinogenemia. Conclusion. The TEG with batroxobin can be used for estimating of active fibrinogen levels in in critically ill patients.
Keywords: thromboelastography; functional fibrinogen; active fibrinogen; batroxobin.
For correspondence: Galstyan G.M., MD, PhD, Head of ICU of the National Research Center for Hematology, 125167, Moscow, Russia, E-mail: gengalst@gmail.com
For citation: Galstyan G.M., Polevodova O.A., Berkovskiy A.L., Sergeeva E.V., Savchenko V.G. A new method for determining active fibrinogen using thromboelastography. Anesteziologiya iReanimatologiya. 2018;(3): 86-94. (In Russ.). https://doi.org/10.17116/anaesthesiology201803186
Information about authors:
Galstyan G.M., https://orcid.org/0000-0001-8818-8949 Polevodova O.A., https://orcid.org/0000-0002-7783-5861 Berkovskiy A.L., https://orcid.org/0000-0001-8213-1810 Sergeeva E.V., https://orcid.org/0000-0002-9137-343X Savchenko V.G., https://orcid.org/0000-0001-8188-5557
Acknowledgments: The study had no sponsorship. Received 01.12.2017
Conflict of interests. The authors state the absence of any conflict ofinterests. Accepted 15.03.2018
Фибриноген — это глобулин с молекулярной массой 350 000 D, являющийся растворимым плазменным глико-протеином и представленный двумя идентичными субъединицами; каждая из них содержит 3 пары полипептидных цепочек (Aa, BP, y). Пространственная структура молекулы фибриногена состоит из центрального Е-домена и 2 периферических D-доменов [1]. Полипептидные а- и в-цепи формируют глобулярные структуры — фибринопептиды А и В, которые закрывают комплементарные участки в фибриногене и не позволяют этой молекуле полимеризовать-ся [1]. Фибриноген превращается в фибрин под действием тромбина, который отщепляет от фибриногена фибрино-пептиды А и В, составляющие лишь 3% его белковой массы. Затем происходит спонтанная полимеризация образовавшихся мономеров фибрина в сгустки, которые стабилизируются ХШа фактором свертывающей системы крови в прочный полимер фибрин.
Известны различные методы определения уровня фибриногена [2]. В клинической практике широко распространено определение уровня фибриногена методом Кла-усса, основанное на установлении времени образования сгустка при добавлении высокой концентрации тромбина к разбавленной в 10—20 раз плазме. Для выполнения теста используют коагулометры, при этом учитывают, что логарифм времени образования сгустка обратно пропорционален логарифму концентрации фибриногена. Калибровочная кривая показывает укорочение времени свертывания при увеличении концентрации фибриногена [1].
Функциональную оценку полимеризации фибрина можно дать также с помощью тромбоэластографии (ТЭГ) или ротационной тромбоэластометрии (ROTEM) [3, 4]. В обоих этих методах максимальная амплитуда кривой, отражающая эластичность и прочность образовавшего сгустка Maximum Amplitude (MA) в ТЭГ или Maximum Clot Firmness (MCF) в ROTEM, определяется функциями тромбоцитов и фибриногена [5]. Подавление функции тромбоцитов с помощью цитохалазина D, являющегося ингибитором реорганизации цитоскелета в тесте FIBTEM, или антагониста рецепторов GPIIb/IIIa препарата абциксимаб (ReoPro) в тесте «Функциональный фибриноген» на ТЭГ, позволяет вычленить из МА «вклад» тромбоцитов и оценить величину FF [6—10]. Концентрация фибриногена в плазме коррелирует (r=0,9) с уровнем FF [9—12]. В тесте FIBTEM показатель MCF, равный 7 мм, ассоциируется с уровнем фибриногена 2 г/л, а MCF 6 мм — с 0,9 г/л [12].
В то же время в ряде случаев результаты измерения плазменной концентрации фибриногена и уровня FF могут разниться [9, 11]. Сопоставлены результаты определе-
ния концентрации фибриногена с применением метода Клаусса и теста FIBTEM у 36 больных, которым проведено хирургическое лечение. Несмотря на корреляцию между методами, при определении уровня фибриногена методом Клаусса ни в одном случае не выявлено показаний к коррекции гипофибриногенемии (концентрация фибриногена 1 г/л). Вместе с тем по данным теста Б1ВТЕМ у 44% больных такие показания обнаружены [11]. Даны несколько объяснений выявленному феномену: во-первых, образование сгустка нарушается раньше, чем происходит выраженное снижение плазменной концентрации фибриногена; во-вторых, концентрация фибриногена 1 г/л, возможно, является заниженной величиной для начала коррекции гипофибриногенемии; в-третьих, на определение уровня фибриногена могут влиять переливаемые во время операции растворы. При переливании коллоидных растворов нарушается процесс полимеризации фибрина, в результате чего уровень фибриногена в плазме, определенный методом Клаусса, может оказаться завышенным [13, 14]. При разбавлении гидроксиэтилкрахмалом образцов плазмы, полученных от здоровых волонтеров, выяснено, что дилюция плазмы на 30% приводит к завышению уровня фибриногена, определяемого фиброоптическим методом, на 50%, а при дилюции на 50% это завышение достигает уже 100% [13]. На ошибочное определение концентрации фибриногена большее влияние оказывает концентрация раствора ги-дроксиэтилкрахмала, чем размер его молекул [14]. Метод определения фибриногена по Клауссу чувствителен также к гипо-, дис- и гиперфибриногенемии, продуктам деградации фибрина, которые влияют на процесс полимеризации мономеров фибрина и могут быть причиной ложных низких результатов [1]. Поэтому в европейских руководствах по лечению коагулопатии при массивной травме рекомендуется принимать решение о коррекции гипофибриноге-немии при снижении концентрации фибриногена плазмы ниже 1,5—2 г/л (уровень рекомендаций 1С) и ориентироваться не только на концентрацию фибриногена в плазме, но и на величину FF, определяемую по данным ТЭГ (уровень рекомендаций 2С) [15].
Еще один вариант подхода к определению уровня FF разработан В.С. Афончиковым [16], который предложил оценивать уровень фибриногена по величине МА ТЭГ, выполненной с обедненной тромбоцитами плазмой. Недостатком данного метода является то, что для получения обедненной тромбоцитами плазмы необходимо центрифугировать кровь в определенных режимах, т.е. требуется лабораторное оборудование, и тест не может быть выполнен у постели больного. Кроме того, полученная после
центрифугирования обедненная тромбоцитами плазма никогда не является полностью свободной от тромбоцитов, а их количество в ней может варьировать. Следовательно, и максимальная амплитуда ТЭГ обедненной тромбоцитами плазмы будет варьировать и зависеть от количества оставшихся в ней тромбоцитов, неточно отражая уровень FF.
Цель исследования — разработать метод определения уровня активного фибриногена (АФ) с помощью ТЭГ, не подверженный влиянию количества тромбоцитов крови и гепаринотерапии, а также адаптированный для выполнения у постели больного.
Материал и методы
В соответствии с поставленными задачами исследование состояло из двух этапов: 1-й этап — разработка нового реактива, который бы индуцировал образование фибрина из фибриногена, не активируя при этом тромбоциты; 2-й этап — сравнение полученных с помощью нового реактива результатов определения фибриногена в крови у больных с результатами известных методов — метода Клаусса и ТЭГ.
В качестве реактива, индуцирующего образование фибрина, выбран батроксобин — фермент из яда гремучей змеи Bothrops atrox, обитающей в Южной и Центральной Америке. Батроксобин — тромбиноподобная протеаза, вызывающая переход фибриногена в фибрин путем отщепления от фибриногена фибринопептида А, что отличает ее от действия тромбина, который, кроме фибринопептида А, отщепляет от фибриногена еще и фибринопептид В. Батроксобин не подавляется антитромбином III и гепарином, поэтому его можно использовать для оценки полимеризации мономеров фибрина в присутствии гепарина. Поскольку на определение концентрации АФ в цельной крови оказывает влияние возможная активация тромбоцитов, одной из задач исследования было получить тромбиноподобный фермент из яда гремучей змеи Bothrops atrox, который одновременно не активировал бы тромбоциты.
С этой целью подобраны условия хроматографии, которые заключались в следующем: 50 мг яда растворяли в буферном растворе состава 50 мМ трис-HCl, рН 7,4 и наносили на колонну 1,6^15 см с анионообменным сорбентом DEAE-Sepharose Fast Flow («Sigma-Aldrich», Германия). Сорбент промывали стартовым буфером и затем связанный с сорбентом белок элюировали градиентом ионной силы натрия хлорида (градиент ионной силы от 0 до 100 мМ). В выходящих фракциях (по 5 мл) автоматически записывалась концентрация белка, а также определяли время свертывания с раствором фибриногена: чем короче было время свертывания, тем выше активность тромбинопо-добного фермента в выходящих с колонны фракциях. Фракции фермента собирали отдельно, стабилизировали, добавляя бычий сывороточный альбумин до концентрации 5 мг/мл, разливали по флаконам и лиофилизировали. Исследовали влияние обеих фракций батрокобсина на тромбоциты в тесте ТЭГ. Для этого из пробы цельной гепаринизированной крови путем центрифугирования получали обедненную и обогащенную тромбоцитами плазму, согласно общепринятым методам [17]. С полученными образцами обедненной тромбоцитами плазмы и обогащенной тромбоцитами плазмы выполняли ТЭГ с каждой из фракций батроксобина на тромбоэластографе TEG 5000 («Hae-moscope Corporation», США). Для этого к 340 мкл каждого образца плазмы, полученной из гепаринизированной кро-
ви, добавляли по 10 мкл раствора батроксобина активностью 5 МЕ/мл. Оценивали МА тромбоэластограммы.
Кровь у больных получали путем венепункции одной из периферических вен и собирали в пробирки S-Monovette (SARSTEDT, Германия) с 3,2% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9 (1 часть раствора цитрата натрия, 9 частей крови) и пробирки S-Monovette с литий-гепарином (концентрация гепарина 10—30 ед/мл крови).
Концентрацию фибриногена в плазме цитратной крови определяли методом Клаусса на коагулометре Sysmex CA-620 («Sysmex», Япония) c помощью реактивов компании «Siemens» (Германия).
Уровень FF исследовали на TEG 5000. В кювету для ТЭГ вносили 20 мкл 0,2 М раствора кальция хлорида. Затем 500 мкл цитратной крови добавляли во флакон с реактивом Functional Fibrinogen Reagent («Haemonetics Corporation», США). После перемешивания из этого флакона отбирали 340 мкл крови и вносили в кювету, в которой уже находился раствор кальция хлорида. Выполняли ТЭГ. По окончании теста определяли МА для FF (MAFF).
ТЭГ цельной гепаринизированной крови выполняли на TEG 5000. Для этого 340 мкл гепаринизированной крови вносили в кювету, в которую предварительно добавляли 10 мкл раствора батроксобина, полученного описанным выше способом, с активностью 5 МЕ/мл. Определяли МАБАТРОКС на ТЭГ.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием стандартных компьютерных программ Microsoft Excel 2007, BioStat. Коэффициенты корреляции рассчитывали с помощью линейного регрессионного анализа с применением метода наименьших квадратов. Систематическую ошибку (bias) рассчитывали как среднее различий между двумя методами в определении показателя. Пределы соглашения (Limits of agreement — LOA) между двумя методами для 95% доверительного интервала (ДИ) рассчитывали как bias ± 2 стандартных отклонения. Сравнение систематической ошибки и LOA между двумя методами проводили с помощью метода Блэнда—Альтма-на [18]. Процентная ошибка более 30% по методу Critchley и Critchley [19] свидетельствует, что даже несмотря на корреляцию, оба метода определяют не одинаковый параметр.
Результаты
Выделение батроксобина
В результате хроматографической очистки тромбиноподобная активность батроксобина распределялась по двум фракциям; 1-я фракция элюировалась с колонны при низкой концентрации соли, а 2-я — при более высокой концентрации (рис. 1).
Исследовано в тесте ТЭГ влияние каждой из фракций на функцию тромбоцитов. Для этого выполнили ТЭГ с обедненной и обогащенной тромбоцитами плазмой для каждой из фракций. Установлено, что 1-я фракция батроксобина не оказывала существенного влияния на максимальную амплитуду ТЭГ в образцах обедненной и обогащенной тромбоцитами плазмы (рис. 2).
ТЭГ со второй фракцией батроксобина характеризовалась значительно большей МА в обогащенной тромбоцитами плазме, чем в обедненной тромбоцитами плазме (рис. 3), т.е. 2-я фракция батроксобина стимулировала агрегацию тромбоцитов; поэтому для дальнейших исследований использовали только 1-ю фракцию батроксобина.
Рис. 1. Результаты хроматографической очистки Bothrops atrox venom.
Рис. 2. Результаты ТЭГ, выполненной с обедненной (а) и обогащенной (б) тромбоцитами плазмой и с 1-й фракцией бактроксобина.
Рис. 3. Результаты ТЭГ, выполненной с обедненной (а) и обогащенной (б) тромбоцитами плазмой и со 2-й фракцией бактроксобина.
б
а
б
а
Рис. 4. Корреляция между концентрацией фибриногена в плазме, определенной методом Клаусса, и МАБАТРОКС.
Здесь и на рис. 5—8, 10, 12: МАбатрокс — максимальная амплитуда при определении активного фибриногена методом ТЭГ с ба-троксобином и гепаринизированной кровью.
Рис. 5. Корреляция между MAFF и МАбатрокс.
Здесь и на рис. 6, 7, 11: MAFF — максимальная амплитуда при определении уровня функционального фибриногена методом ТЭГ с реактивом Functional Fibrinogen Reagent.
Сравнение результатов определения концентрации фибриногена с применением теста с батроксобином и метода Клаусса
Исследованы 30 образцов крови, полученных у 17 больных. Концентрация фибриногена в плазме цитратной крови, определенная методом Клаусса, варьировала от 0,5 до 8,7 г/л. Величина МАБАТРОКС на ТЭГ в пробе с батроксобином и гепаринизированной кровью колебалась в пределах от 2,3 до 62,5 мм и коррелировала с концентрацией фибриногена (/=0,83; р<0,001) (рис. 4), что позволяет связать концентрацию АФ с МА уравнением:
АФ,
, = 0,1153 х МАБ
, + 0,5903,
где АФБ
Коэффициент корреляции между MAFF и МАб
это расчетная концентрация АФ (в г/л) в
тесте с батроксобином, МАбатрокс — МА на ТЭГ с гепаринизированной кровью и батроксобином (в мм); 0,1153 и 0,5903 — коэффициенты уравнения регрессии (коэффициенты пересчета).
Концентрация АФ в пробе с батроксобином, рассчитанная согласно уравнению, колебалась от 0,8 до 7,8 г/л, т.е. значения были близки к концентрации фибриногена по Клауссу.
Сравнение МАГГ и МАбатрокс, определенных
с помощью ТЭГ в тестах на ГГ и АФ
Исследованы 30 образцов крови, полученных у 17 больных с онкогематологическими заболеваниями. Величина МАБАТРОКС колебалась от 2,3 до 62,5 мм; величина МАРР — от 7,6 до 54,5 мм. На рис. 5 показана корреляция между МА и МА .
^"^рр БАТРОКС
Рис. 6. Сравнение МАРР и МАбатрокс по методу Бленда— Альтмана.
Пунктирными линиями представлены средняя разница МАрр и МА а также среднее разницы±1,96 стандартного отклонения.
Больная З., 29 лет, госпитализирована в связи с впервые выявленным острым промиелоцитарным лейкозом. У больной имелся выраженный геморрагический синдром в виде гематом после инъекций, спонтанных гематом на коже груди, нижних конечностей. При поступлении плазменная концентрация фибриногена, определенная методом Клаусса, составила 1,1 г/л. Выполнен тест для определения уровня FF на TEG 5000 с реактивом Functional Fibrinogen Reagent с цитратной кровью. MAFF составила 13,5 мм, что соответствовало уровню FF (FLEV) 2,5 г/л (рис. 7).
Одновременно выполняли ТЭГ c батроксобином и ге-
, со- паринизированной кровью. МАб
, составила 3,6 мм
ставил 0,88 (р<0,001). При сравнении по методу Блэнда— Альтмана оба показателя также соответствовали друг другу (рис. 6).
Клинический пример 1. Сравнение концентрации фибриногена, определенной методом Клаусса, с концентрациями рр и АФ, определенными двумя методами с помощью ТЭГ у больной с гипофибриногенемией до и после коррекции
(рис. 8), что, согласно полученной формуле, соответствовало концентрации АФ 1,0 г/л.
Больной выполнена коррекция гипофибриногенемии трансфузиями 40 доз криопреципитата. При повторном исследовании крови плазменная концентрация фибриногена, определенная методом Клаусса, составила 3,7 г/л. При выполнении пробы на FF с реактивом Functional Fibrinogen
Qtratid functional fibnnogfn FLEV- 2,5 фЛ Проба: 12.09.2017 14:32-15:43
M / 10 «и T 1
R It A/lQdf MA PMA С EPI A CI or M
rtw % mm %
1,0 Ht A W.l 13,5 -О" 0.« OA 15.0 0.0
10~îi 0.Ï-1,?
Рис. 7. Результаты ТЭГ с реактивом для определения уровня FF у больной З. с гипофибриногенемией.
МАрр — 13,5 мм, расчетный уровень ББ (FLEV) —2,5 г/л. ТЭГ — тромбоэластография; ББ — функциональный фибриноген; FLEV — расчетный уровень функционального фибриногена.
Рис. 8. Результаты ТЭГ с гепаринизированной кровью и батроксобином у больной З. с гипофибриногенемией.
МАб АФ
, — 3,6 мм, расчетная концентрация АФ (АФБ
С) — 1 г/л. ТЭГ — тромбоэластография; АФ — активный фибриноген;
, — активный фибриноген, определяемый методом ТЭГ с батроксобином и гепаринизированной кровью.
Reagent, как описано выше, MA^ составила 28,8 мм, что соответствовала расчетному уровню FF (FLEV) 5,3 г/л (рис. 9). При выполнении ТЭГ с гепаринизированной кровью и рас-
твором батроксобина, как описано выше, МАБ
1333Т09/л, плазменная концентрация фибриногена по методу Клаусса — 1,1 г/л. По результатам ТЭГ с реактивом Functional Fibrinogen Reagent для исследования уровня FF
, соста- MAff составила 34 мм, что соответствовало расчетному
вила 22,1 мм (рис. 10), что соответствовало расчетной концентрации АФ 3,1 г/л.
Клинический пример 2. Сравнение концентрации фибриногена, определенной методом Клаусса с концентрациями ББ и АФ, определенными двумя методами с помощью ТЭГ у больной с тромбоцитозом. Больная А., 21 год, установлена талассемия. В 2013 г. выполнена спленэкто-мия. С 2013 г. в клиническом анализе крови у больной выявляется тромбоцитоз. На момент исследования концентрация тромбоцитов в периферической крови составила
уровню ББ (FLEV) 6,3 г/л (рис. 11). Выполнили ТЭГ с цельной гепаринизированной кровью и батроксобином. МАба-ТРОКС составила 6,2 мм (рис. 12), что соответствовало расчетной концентрации АФ 1,3 г/л.
Обсуждение
Батроксобин издавна используют для исследования фибриногена в клоттинговом тесте «батроксобино-вое (рептилазное) время». Это тест, в котором определя-
ют время образования фибринового сгустка в цитратной плазме под действием батроксобина. Батроксобиновое время уменьшается при гиперфибриногенемии и удлиняется при снижении содержания фибриногена в крови и некоторых дисфибриногенемиях, а также при гиперфи-бринолизе и наличии в кровотоке большого количества продуктов деградации фибрина, затрудняющих полимеризацию мономеров фибрина [1]. При исследовании ба-троксобинового времени применяют плазму крови, поэтому количество тромбоцитов крови не оказывает существенного влияния на результаты теста. В отличие от теста на батроксобиновое время в ТЭГ с батроксобином мы использовали цельную кровь и оценивали величину МА, на которую влияют функции как фибриногена, так и тромбоцитов крови. В этих условиях принципиальным
было выделить фракцию батроксобина, которая стимулировала бы образование из фибриногена фибрина, не влияя при этом на функцию тромбоцитов. Нам удалось выделить фракцию батроксобина, не влияющую на функцию тромбоцитов.
В отличие от классического теста на FF, выполняемого с цитратной плазмой, тест с батроксобином выполняется с гепарином, который не позволяет активировать тромбоциты, с одной стороны, а с другой — на результаты теста не влияет наличие гепарина в крови у пациента; этот тест можно выполнять больным, уже получающим гепарин. Для того чтобы нейтрализовать гепарин, тест с реактивами Functional Fibrinogen Reagent рекомендуется выполнять с гепариназой, а в тесте FIBTEM гепариназа исходно присутствует в стандартном реактиве.
Рис. 10. Результаты ТЭГ с гепаринизированной кровью и батроксобином у больной З. после переливания 40 доз кри-опреципитата.
МАС.
22,1 мм, расчетная концентрация АФ — 3,1 г/л. ТЭГ — тромбоэластография; АФ — активный фибриноген.
Рис. 9. Результаты ТЭГ с реактивом для определения уровня РР у больной З. после переливания 40 доз криопреципи-тата.
МА — 28,8 мм, расчетный уровень рр (FLEV) — 5,53 г/л. ТЭГ — тромбоэластография; МА — максимальная амплитуда; рр — функциональный фибриноген; FLEV — расчетный уровень функционального фибриногена.
Рис. 11. Результаты ТЭГ с реактивом для определения уровня FF у больной А. с тромбоцитозом.
МАрр —34,4 мм, что соответствовало расчетному уровню FF (FLEV) 6,3 г/л. ТЭГ — тромбоэластография; FF — функциональный фибриноген; FLEV — расчетный уровень функционального фибриногена.
Рис. 12. Результаты ТЭГ с гепаринизированной кровью и батроксобином у больной А. с тромбоцитозом.
МА
, — 6,2 мм, расчетный уровень АФ — 1,3 г/л. ТЭГ — тромбоэластография; АФ — активный фибриноген.
Как показали наши исследования, МАбатрокс хорошо коррелирует с концентрацией фибриногена, определенной методом Клаусса, а также с MAFF, полученной с реактивом Functional Fibrinogen Reagent. В то же время известно, что FF, определенный с помощью ТЭГ, может завышать уровень фибриногена [20]. Возможной причиной завышения уровня фибриногена является то, что при этом методе не всегда удается полностью ингибировать тромбоциты; это было показано при сравнении его с методом ТЭГ, при котором использовали другой ингибитор тромбоцитов. Причем это завышение тем выше, чем больше уровень тромбоцитов в крови. Поэтому предложена модификация теста FIBTEM или FIBTEM Plus [21]. В тесте FIBTEM Plus для лучшего подавления функции тромбоцитов наряду с цито-
халазином D добавляется ингибитор тромбоцитарного гли-копротеина IIb/IIIa — препарат тирофибан.
В нашем исследовании наибольшие расхождения между плазменной концентрацией фибриногена, определенной методом Клаусса, и уровнем FF, по данным ТЭГ, выявлены у больных с тромбоцитозом, что не является неожиданным. В случаях выраженного тромбоцитоза стандартная доза аб-циксимаба может не полностью ингибировать тромбоциты [21] и следовательно сохраняется их вклад в МА ТЭГ, поэтому ее величина будет завышенной. При определении уровня FF в гепаринизированной крови в тесте с батрок-собином тромбоциты вообще не участвуют в формирования сгустка и МА, следовательно их количество в крови не влияет на определяемую концентрацию FF.
Заключение
Максимальная амплитуда на тромбоэластограмме, выполненной с гепаринизированной кровью и добавлением батроксобина, коррелирует с плазменной концентрацией фибриногена, определенной методом Клаусса, а также с максимальной амплитудой на тромбоэластограмме, выполненной с реактивом Functional Fibrinogen Reagent, для исследования уровня функционального фибриногена и от-
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Долгов В.В., Свирин П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. М.: Триада; 2005. [Dolgov VV, Svirin PV. Laboratory diagnosis of hemostatic disturbances [Laboratornaya diagnostika narusheniy gemo-staza]. Moscow: Triada; 2005. (In Russ.)].
2. Галстян Г.М., Берковский А.Л., Журавлев В.В., Полохов Д.М., Савченко В.Г. Нужны ли в России препараты фибриногена? Анестезиология и реаниматология. 2014; 59(3): 49-59. [Galstyan GM, Berkovskiy AL, Zhuravlev VV, Polokhov DM, Savchenko VG. Whether fibrinogen concentrates are necessary in Russia? Anesteziologiya i reanimatologiya. 2014;59(3):49-59. (In Russ.)].
3. Fenger-Eriksen C, Ingerslev J, S0rensen B. Fibrinogen concentrate — a potential universal hemostatic agent. Expert Opin Biol Ther. 2009;9(10):1325-1333.
4. Schlimp CJ, Voelckel W, Inaba K, Maegele M, Ponschab M, Schochl H. Estimation of plasma fibrinogen levels based on hemoglobin, base excess and ISS upon emergency room admission. Crit Care. 2013;17(4):R137.
5. Петриков С.С., Картавенко В.И., Бадыгов С.А., Клычникова Е.В., Рак К.Г. Коррекция нарушений гемостаза при геморрагическом шоке. Анестезиология и реаниматология. 2015; 60(4): 61-4. [Petrikov SS, Kartaven-ko VI, Badygov SA, Klychnikova EV, Rak KG. Correction of hemostasis disorders with hemorrhagic shock. Anesteziologiya i reanimatologiya. 2015;60(4):61-64. (In Russ.)].
6. Solomon C, Cadamuro J, Ziegler B, Schochl H, Varvenne M, S0rensen B, et al. A comparison of fibrinogen measurement methods with fibrin clot elasticity assessed by thromboelastometry, before and after administration of fibrinogen concentrate in cardiac surgery patients. Transfusion. 2011;51(8):1695-1706.
7. da Luz LT, Nascimento B, Rizoli S. Thrombelastography (TEGW): practical considerations on its clinical use in trauma resuscitation. Scand J Trauma Resusc Emerg Med. 2013;21:29.
8. Harr JN, Moore EE, Ghasabyan A, Chin TL, Sauaia A, Banerjee A, et al. Functional fibrinogen assay indicates that fibrinogen is critical in correcting abnormal clot strength following trauma. Shock. 2013;39(1):45-49.
9. Haas T, Spielmann N, Mauch J, Madjdpour C, Speer O, Schmugge M, et al. Comparison of thromboelastometry (ROTEM) with standard plasmatic coagulation testing in paediatric surgery. Br J Anaesth. 2012;108(1):36-41.
10. Буланов А.Ю., Яцков К.В., Буланова Е.Л., Доброва Н.В. Тромбоэластография: Клиническая значимость теста на функциональный фибриноген. Вестник интенсивной терапии. 2017; (1): 5-11. [Bulanov AYu, Yatskov KV, Bulanova EL, Dobrova NV. Thromboelastagraphy: clinical sig-
ражает концентрацию активного фибриногена у больных с гипофибриногенемией и тромбоцитозом. Применение отечественных реагентов для определения активного фибриногена с помощью тромбоэластографии позволит широко использовать этот метод в России.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
nificance of the test for functional fibrinogen. Vestnik intensivnoy terapii. 2017;(1):5-11. (In Russ.)].
11. Urwyler N, Theiler L, Hirschberg M, Kleine-Brueggeney M, Colucci G, Greif R. Standard vs. point-of-care measurement of fibrinogen: potential impact on clinical decisions. Minerva Anestesiol. 2012;78:550-555.
12. Rugeri L, Levrat A, David JS, Delecroix E, Floccard B, Gros A, et al. Diagnosis of early coagulation abnormalities in trauma patients by rotation thrombelastography. J Thromb Haemost. 2007;5(2):289-295.
13. Adam S, Karger R, Kretschmer V. Photo-optical methods can lead to clinically relevant overestimation of fibrinogen concentration in plasma diluted with hydroxyethyl starch. Clin Appl Thromb Hemost. 2010; 16(4):461-471.
14. Adam S, Karger R, Kretschmer V. Influence of different hydroxyethyl starch (HES) formulations on fibrinogen measurement in HES-diluted plasma. Clin Appl Thromb Hemost. 2010;16(4):454-460.
15. Rossaint R, Bouillon B, Cerny V, Coats TJ, Duranteau J, Fernandez-Mon-dejar E, et al. The European guideline on management of major bleeding and coagulopathy following trauma: fourth edition. Crit Care. 2016;20:100.
16. Афончиков В.С., Кырнышев А.Г., Шах Б.Н., Лапшин В.Н., Смирнов Д.Б., Теплов В.М. Способ лечения метаболического ацидоза при тяжелой сочетанной травме. Патент РФ№ 2538655C2; 2014. [Afon-chikov VS, Kyrnyshev AG, Shakh BN, Lapshin VN, Smirnov DB, Teplov VM. A method for assessing the state of the blood coagulation system in critically ill patients. Patent RF №2538655C2; 2014.]
17. Perez AG, Lana JF, Rodrigues AA, Luzo AC, Belangero WD, Santana MH. Relevant aspects of centrifugation step in the preparation of platelet-rich plasma. ISRNHematology. 2014;2014:176060.
18. Bland JM, Altman DG. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet. 1986;1(8476):307-310.
19. Critchley LA, Critchley JA. A metaanalysis of studies using bias and precision statistics to compare cardiac output measurement techniques. J Clin Monit Comput. 1999;15(2):85-91.
20. Agren A, Wikman AT, Ostlund A, Edgren G. TEG functional fibrinogen analysis may overestimate fibrinogen levels. Anesth Analg. 2014;118(5):933-935.
21. Solomon C, Baryshnikova E, Schlimp CJ, Schochl H, Asmis LM, Ranucci M. FIBTEM PLUS provides an improved thromboelastometry test for measurement of fibrin-based clot quality in cardiac surgery patients. Anesth Analg. 2013;117(5):1054-1062.
Поступила 01.12.2017 Принята к печати 15.03.2018
