CC BY
56
DOI: 10.23868/201707029
модификация биодеградируемого волокнистого матрикса эпидермальным фактором роста при эмульсионном электроформовании для стимулирования пролиферации эпителиальных клеток
Т.Х. Тенчурин1, А.В. Люндуп 2, А.Г. Демченко 2, М.Е. Крашенинников 2, М.В. Балясин 2, И.Д. Клабуков 2, А.Д. Шепелев 1, В.Г. Мамагулашвили 1, А.С. Орехов 1, С.Н. Чвалун1, Т.Г. Дюжева 2
1 Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва, Россия
2 Институт регенеративной медицины Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова, Москва, Россия
Modification of biodegradable fibrous scaffolds with Epidermal Growth Factor by emulsion electrospinning for promotion of epithelial cells proliferation
T.H. Tenchurin 1, A.V. Lyundup 2, A.G. Demchenko 2, M.E. Krasheninnikov 2, M.V. Balyasin 2,I.D. Klabukov 2, A.D. Shepelev1, V.G. Mamagulashvili1, A.S. Orehov1, S.N. Chvalun 1, T.G. Dyuzheva 2
1 National Research Center "Kurchatov Institute", Moscow, Russia
2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Institute for regenerative medicine, Moscow, Russia
Обеспечение физиологически релевантного клеточного микроокружения является серьезной проблемой при создании тканеинженерных конструкций на основе биосовместимых и биодеградируемых полимерных материалов. Цель исследования — разработка методики функционализации каркасов, полученных методом эмульсионного электроформования, путем введения в структуру волокна эпидер-мального фактора роста (EGF) и оценка влияния модифицированных материалов на пролиферацию эпителиальных клеток in vitro. Эмульсионным электроформованием получены функционализированные EGF волокнистые матрик-сы из поликапролактона. Методами иммуноферментного и биосенсорного анализа проведена оценка выхода EGF из модифицированных матриксов и определена степень его влияния на пролиферацию клеточной линии MCF7.
Ключевые слова: тканевая инженерия, клеточная пролиферация, биодеградируемые материалы, внеклеточный матрикс, поликапролактон, электроформование, EGF, GFP, эпителиальные клетки.
Supporting of a physiologically relevant cellular microenvironment is currently a grand challenge in the design of tissue-engineering grafts based on biocompatible and biodegradable polymeric materials. The aim of this research was to develop a new technique of a fibrous polycaprolactone-based scaffold modification with epidermal growth factor (EGF) and assessment of its effect on scaffold properties and prolifera-tive activity of epithelial cells in vitro. Fibrous scaffolds from EGF-functionalized polycaprolactone has received by the emulsion electrospinning method. Prolonged yield of EGF upon the material destruction and its biological effect on the MCF7 cell line proliferation have been estimated using ELISA and iCEL-Ligence real-time cell analysis for respectively.
Keywords: tissue engineering, cell proliferation, biodegradable plastics, polycaprolactone, extracellular matrix, electrospinning, EGF, GFP, epithelial cells.
введение
Использование биосовместимых полимерных материалов в качестве имплантатов и каркасов для тканеинженерных конструкций отчасти неэффективно, поскольку не обеспечивает физиологически релевантное клеточное микроокружение, несмотря на достижение необходимой механической прочности. Дискуссионным остается вопрос о преимуществах использования естественных материалов (полученных методами децеллюляризации) по сравнению с синтетическими [1], подобранными по механическим свойствам и биосовместимости. Повысить способность синтетического материала встраиваться в организм можно за счет его модификации биохимическими методами [2]. В настоящее время модификация каркасов для тканеинженерных конструкций проводится с использованием иммобилизованных на поверхностях или инкорпорированных в структуру волокна ростовых факторов, которые создают условия для активизации регенерации тканей [3—8].
Исследование процесса взаимодействия клеток с окружающими их структурами привело к развитию методов изготовления каркасов, наделенных строением и функцией биологических тканей из
e-mail: [email protected]
биосовместимых полимеров синтетического и природного происхождения. В организме пространственное строение органа представлено внеклеточным матриксом, состоящим в основном из волокон коллагена и аморфного вещества. Для воссоздания подобной структуры целесообразно использовать метод электроформования, позволяющий получать волокнистую сетку (каркас) из нано- и микроволокон [9, 10].
Целью настоящей работы являлась разработка методики функционализации волоконных матриксов, полученных методом эмульсионного электроформования, путем введения в структуру волокон эпи-дермального фактора роста (EGF) и оценка влияния модифицированных матриксов на пролиферацию эпителиальных клеток in vitro.
Материал и методы
Биологически активное соединение (БАС). Для модификации матрикса был выбран EGF (Invitrogen, США) — белок, стимулирующий пролиферацию и дифференцировку эпителиальных клеток, который входит в состав специальных питательных сред
для культивирования эпителиоцитов из разных источников [10]. Для визуализации волокон в конфокальной микроскопии использовали зеленый флуоресцентный белок (GFP) (ИБХ РАН, Россия).
Расчет необходимой концентрации EGF. По спецификации производителя концентрация EGF, необходимая для активации клеток, составляла ED50 = 250 пг/мл. Для 100% активации клеток в культуре была выбрана концентрация ED50x3 = 750 пг/мл.
Методика модификации волокнистых материалов. Для создания каркасов применяли ПКЛ 80 кДа (Sigma Aldrich, США), который ранее был проверен на цитосовместимость при использовании клеток линий 3T3/NIH и MCF7 [11].
Для приготовления формовочного раствора, содержащего GFP или EGF, необходимо сначала получить относительно устойчивую смесь двух несме-шивающихся жидкостей: хлороформа и фосфатного буфера (PBS). После смешивания время жизни такой системы (эмульсии) будет невелико [3, 12, 13]. Поэтому для повышения стабильности эмульсии использовали поверхностно-активное вещество (ПАВ) биосовместимый плюроник F-127 (Pluronic F-127, Sigma-Aldrich, США). Однородную эмульсию получали путем перемешивания хлороформа и PBS, содержащего EGF или GFP, на магнитной мешалке в течение 24 ч. при максимальной интенсивности (1000 об/мин). Дополнительное диспергирование эмульсии проводили в ультразвуковой ванне S40 Elmasonic (Singen, Германия) с использованием ледяной бани в течение 15 мин. На стадиях механического и ультразвукового диспергирования для определения содержания активной формы EGF из эмульсии отбирали пробы, маркированные B1 и В2, соответственно. После чего в приготовленной эмульсии растворяли ПКЛ таким образом, чтобы соотношение между ПКЛ и EGF составило 1 г/5500 нг. При флуоресцентном маркировании волокон использовали соотношение между ПКЛ и GFP 1 г/160 нг. В качестве отрицательного контроля при исследовании биологического эффекта in vitro были изготовлены две серии контрольных образцов: первые (К.1) имели в своем составе ПАВ, но не содержали БАС; вторые (К.2) не имели в своем составе ни ПАВ, ни БАС. Состав формовочного раствора, используемого для получения модифицированных матриц, представлен в таблице.
Электроформование образцов. Экспериментальные образцы изготавливали на лабораторной одно-капиллярной установке, обеспечивающей устойчивый во времени процесс получения волокон. Формование образцов проводили при напряжении 22 кВ и объемном расходе формовочного раствора 6 мл/ч на вращающийся металлический цилиндр (20 об/мин) диаметром 4,3 мм, расстояние между дозирующим капилляром и приемным электродом составляло 30 см. После изготовления все образцы вакуумировались при разрежении 1 мбар в течение 1 сут. Полученные матриксы были стерилизованы гамма-излучением (гамма-облучательная установка
ГУТ-200М, Курчатовский институт) в дозе 15 кГр в контейнерах «Клинипак».
Определение размера частиц дисперсной фазы в эмульсии. Измерение дисперсности эмульсий проводили методом динамического рассеяния света на анализаторе размера наночастиц и дзета потенциала Malvern Zetasizer Nano ZSP (Malvern Instruments, Великобритания).
Измерение контактных углов смачивания. Измерение краевых углов смачивания биосовместимых нетканых материалов проводилось с помощью системы анализа формы капли DSA 30E (Krüss GmbH, Германия).
Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Морфологию поверхности нетканых волокнистых материалов изучали с помощью сканирующего электронно-ионного микроскопа Versa 3D DualBeam (FEI, США) в режиме высокого вакуума с использованием ICE-детектора вторичных электронов. Для определения среднего диаметра волокна измеряли не менее 100 волокон с помощью программы Scope Photo Image Software (ScopeTek, Китай).
Культуры клеток. Для тестирования матриксных свойств была выбрана клеточная линия MCF7 (Российская коллекция клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН, Санкт-Петербург) — эпителиальная линия опухолевых клеток протока молочной железы человека, одна из наиболее часто используемых в исследованиях линий клеток с характеристиками дифференцированного эпителия, которая ранее показала свою адекватность как модельная культура для заселения искусственных каркасов [14]. Клетки культивировали в стандартных условиях в СО2-инкубаторе с концентрацией углекислого газа 5%, атмосферного воздуха 95% и с повышенной влажностью. Состав полной питательной среды: DMEM/F12 (Invitrogen, США), содержащей 10% телячьей фетальной сыворотки FBS Defined (HyClone, США) и 1% пенициллина/ стрептомицина (Invitrogen, США). Замену питательной среды осуществляли каждые 3 сут.
Микроскопия. Микрофотографии волокон, содержащих в своем составе флуоресцентные белки, получали с помощью микроскопа Axio Imager 2 (Carl Zeiss, Швейцария) с модулем для флуоресцентного анализа.
Иммуноферментный анализ выхода EGF. Образцы каркасов, массой от 1 до 1,7 мг, помещали в лунки планшета с 1 мл среды DMEM (без сыворотки), содержащей 0,1% бычьего сывороточного альбумина, инкубировали от 2 до 77 сут., после чего отбирали 1 мл раствора и оценивали выход EGF из матрикса иммуноферментным «сэндвич» методом (ИФА) с использованием моноклональ-ных антител к EGF (клон C6, ВНЦМДЛ, Россия). Оптическую плотность измеряли при 450 нм на спектрофотометре Multiskan FC Microplate Photometer (Thermo Scientific, США). Инструментальная погрешность измерений составляла 0,001 единицы оптической плотности в соответствии с паспортом.
Таблица. Состав формовочного раствора для получения волокон
ХФ
ПКЛ
F-127
PBS с белком
Содержание компонентов, масс %
89,
0,6
Пробы B1 и B2 объемом 0,5 мл, взятые при изготовлении эмульсии для оценки содержания EGF в активной форме, были высушены под вакуумом, а остаток растворен в 1 мл питательной среды. Изучение биологического эффекта модифицированных каркасов in vitro. Для оценки биологического эффекта модификации in vitro использовали биосенсорный анализ в режиме реального времени на клеточном анализаторе iCelligence (ACEA, США). Поверхность ячейки планшета анализатора покрыта на 70—80% микроэлектродами, на которые подается электрический потенциал (22 мВ), не влияющий на состояние и поведение клеток. В режиме реального времени измерялся клеточный индекс (КИ):
КИ =
Импеданс в определенный временной промежуток n
Импеданс в отсутствие клеток
Номинальное значение импеданса
Значения импеданса зависят от количества адге-зированных клеток, их размера и формы, а также от силы адгезии к субстрату.
Эпителиальные клетки высевали в лунки специального планшета (площадь лунки 0,64 см2) с плотностью 60х103 кл/см2. Образцы каркасов стандартизировали по форме (круг площадью 0,33 см2) и массе (~1 мг) и помещали на культуру клеток через 17 ч. после посева (экспоненциальная фаза роста). В качестве положительного контроля эффекта использовали БОР в концентрации Бй50, отрицательным контролем служила полная питательная среда без сыворотки. Для контроля значений базового уровня КИ применяли одинаковый для всего эксперимента объем полной питательной среды — 600 мкл. Значения КИ (относительный импеданс клеток) фиксировали в течение 87 ч.
Результаты и обсуждение
Из опубликованных ранее работ [15], было известно, что из растворов ПКЛ можно получать волокна диаметром от 2 до 24 мкм. На основании проведенных экспериментов удалось определить состав эмульсии ХФ/РВБ+ПАВ, а также режим диспергирования, позволявший включать в структуру таких волокон дисперсионную фазу с биологически активными веществами. Анализ дисперсного состава приготовленной эмульсии (рис. 1) показал, что
приблизительно 95% частиц имеют размер менее 1000 нм. Размеры остальных частиц находятся в диапазоне от 1000 до 7000 нм.
Изображения волокон, содержащих ОРР, полученные методом флуоресцентной и сканирующей электронной микроскопии, представлены на рис. 2. Флуоресцентные метки размерами от 0,3 до 4 мкм введены в структуру полимерного волокна. Модифицированные материалы обладают широким диапазоном распределения волокон по диаметру. Средний диаметр волокон, рассчитанный из анализа микрофотографий волокнистых образцов на основе ПКЛ, составляет 2,1 мкм.
А
Б
Рис. 2. Волокна ПКЛ, содержащие флуоресцентную метку ОРР (А) и рельеф волокнистой поверхности образцов ПКЛ Ш = 2,1 мкм) (Б): А — микроскопия в светлом поле и флуоресцентная микроскопия;
Б — сканирующая электронная микроскопия
А
20
18
£ 16
"Г
14
о
го т 12
о
10
о
(U т 8
ц о 6
4
2
0
Б
J
100
1||ц—Ящ.
1000
Диаметр частиц, нм
10 000
12
10
к 8 с
¡5 6
4
ю О
2
10
100 1000 10 000 Диаметр частиц, нм
Рис. 1. Гистограммы распределения частиц по размерам (А); по объему (Б)
0
При изготовлении функционализированных волокон были получены образцы, содержащие 5,5 нг EGF на 1 мг материала, что позволяло достигнуть 10-кратного запаса EGF для активации клеток в культуре и продолжительного выхода фактора роста в инкубационную среду.
Для исследования поверхностных свойств модифицированных микроволокнистых каркасов были проведены измерения краевых углов смачивания (рис. 3). Образец, не содержащий в своем составе ПАВ, имел супергидрофобные свойства, причем краевой угол смачивания составил 145°. В то же время все образцы, модифицированные плюроником F-127, мгновенно поглощали каплю воды (краевой угол смачивания 0°), что может повысить их адгезию для клеточных культур.
Оценка выхода EGF in vitro. Концентрация EGF в пробах эмульсий БАС (В1 и В2) до проведения
электроформования была >4000 пг/мл, что подтверждает наличие функционального БАС на различных стадиях предподготовки эмульсии.
Проведенные исследования показали постепенное изменение концентрации EGF в инкубационной среде с волокнистыми матриксами в течение 2 мес. (рис. 4). В литературе отмечается, что белок EGF стабилен, а его время полужизни составляет от 4 сут. в физиологических жидкостях [16] до 30 сут. в PBS [17] в зависимости от источника происхождения, pH среды и способа измерения.
Характер полученной кривой концентрации белка соответствует имеющимся данным научной литературы: выход на пиковый уровень за счет десорбции белка с поверхности материала, стабилизация, и постепенное уменьшение детектируемой концентрации со временем [8], вызванное деградацией центров связывания белка.
Рис. 3. Краевой угол смачивания волокнистых материалов на основе ПКЛ (А) без плюроника Р-127 (145°) и (Б) с плюроником Р-127 (0°). Микроскопия в отраженном свете
Рис. 4.
Динамика выхода EGF из деградирующего ПКЛ-матрикса
10
20
30
40 Дни
50
60
70
80
0
0.700
0.620
0.540
0.460
0.380
0.300
0.220
0.140
0.060
-0.020
-0.100
1 Г
00:00:00 17:33:48 35:07:36 52:41:24 70:15:12
Время, ч
-д— Образцы модифицированнных матриксов
Контроль serum deprivation среды и добавлением ED50 EGF
-В— Контроль serum deprivation среды и добавлением 10% -■— от ED50 EGF
-О— Контрольный образец К.2 —в— Контрольный образец К.1
87:49:01
Рис. 5. Динамика изменения клеточного индекса при культивировании эпителиальных клеток МСР7 в клеточном анализаторе ¡СеШдепсе
Следует отметить, что измеренные значения концентрации БЭР в растворах (80—280 пг/мл) были более чем в 20—30 раз меньше теоретически рассчитанных предельных значений. Предположительно снижение концентраций БЭР в среде йМБМ относительно теоретически рассчитанного значения связано с медленной деградацией волокнистого материала на основе ПКЛ и, возможно, денатурацией БЭР в электрическом поле или под действием гамма-излучения [18].
Биологический эффект модифицированных каркасов. Измерение клеточного индекса проводилось следующим образом: в лунки специального планшета высевали клетки МСР7 в полной питательной среде, в первую фазу 0—17 ч. происходила адгезия и пролиферация клеток, через 17 ч. производилась замена полной питательной среды на неполную (без сыворотки), и в лунки планшета добавлялись модифицированные и контрольные образцы волокнистых материалов. Изменения клеточного индекса отмечали в промежутке 17—87 ч. (рис. 5).
В лунках с модифицированными БЭР образцами был выявлен максимальный биологический эффект на пролиферацию клеток линии МСР7 (средний КИ 465). В контрольных лунках стимулирования пролиферации не происходило, КИ уменьшался, что подтверждалось уменьшением площади клеток, контактирующих с поверхностью лунок (средний
КИ 160). В лунках с добавлением ED50 EGF наблюдали более низкие значения КИ по сравнению с лунками с образцами волокнистых материалов (средний КИ 300).
Таким образом, модифицированные матриксы обладают, за счет выхода БАС, эффектом стимуляции пролиферации культур эпителиальных клеток in vitro.
выводы
Методом эмульсионного электроформования изготовлены каркасы на основе ПКЛ, модифицированные EGF. Проведены биологические исследования, показывающие, что модифицированные волокнистые материалы обладают эффектом стимулирования пролиферации клеточной линии MCF7. Полученные в работе результаты позволят создавать специализированные слои тканеинженерных конструкций со свойствами пролонгированного индуцирования пролиферации эпителиальных клеток.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке соглашения о субсидии № 14.604.21.0133 Минобрнауки РФ (уникальный идентификатор RFMEFI60414X0133) с использованием оборудования ЦКП «Регенеративная медицина» (ID310020).
ЛИТЕРАТУРА:
1. Aamodt J.M., Grainger D.W. Extracellular matrix-based biomaterial scaffolds and the host response. Biomaterials 2016; 86: 68-82.
2. Edgar L., McNamara K., Wong T. et al. Heterogeneity of Scaffold Biomaterials in Tissue Engineering. Materials (Basel) 2016; 9(5): 332.
3. Насонова М.В., Шишкова Д.К., Антонова Л.В. и др. Результаты субкутанной имплантации полимерных матриксов на основе поликапролактона и полигидроксибутировалерата, модифицированных ростовыми факторами. Современные технологии в медицине 2017; 9(2): 7-18.
4. Антонова Л.В., Кривкина Е.О., Сергеева Е.А. и др. Тканеин-женерный матрикс, модифицированный биологически активными молекулами для направленной регенерации тканей. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний 2016; 5(1): 18-25.
5. Yang B., Zhou L., Peng B. et al. In vitro comparative evaluation of recombinant growth factors for tissue engineering of bladder in patients with neurogenic bladder. J. Surg. Res. 2014; 186(1): 63-72.
6. Sebe I., Szabo P., Kallai-Szabo B. et al. Incorporating small molecules or biologics into nanofibers for optimized drug release: A review. Int. J. Pharm. 2015; 494(1): 516-30.
7. Севостьянова В.В., Elgudin Y.L., Wnek G.E. и др. Свойства тканеинженерных матриксов из поликапролактона, импрегнированных факторами роста VEGF и bFGF. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2012; 7(3): 62-7.
8. Simon-Yarza T., Formiga F.R., Tamayo E. et al. Vascular Endothelial Growth Factor-Delivery Systems for Cardiac Repair: An Overview. Theranostics 2012; 2(6): 541-52.
9. Sell S., Barnes C., Smith M. et al. Extracellular matrix regenerated: tissue engineering via electrospun biomimetic nanofibers. Polymer Int. 2007; 56(11): 1349-60.
10. Wang X., Ding B., Li B. Biomimetic electrospun nanofibrous structures for tissue engineering. Materials Today 2013; 16(6): 229-41.
11. Люндуп А.В., Демченко А.Г., Тенчурин Т.Х. и др. Повышение эффективности заселения б и оде градируемых матриксов стромальными и эпителиальными клетками при динамическом культивировании. Гены и клетки 2016; 11(3): 102-7.
12. Boonstra J., Rijken P., Humbel B. et al. The epidermal growth factor. Cell Biol. Int. 1995; 19(5): 413-30.
13. Холмберг К., Йенсон Б., Кронберг Б. и др. Поверхностно-активные вещества и полимеры в водных растворах. М.: БИНОМ Лаборатория знаний; 2007.
14. Senga K., Mostov K.E., Mitaka T. et al. Grainyhead-like 2 regulates epithelial morphogenesis by establishing functional tight junctions through the organization of a molecular network among claudin3, claudin4, and Rab25. Mol. Biol. Cell 2012; 23(15): 2845-55.
15. Арутюнян И.В., Тенчурин Т.Х., Кананыхина Е.Ю. и др. Нетканые материалы на основе поликапролактона для тканевой инженерии: выбор структуры и способа заселения. Гены и клетки 2017; 12(1): 62-71.
16. Hardwicke J., Moseley R., Stephens P. et al. Bioresponsive dextrin - rhEGF conjugates: In vitro evaluation in models relevant to its proposed use as a treatment for chronic wounds. Molecular pharmaceutics 2010; 7(3): 699-707.
17. Araki F., Nakamura H., Nojima N. et al. Stability of Recombinat Human Epidermal Growth Factor in Various Solutions. Chemical and Pharm.l Bull. 1989; 37(2): 404-6.
18. Ji W., Sun Y., Yang F. et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharmaceutical res. 2011; 28(6): 1259-72.
Поступила: 20.10.2017
