CC BY
2УДК 61 Недорубов А.А., Харькова О.О., Щекин В.И., Демяшкин Г.А.
Недорубов А.А.
руководитель Центра доклинических исследований Института трансляционной медицины и биотехнологии https://orcid.org/0000-0002-5915-7999 Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (г. Москва, Россия)
Харькова О.О.
специалист по доклиническим исследованиям Центра доклинических исследований Института трансляционной медицины и биотехнологии https://orcid.org/0000-0002-6235-1020 Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (г. Москва, Россия)
Щекин В.И.
специалист по доклиническим исследованиям Центра доклинических исследований Института трансляционной медицины и биотехнологии https://orcid.org/0000-0003-3763-7454 Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (г. Москва, Россия)
Демяшкин Г.А.
доктор медицинских наук, заведующий лабораторией гистологии и иммуногистохимии Института трансляционной медицины и биотехнологии https://orcid.org/0000-0001-8447-2600 Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (г. Москва, Россия)
МОДЕЛИРОВАНИЕ ЦЕЛИАКИИ IN VIVO ИММУНИЗАЦИЕЙ ГЛИАДИНОМ С ПОСЛЕДУЮЩИМ АДАПТИВНЫМ ПЕРЕНОСОМ Т-ЛИМФОЦИТОВ МЫШАМ-РЕЦИПИЕНТАМ
Аннотация: данное исследование посвящено разработке модели целиакии in vivo на самцах мышей C57BÍ/6 при пероральном способе введения в дозах 4 и 20 мг/жив. У мышей на 15 день, которых содержали на глютеновой диете, было подтверждено нарушение строения слизистой оболочки тонкой кишки соответствующее целиакии: выраженная лимфоцитарно-плазмоцитарная инфильтрация, утолщение и укорочение ворсинок, атрофия слизистой оболочки в сочетании очаговой гиперплазии кишечных крипт. Кроме того, у этих мышей были повреждены энтероциты и их плотные соединения. Диарея, вздутие живота, а также выпадение шерсти наблюдались у 20% мышей из группы, получавших глютеновое питание (Целиакия). В слизистой тонкой кишки обнаруживается
Ключевые слова: целиакия, генетическое заболевание, факторы патогенеза.
Введение.
Целиакия является одной из наиболее часто встречающихся генетических заболеваний, которой страдает 0,5-1% населения земного шара. При этом, отмечается неуклонный рост непереносимости глютена. Потребление глютена, полученного из пшеницы, пациентами с глютеновой болезнью приводит к иммуноопосредованному повреждению тонкой кишки, которое характеризуется нарушением кишечной проницаемости, атрофией ворсин и воспалительной
инфильтрацией собственной пластинки слизистой оболочки, богатой лимфоцитами и плазматическими клетками [1, 2].
Для понимания роли врождённого иммунного ответа, а также активации адаптивного иммунного ответа на глютен, которые являются патогномоничными критериями для развития целиакии были созданы in vivo модели данного заболевания. В настоящее время большинство из них используется для тестирования новых методов лечения, которые нацелены на различные пути, вызванные стимуляцией глютена.
Однако в настоящий момент все разработанные in vivo модели целиакии недостаточно широко раскрывают механизмы патогенеза целиакии и поэтому не подходят для скрининга лекарственных препаратов для лечения данного заболевания. Все они играют ограниченную роль в разработке или доклиническом исследовании новых методов лечения и чаще используются для анализа специфических механизмов, связанных с патогенезом заболевания, что говорит об актуальности поиска новой in vivo модели.
Папаин-подобные цистеиновые протеиназы (ППЦП, клан CA, семейство С1А широко распространены среди самых разнообразных организмов. Эти ферменты вовлечены практически во все сферы жизнедеятельности растений, такие как эмбриогенез, ответы на биотические и абиотические воздействия, старение, регулируемая клеточная смерть и другие. ППЦП являются относительно стабильными белками, присутствующими в достаточно агрессивных средах лизосом, а также апопласта и вакуолей растений [3, 4]. Активность и специфичность эндопептидаз семейства C1A достаточно подробно изучены in vitro с помощью различных тестов с использованием белковых или флуорогенных пептидных субстратов, а также пептидных ингибиторов. Кроме того, активное развитие современных биоинформатических методов позволило охарактеризовать молекулярные взаимодействия эндопептидаз с их субстратами in silico. Принято считать, что папаин-подобные протеиназы обладают относительно низкой специфичностью. В качестве единственного критерия узнавания пептидного субстрата предполагается наличие в его P2-положении
гидрофобного аминокислотного остатка, включая остаток пролина, или остаток ароматической аминокислоты, а также, в некоторых случаях, остаток аргинина. Несмотря на это, в последнее время появляется все больше данных, указывающих на то, что ППЦП могут выполнять функцию высокоспецифичных ферментов, способных узнавать более протяженные участки в белковых субстратах и осуществлять их гидролиз в условиях, отличающихся от кислой среды, характерной для лизосом.
Тритикаин-а обладает pH-зависимой специфичностью, определяемой аминокислотным остатком, расположенным в P1 положении субстрата. Кроме того, было показано, что тритикаин-а проявляет глютеназную и коллагеназную активности при 37°C в диапазоне рН 3,5-6,5 [5]. Коллагеназная активность тритикаина-а делает его потенциальным терапевтическим агентом в лечении ран и ожогов, а глютеназная активность фермента указывает на большой потенциал тритикаина-а для разработки фармацевтических препаратов, эффективных при лечении непереносимости глютена, в частности, целиакии. Примечательно, что сайты расщепления тритикаином-а были обнаружены в большинстве ранее идентифицированных токсичных пептидов, полученных из глютена, продуцирующих воспалительные реакции у пациентов с целиакией [5].
Таким образом, разработка и усовершенствование in vitro адекватной модели целиакии является необходимым этапом доклинических исследований нового лекарственного средства.
Цель исследования: разработка модели целиакии in vivo, включающую иммунологические факторы патогенеза.
Материал и методы.
Дизайн исследования. Для моделирования целиакии на грызунах активировали T-клеточный иммунный ответ на глютеновые пептиды.
Большинство современных моделей заболеваний животных с нарушенной регуляторной функцией Т-клеток основаны на дефиците CD4+/CD25+ Т-клеток (Treg). Дефицит Treg приводит к полиорганным воспалительным заболеваниям, при этом наиболее сильно поражаются
поверхности слизистой оболочки, прежде всего кишечника. Это объясняется узнаванием микробных антигенов в слизистых оболочках эффекторными Т-клетками. Показано, что при переносе Т-клеток лимфопеническим мышам -способствует индукции антиген-специфического иммунитета и самопроизвольному развитию органоспецифического аутоиммунного заболевания. Поэтому мы предположили, что распознавание пищевого глютена переносимыми глиадином сенсибилизированными CD4+ T-клетками будет стимулировать дуоденит/энтерит у мышей-реципиентов. Для блокирования противовоспалительного фенотипа лимфоцитов и ремиссии активацию лимфоцитов проводили с использованием IFN-y, TNFa. IFN-y активирует макрофаги, которые, в свою очередь, секретируют TNF-a и матриксные металлопротеиназы (MMP), такие как MMP-12 и MMP-13, повреждающие энтероциты и плотные межклеточные контакты. В кишечных миофибробластах как TNF-a, так и IFN-y стимулируют экспрессию протеолитических MMP-1 и MMP-3. Такое высвобождение и активация MMP индуцирует протеолиз внеклеточного матрикса, что приводит к изменению структуры кишечника, наблюдаемой при целиакии.
Суть исследования специфической активности тритикаина-a заключается в расщеплении экзогенных пептидов глютена и тем самым блокирование начального этапа иммунологического каскада целиакии.
При разработке модели целиакии in vivo использовали алгоритм, представленный на рисунке 1.
Рисунок 1. Схема адаптивного переноса.
Животных случайным образом распределяли по группам, используя в качестве критерия вес, так, чтобы индивидуальный показатель не отличался более чем на 10 % от среднего веса животных в каждой опытной группе и между группами. Животные - мыши C57Bl/6 (табл. 1).
Таблица 1. Объем проводимого вмешательства при моделировании целиакии.
Группа Диета Животные, п Манипуляции
контроль юг
Целпакня 1 Безглютеновая днета ю г перенос кокультуры Т-лимфоцитов/макрофагов, антител к глютену
Целиакия 2 Глютеновая диета 10 с
Моделирование целиакии на мышах С57В1/6.
Иммунизация животных. Для получения антител к глиадину мышей иммунизировали подкожно 20 мышей C57Bl/6 введением 200 мкг глиадина, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда (FCA) в течение пяти недель для последующего выделения антител.
1 неделя: подкожное введение 200 мкг глиадина, эмульгированного в
FCA.
2 неделя: подкожное введение 200 мкг глиадина, эмульгированного в IFA. Введение коклюшного токсина (КТ) (50 мкг/мл) в объёме 200 мкл.
3 неделя: подкожное введение 200 мкг глиадина, эмульгированного в IFA.
4 неделя: подкожное введение 200 мкг глиадина, эмульгированного в IFA.
5 неделя: подкожное введение 200 мкг глиадина, эмульгированного в IFA.
Выделение антител к глиадину. На шестой неделе проводи эвтаназию иммунизированных мышей путём цервикальной дислокации. Получали сыворотку путём естественного свёртывания крови и центрифугирования при 3500 об./мин. в течение 15 мин.
Антиген-специфичная активация T-лимфоцитов. Для активации лимфоцитов двадцати мышам линии C57B1/6 вводили подкожно 200 мкг глиадина, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда. Через два часа внутрибрюшинно вводили коклюшный токсин (КТ) в объёме 200 нг на животное для усиления активации иммунного ответа. Повторное введение КТ осуществлялось спустя 48 часов.
Выделение активированных T-лимфоцитов. Через 10 дней после иммунизации мышей забивали путём цервикальной дислокации, селезёнку извлекали асептически и переносили в фалькон с физиологическим раствором. Селезёнки гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера в 15 мл RPMI-1640 с аланил-глутамином. Клеточную суспензию центрифугировали при 500g. 15 мин. К осаждённым клеткам добавляли по 25 мл буфера для лизиса эритроцитов и центрифугировали 15 мин. при 500g. Ресуспендировали осаждённые клетки в 20 мл среды RPMI-1640 и пропускали через фильтр 40 нм (BD Falcon). Подсчет количества живых клеток проводили в камере Горяева.
Выделение культуры перитонеальных макрофагов. Брюшная полость мыши представляет собой «идеальное место» для сбора макрофагов. Количество макрофагов в брюшине оценивается примерно 1*106 макрофагов на мышь.
Выделение перитонеальных макрофагов у двадцати мышей линии C57B1/6 проводилось после эвтаназии путём цервикальной дислокации. Перитонеальный смыв осуществляли внутрибрюшинным введением раствора гепарина в физиологическом растворе по 2 мл. на животное. Пропускали через фильтр 40 нм (BD Falcon) для удаления неклеточных элементов. Полученный смыв макрофагов центрифугировали при 500g. 15 мин., при комнатной температуре. К осаждённым клеткам добавляли 25 мл буфера для лизиса эритроцитов и центрифугировали 15 мин. при 500g. Ресуспендировали осаждённые клетки в 20 мл среды RPMI-1640 и пропускали через фильтр 40 нм (BD Falcon). Подсчет количества живых клеток провели в камере Горяева.
Культивирование кокультуры активированных T-лимфоцитов и перитонеальных макрофагов. Для получения воспалительных лимфоцитов, специфичных к белкам глиадина, получали кокультуру активированных T-лимфоцитов и перитонеальных макрофагов. Для этого выделенные активированных T-лимфоциты разводили полной средой RPMI-1640 до концентрации 2 х 106 клеток на мл. Для создания кокультуры в конечный объём добавляли тотально перитонеальные макрофаги. Для стимуляции клеток использовали 2 мкг/мл глиадина, 2,5 мкг/мл ConA, 10 нг TNFa и 10 нг IFN-y.
Адаптивный перенос реактивных T-лимфоцитов в мышей-реципиентов. Перенос клеток осуществлялся в самцов мышей С57В1/6 путём внутрибрюшинной инъекции. Мышам вводили по 2 х 107 клеток на мышь. Для активации провоспалительных факторов мышей содержали на глютеновом питании (пшеница).
Морфологическое исследование фрагментов тонкой кишки (общее, морфометрическое, иммуногистохимическое). Образцы окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологическое исследование применяли для уточнения или исключения клинического диагноза, а также для оценки тяжести патологического процесса, его динамики.
Результаты и их обсуждение.
Клинические наблюдения за животными. На протяжении исследования все животные оставались живы. Во время эксперимента осуществляли ежедневное наблюдение за животными. В группах «Целиакия+безглютеновая диета» и «Здоровые» животные выглядели здоровыми, охотно поедали корм, реагировали на внешние раздражители, проявляли интерес к людям. Ни у одной мыши не было отмечено изменений поведения в сторону угнетения или возбуждения. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Визуально упитанность всех животных была удовлетворительной. Ни одно животное не проявляло признаков агрессии по отношению к другим мышам. Положение тела в пространстве было в пределах нормы. Нарушений координации движений и походки отмечено не было. Шерстный покров густой, ровный и блестящий, плотно прилегал к поверхности тела, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Кожа без признаков раздражения или воспаления. Тургор и целостность кожных покровов сохранены, пальпируемые образования отмечены не были. Область живота в объеме не увеличена. Дыхание ровное, обычного ритма, незатрудненное. Видимые слизистые оболочки бледно-розового цвета, блестящие, без нарушения целостности. У всех животных экзофтальма, отечности или гиперемии слизистых глаз не отмечалось. Слезотечения не наблюдалось. Нос розовый, умеренно влажный, патологические выделения отсутствовали. Уши бледно-розовые, обычной температуры, нагноений, воспаления, загрязнений ни у кого отмечено не было. Зубы у всех сохранены. Нарушений слюноотделения не наблюдалось. Частота мочеиспускания, цвет мочи, желудочно-кишечные показатели, мышечный тонус, рефлексы соответствовали физиологической норме. Зоосоциальное поведение не отличалось от здоровых животных.
В группах «Целиакия+глютеновая диета» животные выглядели апатичными, слабо реагировали на внешние раздражители. У мышей наблюдали угнетение активности поведения. Животные были малоподвижны. Шерстный покров густой, взъерошенный, выпадения или ломкости шерсти не выявлено.
Кожа без признаков раздражения или воспаления. Тургор и целостность кожных покровов сохранены, пальпируемые образования отмечены не были. Область живота в объеме сильно увеличена. Дыхание ровное, обычного ритма, незатрудненное. Видимые слизистые оболочки бледно-розового цвета, блестящие, без нарушения целостности. У всех животных экзофтальма, отечности или гиперемии слизистых глаз не отмечалось. Слезотечения не наблюдалось. Нос розовый, умеренно влажный, патологические выделения отсутствовали. Уши бледно-розовые, обычной температуры, нагноений, воспаления, загрязнений ни у кого отмечено не было. Зубы у всех сохранены. Нарушений слюноотделения не наблюдалось. Частота мочеиспускания, цвет мочи соответствовали физиологической норме, наблюдали диарею у всех животных в группе начиная с третьего дня. Набор массы животных замедлился, но статистических различий с группами «Целиакия+безглютеновая диета» и «Здоровые» нет.
Морфологическое исследование. Наиболее выраженные патологические изменения обнаружили во втором и третьем сегментах двенадцатиперстной кишки: уплощение, частичная или полная редукция кишечных ворсинок, гиперплазия кишечных крипт, дегенерация энтероцитов, интраэпителиальный лимфоцитоз, и интенсивная лимфоцито-плазмоцитарную инфильтрацию собственной пластинки слизистой оболочки. В образцах со средней степенью выраженности целиакии признаки атрофии носили очаговых характер. Гиперплазия кишечных крипт включала в себя увеличение их количества, удлинение, расширение пролиферативной зоны, и выраженное увеличение числа митозов. Энтероциты при целиакии демонстрировали неспецифические изменения, включая «сглаженность» щеточной каемки, кубическую метаплазию, вакуолизацию, цитоплазматическую базофилию, потерю полярности и базальной ядерной ориентации. При морфологической оценки тонкой кишки по классификация Marsh-Oberhuber (Marsh, 1992, Oberhuber et al., 1999) можно выставить 2 балла: гипертрофия и углубление кишечных крипт при выраженной
лимфоцитарной инфильтрации (МЭЛ>30), без атрофии кишечных ворсинок (рис. 2, 3).
Рисунок 2. Лимфоцитарно-плазмоцитарная инфильтрация слизистой оболочки тонкой кишки, утолщение и укорочение ворсинок на 15 сутки. 40 МЭЛ на 100 клеток. Окраска: гематоксилином и эозином, увелич. х 200.
Рисунок 3. Выраженное укорочение кишечных ворсин, а также их атрофия, клеточная воспалительная инфильтрация слизистой оболочки, количество МЭЛ 40 на 100 эпителиальных клеток, дистрофические изменения эпителиальных клеток ворсин. Окраска: гематоксилином и эозином, увелич. х 200.
Заключение.
По данным гистологического исследования можно утверждать, что использованная в исследовании модель по состоянию на 15 сутки от начала эксперимента воспроизводит патоморфологическую картину при целиакии с умеренным течением, что подтверждается клинической картиной. Выявленные
морфологические изменения не носят строго специфического характера из-за недостаточной длительности эксперимента, однако явно выражены при сравнении с нормальной гистологической картиной тонкой кишки у животных контрольной группы.
Конфликт интересов.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Barone M.V., Troncone R., Auricchio S. Gliadin peptides as triggers of the proliferative and stress/innate immune response of the celiac small intestinal mucosa. International Journal of Molecular Sciences. 2014, 15(11):20518-37;
2. Краснюк И.В., Тарасов В.В., Свистунов А.А. Разработка экспериментальной модели целиакии in vivo // Здоровье и образование в XXI веке. 2020. №3;
3. Финкина Е.И., Мельникова Д.Н., Богданов И.В., Овчинникова Т.В. Белки системы врожденного иммунитета растений, осуществляющие транспорт липидов: структура, функции и практическое применение // Acta Naturae (русскоязычная версия). 2016. №2 (29);
4. Zhang D, Liu D, Lv X, Wang Y, Xun Z, Liu Z, Li F, Lu H. The cysteine protease CEP1, a key executor involved in tapetal programmed cell death, regulates pollen development in Arabidopsis. Plant Cell. 2014 Jul,26(7):2939-61. doi: 10.1105/tpc. 114.127282;
5. Краснюк И.И., Тарасов В.В., Козлова Ж.М., Степанова О.И., Краснюк (Мл) И.И., Кугач В.В. Изучение физико-химических и технологических свойств тритикаина-а // Вестник фармации. 2019. №1 (83)
Nedorubov A.A., Kharkova O.O., Shchekin V.I., Demyashkin G.A.
Nedorubov A.A.
Sechenov First Moscow State Medical University (Moscow, Russia)
Kharkova O.O.
Sechenov First Moscow State Medical University (Moscow, Russia)
Shchekin V.I.
Sechenov First Moscow State Medical University (Moscow, Russia)
Demyashkin G.A.
Sechenov First Moscow State Medical University (Moscow, Russia)
MODELING OF CELIAC DISEASE IN VIVO BY GLIADIN IMMUNIZATION FOLLOWED BY ADAPTIVE TRANSFER OF T LYMPHOCYTES TO RECIPIENT MICE
Abstract: this study is devoted to the development of an in vivo model of celiac disease in male C57BI/6 mice with oral administration at doses of 4 and 20 mg/live. In mice on day 15, which were kept on a gluten diet, a violation of the structure of the mucous membrane of the small intestine corresponding to celiac disease was confirmed: pronounced lymphocytic-plasmocytic infiltration, thickening and shortening of the villi, atrophy of the mucous membrane in combination with focal hyperplasia of intestinal crypts. In addition, these mice had damaged enterocytes and their dense connections. Diarrhea, bloating, and hair loss were observed in 20% of the mice in the gluten-fed group (Celiac disease). In the mucous membrane of the small intestine, it is found
Keywords: celiac disease, genetic disease, pathogenesis factors.
