CC BY
51
моделирование ортотопического роста рака почки человека с перевиваемым штаммом рпоч1 на иммунодефицитных мышах
н.В. Андронова, С.М. Ситдикова, л.Ф. Морозова, н.Т. райхлин, и.А. Букаева, и.Ж. Шубина,
М.В. Киселевский, Е.М. Трещалина
ФГБУ«Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва,
Каширское шоссе, 24
Контакты: Елена Михайловна Трещалина treshalina@yandex.ru
Введение. Разработка новых ортотопических моделей опухолевого роста (surgical orthotopic implantation, SOI) открывает возможность доклинического изучения потенциального антиметастатического действия препаратов, в том числе направленных на лечение диссеминированного светлоклеточного рака почки, с использованием в качестве имплантата фрагмента опухоли или метастаза от пациента. Использование подкожного (п/к) ксенографта открывает возможность оптимизации SOI с расширением возможностей применения в эксперименте. Наличие п/к ксенографта РПоч1, охарактеризованного трансплантационно, морфологически, иммунологически и по чувствительности к классическим противоопухолевым цито-статикам в коллекции опухолевых штаммов ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, позволяет получить ортотопическую модель для полифункционального применения при доклиническом изучении новых специфических лекарств.
Цель исследования — подготовка и получение доклинической ортотопической модели светлоклеточного рака почки человека с имплантатом в виде п/к ксенографта РПоч1.
Материалы и методы. Использованы п/к РПоч1 и иммунодефицитные мыши-самки Balb/c nude разведения РОНЦ. Трансплантационные характеристики определены при пассировании имплантата в паренхиму почки. О результативности ортотопической имплантации в динамике судили по кинетическим, патоморфологическим и иммунологическим характеристикам с применением методов световой микроскопии, проточной цитофлуориметрии и моноклональных антител (МКА, Caltag Laboratories) против соответствующих антигенов. Лекарственная чувствительность оценена по отношению к ингибиторам тирозинкиназ по стандартным показателям (T/С < 42 %, число полных регрессий).
Результаты. При ортотопической имплантации РПоч1 на 7, 14 и 21 с получены опухолевые узлы размерами 5,0 ± 1,0 мм3, 215,0 ± 88,0 мм3 и 608,0 ± 157,0 мм3. Гистологически опухоль представлена разделенными соединительно-тканными прослойками, солидными полями крупных полиморфных клеток с митозами (10—15 в 1 очаге) и единичными очагами некрозов на 21 с. Повышенный в 1,5 раза на 14-е сутки у мышей уровень экспрессии NK1.1 и в 3,3раза уровень CD8а свидетельствуют о тенденции к развитию индуцированной опухолевым ростом иммуносупрессии. Показана высокая чувствительность РПоч1 к сорафенибу и сунитинибу (Т/С = 2—30 %).
Заключение. Получен ортотопический ксенографт светлоклеточного рака почки человека РПоч1 со 100 % прививаемостью, воспроизводимыми биологическими, в том числе иммунологическими, характеристиками и чувствительностью к ингибиторам тирозинкиназ, пригодный для доклинического изучения различных средств, в том числе иммунологических, или комбинаций, направленных на лечение этой патологии.
Ключевые слова: ортотопический имплантат, рак почки человека
DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-1-51-60
modeling of orthotopical growth of human kidney cancer
with subcutaneous xenografts rpoch1 on immunodeficient mice
N. V. Andronova, S.M. Sitdikova, L.F. Моrоzоvа, N.T. Rаichlin, I..A. Bukаеvа, I.Zh. Shubina, М. V. Kiselevsky, Н.М. Trеshаlina
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Sh., Moscow 115478, Russia
Introduction. Creation of new orthotopic models of tumor growth (surgical orthotopic implantation, SOI) promotes pre-clinical studies of anti-metastatic functional potential of the drugs including those which aim to treat advanced clear-cell renal carcinoma with the use of patient's tumor or metastasis sample for implantation material. The use of subcutaneous (s. c.) xenograft contributes to SOI improvement and extends experimental opportunities. The collection of tumor strains of N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center that includes s. c. xenograft RPochl, which was characterized by transplantation, pathological, and immunological parameters and in terms of sensitivity towards classical antitumor cytostatics, presents the base for obtaining an orthotopic model for multifunctional usage in pre-clinical studies of specific medicines.
52 Оригинальные статьи
Objective. Preparation and obtaining an orthotopic model of human clear-cell renal carcinoma with the implant of subcutaneous xenograft RPochl. Materials and methods. The study used s. c. RPochl and immunodeficientfemale mice Balb/c nude on the N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center breeding. Transplantation characteristics were defined during implant passages into kidney parenchyma. The effectiveness of orthotopic implantation was estimated in the dynamics according to kinetic, pathological, morphological, and immunological parameters by light microscopy, flow cytometry, monoclonal antibodies (mAb, Caltag Laboratories) against corresponding antigens. Sensitivity to specific drugs was assessed against inhibitors of tyrosine kinases according to standard parameters (T/С <42 %, total regressions). Results. After orthotopic implantation of RPochl on days 7, 14 and 21 the tumor lesions were registered with the size of 5.0 ± 1.0 mm3, 215.0 ± 88.0 mm3 and 608.0 ± 157.0 mm3. Histological examination showed that the tumor had separated connective tissue layers of solid areas of large polymorphic cells with mitosis (10—15 in a lesion) and single areas with necrosis on day 21. The 1.5-fold enhanced expression of NK1.1 in mice on day 14 and 3.3-fold increase of CD8a expression demonstrate the tendency to develop immune suppression induced by growing tumor. The results showed high sensitivity of RPoch1 to sorafenib and sunitinib (T/Cmin = 2—30 %). Conclusion. The authors obtained an orthotopic xenograft of human clear-cell renal carcinoma RPoch1 with 100 % transplantation potential, reproducible biological characteristics including immunological parameters and sensitivity to inhibitors of tyrosine kinases, which can be used for pre-clinical studies of various agents including immunological or different combinations of antitumor drugs against this cancer type. Key words: orthotopic implant, human kidney cancer Введение центр им. Н.Н. Блохина» (РОНЦ им. Н.Н. Блохина) Ортотопические ксенографты получают, как пра- Минздрава России. Ксенографт получен из удален-вило, путем имплантации ex tempore фрагментов ного опухолевого узла пациента РОНЦ им. Н.Н. Бло-опухолей человека (операционный материал) разных хина [3]. Важно также, что в коллекции есть депониро-локализаций иммунодефицитным мышам в тот ор- ванная во Всероссийской коллекции промышленных ган, из которого получены (хирургическая ортотопи- микроорганизмов оригинальная клеточная линия ческая имплантация, surgical orthotopic implantation, РПоч1 (рег. № Н-165). Такая тест-система выигрыш-SOI). SOI используют на завершающем этапе докли- на еще и потому, что позволяет оценить антипро-нического изучения новых противоопухолевых пре- лиферативное действие агента или комбинации по-паратов для оценки действия на метастазирование следовательно на 1 модели in vitro / in vivo. Наиболее или на клиническом этапе в рамках программы ценными являются оценка чувствительности модели прогноза индивидуальной лекарственной чувстви- к современному стандарту лечения (ингибиторам тельности пациента в раннем послеоперационном тирозинкиназ) и наличие онкомишени для апроба-периоде (колоректальный рак) [1]. Однако прогноз ции инновационных таргетных средств, например лекарственной чувствительности на этой модели CTLA-4 — ключевой мишени иммунологического оправдан только для противоопухолевых цитостати- надзора (immune checkpoint blockade) для аналогов ков и существенно ограничен для иммунотерапевти- ипилимумаба [4]. ческих или таргетных средств [2]. Недостатком ме- Штамм РПоч1 имеет строение трабекулярно-па-тода является также отсутствие гарантированной пиллярной светлоклеточной аденокарциномы с узел-100 % ортотопической имплантации операционного ками папиллярного рака. PAS+-окрашивание четко материала, так как имплантат в силу случайной вы- прослеживает базальные мембраны, на которых рас-борки фрагмента опухоли может не содержать необ- положен многорядный и цилиндрический эпителий. ходимого для опухолевого роста пула пролифериру- Опухоль характеризуется общей продолжительно-ющих клеток при смене микроокружения. стью клеточного цикла 28,2 ч со следующей продол-Как правило, не представляется возможным повтор- жительностью фаз: Gt+1/2M — 8,5 (8,3—8,9) %, S — 14,9 но взять материал у пациента. Использование опухо- (14,6—15,3) %, G2+1/2M — 4,8 (4,7—5,0) %. Пролифе-левого материала с воспроизводимыми транспланта- ративный пул в момент перевивки: 21,0 (20,4—23,1) % ционными и биологическими характеристиками, клеток. Уровень синтеза ДНК в клетках, определенный например подкожного (п/к) ксенографта для полу- по интенсивности радиоактивной метки (импульс/ чения ортотопической модели, позволило бы опти- минута): 3Н-тимидин — 759 (629—1003), 3Н-дезо-мизировать SOI. Не удалось найти подобные экспе- ксиуридин — 896 (805—1200). В опухоли определяют-рименты в тематической литературе. ся гормональные рецепторы человека к андрогенам Нами апробирована возможность получения (114,0), выражена экспрессия онкогенов sis, р53, ортотопической модели рака почки человека с ис- c-myc и myb. П/к ксенографт отличается отсутствием пользованием п/к ксенографта РПоч1 из коллекции чувствительности к классическим противоопухоле-ФГБУ «Российский онкологический онкологический вым цитостатикам: дактиномицину, блеомицину,
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 1'2017 том 16 |voL. 16
метотрексату, проспидину, гексаметилмеламину, вин-бластину, 5-фторурацилу, адриамицину и CCNU. Чувствительность к ингибиторам тирозинкиназ, современному стандарту лечения, ранее не определялась. В связи с этим целесообразно оценить состояние иммунологического надзора у мышей Balb/c nude с РПоч1 для изучения средств иммунотерапии и дополнить характеристику лекарственной чувствительности к ингибиторам тирозинкиназ. Полученные данные можно экстраполировать на ортотопическую модель, поскольку у клеток метастатических узлов и первичной опухоли лекарственная чувствительность идентична. С учетом иммунопривилегирован-ной зоны подкапсульного пространства почки и для адекватного неоангио- и васкулогенеза имплантацию следует выполнять в паренхиму органа.
Приведенные выше свойства светлоклеточного рака почки человека РПоч1 in vivo открывают возможность модификации SOI, направленной на получение доклинической ортотопической модели с использованием п/к ксенографта. Полученная модель может применяться для прогноза эффективности различных фармакологических средств лечения первичного или метастатического светлоклеточ-ного рака почки человека. В соответствии с этим сформулированы цель и задачи исследования.
Цель исследования — подготовка и получение доклинической ортотопической модели светлокле-точного рака почки человека с имплантатом в виде п/к ксенографта РПоч1. Задачи:
♦ оценка чувствительности п/к ксенографта перевиваемого рака почки человека РПоч1 к ингибиторам тирозинкиназ;
♦ определение основных характеристик ортотопи-ческого роста п/к ксенографта РПоч1 человека в почке мышей Balb/c nude с патоморфологиче-ской идентификацией;
♦ определение показателей иммунологического надзора при ортотопическом росте п/к рака почки человека РПоч1 у мышей Balb/c nude.
Материалы и методы
Оценка чувствительности подкожного ксенографта перевиваемого рака почки человека рПоч1 к ингибиторам тирозинкиназ
П/к ксенографт перевиваемого рака почки человека РПоч1 трансплантировали по стандартной методике всем взятым в опыт животным, которых ранжировали по группам. Одну из групп оставляли без специфического лечения и считали контрольной. Остальные группы получали ингибиторы тирозинкиназ, входящие в стандарты лечения диссеминиро-ванного рака почки человека [5—8].
Использованные препараты:
♦ нексавар (сорафениб, Bayer Health Care AG, Bayer Schering Pharma AG, Германия), 1 упаковка, содержащая 112 таблеток по 200 мг;
♦ сутент (сунитиниб, Pfizer, США, Pfizer Italia, Италия), 1 флакон, содержащий 30 капсул по 12,5 мг, и 2 упаковки, содержащие по 28 капсул по 25 мг. Препараты вводили мышам перорально металлическим зондом в оптимальных схемах применения. Проведено по 1 циклу лечения с сорафенибом или сунитинибом. Кроме того, выполнено последовательное лечение сорафенибом и сунитинибом для моделирования клинической ситуации, при которой сунитиниб назначают во 2-й линии после малоэффективного курса сорафениба в 1-й линии лечения.
Один цикл лечения включал 15-дневный курс введения сорафениба или 10-дневный курс сунити-ниба с началом через 72 ч после трансплантации опухоли. Две линии лечения выполняли последовательно, применяя цитостатики при перекрывающей экспоненциальную фазу роста опухоли сокращенной схеме лечения и уменьшенных соответственно суммарных дозах препаратов. Первую линию лечения начинали через 72 ч после трансплантации опухоли, 2-ю — сразу после окончания 1-й, т. е. на 8-е сутки после трансплантации опухоли.
Для проведения экспериментов составлены следующие группы численностью 10—15 мышей:
♦ группа 1 — контроль роста опухоли;
♦ группа 2 получала 1 цикл лечения сорафенибом в желудок ежедневно 15 дней, суммарные дозы — 150-450 мг/кг;
♦ группа 3 получала 1 цикл лечения сунитинибом в желудок ежедневно 10 дней, суммарные дозы — 200-800 мг/кг;
♦ группа 4 получала 2 линии лечения ежедневно по 5 дней сорафенибом в желудок в суммарной дозе 50 мг/кг (1-я линия) + сунитиниб в суммарной дозе 100 мг/кг (2-я линия). Общая продолжительность 2 линий лечения — 10 дней. Оценку эффективности проводили с использованием стандартных показателей Т/С, % (treatment/ control, критерий T/С < 42 % [2]) и числа полных регрессий в сравнении с контролем. Для вычисления показателей многократно измеряли объем опухоли, рассчитывая индивидуальный и средний объемы в каждой группе.
Оценка переносимости лечения выполнена путем визуального контроля за поведением и состоянием животных в процессе и после лечения, а также по результатам аутопсии внутренних органов.
По завершению экспериментов все животные были умерщвлены передозировкой эфирного наркоза с соблюдением принятых в международной практике гуманных методов.
54 Оригинальные статьи
Биологические характеристики ортотопического против соответствующих антигенов в сравнении с ин-роста рПоч1 тактными животными (n = 5). О результативности ортотопической импланта- Мышиные спленоциты отмывают холодным ции судили по кинетическим и патоморфологиче- фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с 1 % фетальной ским характеристикам. Материал для транспланта- телячьей сывороткой (ФТС) и инкубируют с МКА, ции получали из 3-го пассажа п/к ксенографта рака конъюгированными с красителем флуоресцеин изо-почки человека РПоч1 иммунодефицитным мышам тиоционатом (FITC) или фикоэритрином (PE) со-Balb/c nude [3, 9]. Фрагмент опухолевого узла объе- гласно инструкции производителя. Отмывают 2 раза мом 1,0 мм3, извлеченного у наркотизированной мы- холодным ФСБ с 1 % ФТС. Клетки фиксируют ши при соблюдении правил асептики и антисептики, в ФСБ, содержащем 1 % раствор параформальдегида. использовали ex tempore в качестве материала для ор- На проточном цитометре определяют уровень экс-тотопической трансплантации. В условиях билате- прессии дифференцировочных антигенов лимфоци-рального ламинара мышей-реципиентов (n = 30), тов CD3, CD4, CD8а, CD19, NK1.1, активационных находящихся под золетиловым наркозом, фиксиро- антигенов CD38, молекул главного комплекса гисто-вали на операционном столике. Кожу обрабатывали совместимости (major histocompatibility complex, 70 % раствором этилового спирта и делали разрез MHC) класса II; костимулирующих молекул CD40, в поясничной области. Кожу отсепарировали, вскры- CD80/B7—1, CD86/B7—2. Данные анализируют после вали заднюю брюшную стенку между веточками выделения соответствующего гейта клеточной попу-поясничных нервов над просвечивающей почкой. ляции в режиме dot/plot — распределения клеток по их Почку захватывали мягким малым глазным пинце- линейному прямому (FSC) и боковому (SSC) свето-том и в области задней поверхности верхнего полюса рассеянию. При учете результатов подсчитывают делали брюшистым скальпелем разрез глубиной 5000 событий в гейте. Данные представляют про-2—3 мм, через который помещали в паренхиму почки центное содержание клеток, экспрессирующих опре-заранее приготовленный фрагмент для транспланта- деленный маркер, в общем пуле гейтированных клеток. ции. Мышцы и кожу послойно ушивали непрерывным швом. После трансплантации за мышами на- Результаты блюдали в течение 28 дней с ежедневным контролем оценка чувствительности подкожного поведения и состояния. ксенографта перевиваемого рака почки человека Кинетику роста РПоч1 в почке определяют рПоч1 к ингибиторам тирозинкиназ по среднему объему опухолевого узла на 7-е (n = 10), Показано, что п/к ксенографт перевиваемого 14-е (n = 10) и 21-е (n = 10) сутки после трансплан- рака почки человека РПоч1 обладает высокой чув-тации опухоли. Мышей умерщвляли дислокацией ствительностью к противоопухолевой химиотерапии шейных позвонков, извлекали почку с опухолью ингибиторами тирозинкиназы — сорафенибом и су-и измеряли объем опухолевого узла в 3 проекциях нитинибом. (V = a х b х c). Сорафениб при 15-кратном курсе в разовых дозах Патоморфологическое исследование опухолевых 10—30 мг/кг (суммарно 150—450 мг/кг) вызывал до-узлов в почке на 14-е и 21-е сутки после трансплан- стоверный противоопухолевый эффект в течение тации проводили методом световой микроскопии 9 дней после окончания введения, T/Cmin = 9—28 %. (Polivar, Австрия) окрашенных гематоксилином и эо- Переносимость лечения была удовлетворительной зином срезов. при разовой дозе 10 мг/кг (суммарно 150 мг/кг), Статистический анализ данных выполняли с по- более высокие дозы были эффективными, но сопро-мощью стандартного метода Фишера. вождались токсичностью (табл. 1). Сунитиниб при 10-кратном курсе в разовых дозах методика иммунологического 20—80 мг/кг (суммарно 200—800 мг/кг) также был исследования эффективен и приводил к Т/С = 2—23 %, досто-Иммунологическое исследование касалось оцен- верному лишь на 1 срок при разовой дозе 40 мг/кг ки поверхностных маркеров спленоцитов мышей (суммарно 400 мг/кг). При разовых дозах 40 и 80 мг/кг с ортотопически трансплантированным перевивае- сунитиниб вызывал дозозависимую гибель мышей мым раком почки человека РПоч1 (n = 5). Исполь- после 5 приемов препарата в рамках 10-кратного кур-зован метод проточной цитофлуориметрии с лазер- са с характерными для препарата побочными эффек-ным проточным цитометром FACSCanto II™ (Becton тами (окраской кожных покровов) (табл. 2). Dickinson & Co, США) с программным пакетом BD При проведении 2 линий лечения с последо-FACSDiva [10]. Уровень экспрессии поверхностных вательным применением сорафениба и сунитиниба маркеров изучаемых клеток определяют при помощи 5-кратным курсом на 5-е сутки после окончания моноклональных антител (МКА, Caltag Laboratories) лечения получено достоверное ингибирование роста
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL 0F BI0THERAPY 1'2017 том 16 |voL. 16
таблица 1. Чувствительность п/к ксенографта перевиваемого рака почки человека РПоч1 к сорафенибу
Группа разовая доза* Средний объем опухоли на сутки после трансплантации т/С, %, на сутки после окончания лечения Гибель от токсичности
18 22 26 1 5 9
Контроль (вода) 0,3 мл 335 (83 -587) 509 (109 -909) 1032(840 -1225) 100 100 100 -
10 мг/кг 31 (8- 175) 137 (87- 187) 288 (175- 490)** 9 27 28** 0/10
Сорафениб 20 мг/кг 51 (18 -84) 94 (26- 162) 154 (64- 528)** 15 18 15** 2/10 10 с
30 мг/кг 57 (24 -90) 90 (50- 130) 324 (27- 504)** 17 18 31** 7/10*** 8, 13 с
*Лечение ежедневно на 3-18-й дни после трансплантации опухоли, **р < 0,05; ***картина гибели — уменьшение массы селезенки, дистрофия печени; п = 10.
■
опухоли, T/C = 30 % (p < 0,05). Этот эффект удерживался до 14 сут на уровне Т/С = 27—33 % (p < 0,05) (табл. 3, 4).
Определение основных характеристик ортото-пического роста п/к ксенографта РПоч1 человека в почке мышей Balb/c nude с патоморфологической идентификацией.
Развитие опухолевых узлов перевиваемого рака почки человека РПоч1 в почке иммунодефицитных мышей Balb/c nude демонстрируют следующие рисунки. На рис. 1 показана массовая доля опухоли по отношению к ткани почки в течение 3 нед после трансплантации. Опухолевые узлы в почке визуали-
зируются уже на 7-е сутки после ортотопической трансплантации фрагментов объемом 1,0 мм3, которые занимают не более 1/5—1/7 почки. На 14-е сутки после трансплантации опухолевые узлы занимают более половины ткани почки либо практически одинаковой с ней величины. Значимой динамики до 21-х суток не выявлено.
Кинетика роста опухолевых узлов РПоч1 в почке в течение 3 нед после трансплантации представлена в табл. 5. Видно, что на 7-е сутки опухолевые узлы достигают 9,0 мм3, Ур = 5,0 ± 1,0 мм3. На 14-е сутки после трансплантации максимальный объем опухолевых узлов составил 486,0 мм3 при V = 215,0 ± 88,0 мм3.
таблица 2. Чувствительность п/к ксенографта перевиваемого рака почки человека РПоч1 к сунитинибу
Средний объем опухоли, мм3, на сутки после трансплантации т/С, %, на сутки после окончания лечения Гибель от токсичности
Группа разовая доза* 18 22 26 5 9 13 число Сутки по отношению к лечению
павших
после начала после окончания
Контроль Вода 0,3 мл 335 (83-587) 509 (109-909) 1032 (840-1225) 100 100 100 - - -
Сунитиниб 20 мг/кг 43 (б. разброс) 279 437 (33-841) 13 55 43 3/10 7 2-4
(б. разброс) n = 7
Сунитиниб 40 мг/кг 21 (б. разброс) 39 148 (45-392) ** 6 8 14** 7/10*** 10 5, 8, 12
(б. разброс) n = 3
Сунитиниб 80 мг/кг 77 330 672 23 65 65 8/10*** 1, 5 1, 8
n = 2
*Лечение ежедневно на 3-12-й дни после трансплантации опухоли.**р < 0,05. *** При дозе 40мг/кг после 5введений появилась интенсивная желтовато-зеленоватая окраска кожных покровов; картина гибели: понос, окраска кожных покровов и органов брюшной полости (кишечника, передней брюшной стенки, признаки геморрагического колита), уменьшение массы селезенки, дистрофия печени. *** При дозе 40 мг/кг некоторое уменьшение массы тела, слабая желтовато-зеленоватая окраска кожных покровов; картина гибели: уменьшение массы селезенки, раздражение кишечника; при дозе 80мг/кг после 5 введений появилась интенсивная желтовато-зеленоватая окраска кожных покровов; картина гибели: понос, интенсивная окраска кожных покровов и органов брюшной полости (кишечника, передней брюшной стенки, признаки геморрагического колита), уменьшение массы селезенки, раздражение кишечника, дистрофия печени.
таблица 3. Чувствительность п/к ксенографта перевиваемого рака почки человека РПоч1 к последовательному лечению сорафенибом и сунитинибом
Группа режим лечения Средний объем опухоли (мм3) на сутки после трансплантации опухоли т/С, %, на сутки после окончания лечения
1 2 3 4 1 2 3 4
Контроль Вода 0,3 мл 10 дн. 926 (824-1028) 1058 (915-1201) 1246 (1159-1333) 1526 (1430-1622) 100
Сорафениб + сунитиниб 10 х 5 20 х 5 276 (228-324) 288 (226-350) 343 (281-405) 504(404-604) 30* 27* 28* 33*
Примечание. Отличие от контроля достоверно, *р < 0,05. Контроль: измерения опухолей после перевивки (сутки): 1—18, 2—20, 3—22, 4—27. Расчет Т/С, % (сутки после окончания лечения): 1, 3, 5, 10.
таблица 4. Воспроизводимость чувствительности п/к ксенографта перевиваемого рака почки человека РПоч1 к ингибиторам тирозинкиназ
Группы разовая доза* Средний объем опухоли на сутки после трансплантации т/С, %, на сутки после окончания лечения
18 20 22 27 1 3 5 10
Контроль Вода 0,3 мл 1068 (868- 1268) 1341 (1161-1521) 1418 (1242-1594) 2015 (1801-2229) 100
1-й опыт: сорафениб + сунитиниб 10 х 5 20 х 5 276 (228- 324) 288 (226-350) 343 (281-405) 504(404-604) 30* 27* 28* 33*
2-й опыт: сорафениб + сунитиниб 10 х 5 20 х 5 374 (276- 472) 388 (292-484) 397 (319-475) 605(515-695) 35* 29* 28* 30*
Примечание: п = 10—12, лечение ежедневно на 3-18-й дни после трансплантации опухоли, *р < 0,05.
и мозговой слои (рис. 2). В корковом слое видны почечные тельца (клубочки), окруженные тонкой капсулой и содержащие мелкие кровеносные сосуды (капилляры). Клубочки окружены большим количеством извитых канальцев, являющихся частью нефрона. В мозговом слое преобладают продольно расположенные канальцы. В почке имеются кровеносные сосуды, местами полнокровные. Почка окружена капсулой. В ткани почки обнаружены 1—2 участка разрастания опухоли. Эти участки мелкие, располагаются под капсулой, состоят из полиморфных опухолевых клеток, растущих в виде солидных полей. В отдельных участках опухоли встречаются единичные митозы. На 21-е сутки после трансплантации опухолевые разрастания крупные, занимают большую часть ткани почки. Ее сохранившиеся участки содержат извитые и прямые канальцы, почечные клубочки, кровеносные сосуды. Местами почечная ткань сдавлена. Опухоль состоит из крупных полиморфных клеток, образующих солидные поля, которые в некоторых местах разделены тонкими соединительно-тканными прослойками, имеются единичные мелкие очаги некрозов. Во многих участках опухоли встречаются митозы, их количество достигает 10—15 в 1 очаге.
На 21-е сутки максимальный объем опухолевых узлов составил 936,0 мм3 при Ур = 608,0 ± 157,0 мм3.
Гистологическая картина опухолевых узлов РПоч1 в ткани почки на 14-е и 21-е сутки после трансплантации показала следующее. На 14-е сутки после ор-тотопической трансплантации рака почки человека РПоч1 в ткани почки различаются корковый
рис. 1. Опухолевые узлы ортотопического ксенографта перевиваемого рака почки человека РПоч1 на 14-е сутки после трансплантации, максимальный объем 486,0 мм3
Результаты морфологического исследования дают основание считать, что период между 14-ми и 21-ми сутками опухолевого роста в почке является наиболее благоприятным для проведения терапии, направленной на подавление цитопролиферации ортотопической опухоли.
определение показателей иммунологического надзора при ортотопическом росте подкожного рака почки человека рПоч1 у мышей Balb/c nude
Иммунологические показатели мышей Balb/c nude c ортотопическим ксенографтом перевиваемого рака почки человека РПоч1 представлены в табл. 6 и на рис. 3 и 4. Результаты иммунофенотипирования спленоцитов селезенки иммунодефицитных мышей с ортотопически трансплантированным ксенографтом перевиваемого рака почки человека РПоч1 представлены в табл. 6. Видно, что на 14-е сутки после трансплантации уровень экспрессии маркеров иммунитета у мышей возрастает: NK1.1 — в 1,5 раза, CD8а — в 3,3 раза. Показатели активации макрофа-гального звена и маркеры активационных антигенов CD38 и MHC II свидетельствуют о тенденции к снижению числа клеток, экспрессирующих эти антигены.
Рисунок в формате DotPlot: ось х, у — логарифмическая шкала, интенсивность флуоресценции MFI представляет экспрессию поверхностных клеточных маркеров, конъюгированных с FITC или PE.
Полученные данные свидетельствуют о том, что на фоне некоторого оживления исходно дефектного врожденного иммунитета гибридных иммунодефи-цитных мышей Balb/c nude ортотопический ксено-
таблица 5. Кинетика роста ортотопического ксенографта перевиваемого рака почки человека РПоч1 у иммунодефицитных мышей Balb/c nude
номер мыши объем опухоли (мм3), 1 пассаж на сутки после имплантации фрагмента
7 14 21 28
1 3,0 270,0 840,0 2808,0
2 3,0 160,0 420,0 2244,0
3 3,0 486,0 936,0 -
4 9,0 288,0 280,0 -
5 4,0 120,0 539,0 -
6 3,0 120,0 448,0 -
7 6,0 210,0 504,0 -
8 6,0 192,0 864,0 -
9 6,0 140,0 648,0 -
10 4,0 168,0 - -
Среднее арифм. 5,0 ± 1,0 215,0 ± 88,0 608,0 ± 157,0 2526,0 ± 750,0
Примечание. Прочерк означает, что исследование не проводилось.
графт перевиваемого рака почки человека РПоч1 в стадии активной пролиферации вызывает иммуно-депрессию, характерную для начала диссеминиро-ванного процесса.
«¿и .. ";<
; tf ¿г- / * А * У 'Ш bi> %
рис. 2. Почка с ортотопическим ксенографтом перевиваемого рака почки человека РПоч1 на 14-е сутки после трансплантации, у. 200
таблица 6. Субпопуляции спленоцитов, экспрессирующих поверхностные антигены у иммунодефицитных мышей Balb/c nude с ортотопи-ческим ксенографтом перевиваемого рака почки человека РПоч1
маркер интактные животные (M ± m) Животные с трансплантированным раком почки рПоч1 (M ± m)
CD3 0,0 0,0
CD4 0,0 0,0
CD8a 3,8 ± 1,6 12,4 ± 1,1
NK1.1 4,5 ± 1,6 6,9 ± 1,7
CD19 25,3 ± 3,7 21,8 ± 2,9
CD40 51,3 ± 4,4 41,8 ± 1,6
CD80 6,5 ± 2,9 9,0 ± 2,2
CD86 43,4 ± 2,6 30,1 ± 3,2
CD38 44,0 ± 3,1 40,2 ± 2,4
MHC II 24,4 ± 1,6 13,1 ± 1,5
Примечание. Поверхностные клеточные маркеры: СВ3 — зрелые Т-лимфоциты; СВ4 — Т-хелперы; N^.1 — натуральные киллеры; СВ8а экспрессируется на НК-клетках, есть данные об экспрессии на незрелых дендритных клетках (ДК); СВ19 — В-лимфоциты; СБ40 — ко-стимулирующая молекула антигенпрезентирующих клеток (АПК); СВ80 — костимулирующая молекула АПК, может экспрессироваться на активированных В-лимфоцитах; СВ86 — костимулирующая молекула АПК, может экспрессироваться на активированных В-лимфо-цитах; СВ38 — активационный антиген, экспрессируется на НК-клетках, В-лимфоцитах; МНС II — молекула гистосовместиости II класса, ограниченно экспрессируется на клетках некоторых типов, включая дендритные клетки и В-лимфоциты.
■
60
50
40
30
CD3 CD4 CD8a NK1.1 CD19 CD40 CD80 CD86 CD38 MHCII
рис. 3. Содержание различных субпопуляций спленоцитов у мышей Balb/c nude с ортотопическим ксенографтом перевиваемого рака почки человека РПоч1 и у интактных мышей
Заключение
В результате проведенных исследований на иммунодефицитных мышах Balb/c nude разведения ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России разработана новая оригинальная методика получения ортотопического ксенографта, позволяющая оптимизировать технологию SOI. Воспроизводимый орто-топический рост п/к ксенографта рака РПоч1 человека в почке иммунодефицитной мыши Balb/c nude получен с помощью трансплантационных манипуляций под контролем таких биологических характерис-
тик, как прививаемость, контроль параметров роста, элементы иммунологического надзора и чувствительность к ингибиторам специфических тирозин-киназ. Принципиальным отличием методики от SOI, использующей опухолевый материал от пациента в качестве имплантата, является имплантат в виде п/к ксенографта с гарантированной 100 % ортото-пической имплантацией, воспроизводимыми биологическими, в том числе иммунологическими, характеристиками и известной лекарственной чувствительностью. Это открывает возможность не только
< ш
ф
■ ■■ MU-I'VL'JIJI <*
FITC-A
spleen conlrol j-uusajuua j
ж
COSi FfTC-A енд splasn 2-СРЗЛМКМ
к?' ю5 ш
COS FlTC-A
к? 19*
СОЭ FfTC-A
ijjlesn (Ortlrfll I-CD38iCD36
4
is1 in" is" CO 30 FITC-A
t о
at
о
>1
ш
;.' BL Q4
II*
м
ID
CD 4 FfTC-A spleen еопШ 2-CD19МНСИ
■у™?
IB 1(г ЯГ COlS FlTC-А
еуд spleen 2-CD£3fCDB0
CO* FiTC-A
r
о so
J, tfr- Sw ■■
Hi! if
еч>?д1еепг-со1амнси
СОЭ8 FtTC-A
Ттдгт пяг
10 11 IJ* COI9 FfTC-A
Рис. 4. Экспрессия различных маркеров (данные проточной цитометрии) на субпопуляции спленоцитов мышей Balb/c nude с ортотопическим ксенографтом перевиваемого рака почки человека РПоч1 и у интактных мышей: а — интактные животные, контроль; б — интактные животные, двойная метка CD3/NK1.1; в — интактные животные, двойная метка CD4/CD40; г — интактные животные, двойная метка CD8а/CD80; д — интактные животные, двойная метка CD38/CD86; е — интактные животные, двойная метка CD19/MHCII; ж — животные с трансплантированной опухолью, CD3/NK1.1; з — животные с трансплантированной опухолью, двойная метка CD4/CD40; и — животные с трансплантированной опухолью, двойная метка CD8а/CD80; к — животные с трансплантированной опухолью, двойная метка CD38/CD86; л — животные с трансплантированной опухолью, двойная метка CD19/MHCII
а
в
д
г
е
з
и
к
л
исследовать на такой модели антиметастатическое действие агентов и составлять прогноз эффективности, но и отрабатывать на доклиническом этапе
биодоступность новых средств, в том числе иммунологических, или комбинаций, направленных на лечение этой патологии.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Survey of antitumor and toxicity test systems. EORTC. Screening and Pharmacology Group 1989; Oct.: 23—25.
2. Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К. и др. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств. В кн.: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К, 2012. С. 642-657.
3. Трещалина Е.М. Коллекция опухолевых штаммов человека. Под ред. М.И. Давыдова. М.: Практическая медицина, 2009. C. 37-38.
4. Самойленко И.В., Харкевич Г.Ю., Демидов Л.В. Применение блокатора рецепторов CTLA4 в лечении больных метастатической меланомой.
Российский медицинский журнал 2015;1:4-9.
5. Носов Д.А. Рак почки. В кн.: Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний. Под ред. Н.И. Переводчиковой,
В.А. Горбуновой. М.: Практическая медицина, 2015. С. 294-300.
6. Anticancer Drug Development Guide. Preclinical screening, clinical trials, and approval. Ed. by B.A. Teicher,
P.A. Andrews. 2nd ed. Totowa. NJ: Humana Press, 2004. 450 p.
7. Michel S.M., Vervenn E.W., De Santis M. et al. SWITCH: A randomized sequential open-label study to evaluate efficacy safety of sorafenib (SO)/ sunitinib (SU) versus SU/SO
in the treatment of metastatic renal cell cancer (mRCC). J Clin Oncol 2014;32
(4):393. DOI: 10.1016/j. eururo. 2015.04.017. PMID: 25952317.
8. Rini B.I., Escudier B., Tomczar P. et al. Comparative effectiveness of axitinib versus sorafenib in advanced renal cell carcinoma (AXIS): a randomised phase 3 trial. Lancet 2011;378(9807):1931-9. DOI: 10.1016/S0140-6736(11) 61613-9. PMID: 22056247.
9. Трещалина Е.М. Иммунодефицитные мыши разведения РОНЦ им.
Н.Н. Блохина РАМН. Возможности использования. М.: Издательская группа РОНЦ, 2010. 10. Шубина И.Ж., Чикилева И.О.,
Михайлова И.Н. и др. Активированные натуральные киллеры в клеточной иммунотерапии. Российский иммунологический журнал 2012;6 (15);1:71-9.
