CC BY
118
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ МОДЕЛИ ДЛЯ ДОКЛИНИЧЕСКОГО... 55
УДК 615.277.3.015.44:616-006-097.1:616-092.4 Д.В. Соколова, ЕМ. Трещалина, Н.В. Андронова, Е.В. Степанова, В А. Голубева, АЮ. Барышников МОДЕЛИ ДЛЯ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ IN VIVO ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ТАРГЕТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ АНТИГЕНА MUC1
РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация:
Соколова Дарина Вадимовна, аспирант лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(495)324-10-65 e-mail: d.v.sokolova@gmail.com
Статья поступила: 21.07.2010, принята к печати 22.07.2010.
Резюме
Одной из мишеней для направленного действия современных «таргетных» противоопухолевых лекарств является антиген MUC1, гиперэкспрессия которого определяет возможность запуска программы клеточной гибели в клетках наиболее распространенных злокачественных опухолей человека, например, рака молочной железы и яичников. Направленная доставка противоопухолевых препаратов с помощью иммунолипосомальных транспортных систем, несущих антитела к этому антигену, представляет собой один из путей реализации тар-гетной стратегии, направленной на антиген MUC1. Для доклинических исследований таких препаратов нами разработаны две опухолевые модели рака молочной железы T47D и яичников SKOV3 на иммунодефицитных мышах Balb/c nude, которые охарактеризованы с помощью иммуноморфологических методов по экспрессии MUC1 и другим терапевтически значимым молекулярным маркерам в зависимости от длительности пассирования на мышах. Установлен стабильный уровень экспрессии антигена MUC1 в обеих моделях на протяжении 5 пассажей, а также высокая ангиогенная активность опухолей, позволяющая выполнять системную терапию. Полученные данные позволяют рекомендовать рак молочной железы T47D и рак яичников SKOV3 в качестве доклинических моделей для изучения специфической противоопухолевой активности иммунолипосомальных препаратов, направленных против антигена MUC1.
Ключевые слова: антиген MUC1, подкожные ксенографты, опухоли человека, иммунодефицитные мыши, иммуноморфология.
D.V. Sokolova, E.M. Treshalina, N.V. Andronova, E.V. Stepanova, V.A. Golubeva, A.Yu. Barushnikov DEVELOPMENT OF IN VIVO MODELS FOR PRECLINICAL STUDYING OF ANTIPROLIFERATIVE EFFECT OF DRUGS DIRECTED AGAINST MUC-1 ANTIGEN
N.N Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
Abstract
The MUC1 antigen is one of the targets for directed delivery of anticancer drugs. It is long known that overexpression of this antigen participates at the activation of program cell death in most malignant cells including breast cancer and ovarian cancer cells. The directed delivery of immunoliposomal anticancer drugs carrying monoclonal antibodies raised against this antigen is one of the ways to realize the target strategies to MUC1 antigen. We have developed the breast and ovarian cancer models based on transplantation of T47D or SKOV3 cells into immunodeficient mice Balb/c nude to examine the effect of anticancer drugs. We have characterized these two models by immunofluorescent staining of MUC1 expression in the experimental animal models. We have also followed the expression of angiogenic markers, depending on the duration of passages in mice. The stable expression of MUC1 antigen in both models was observed in all of 5 passages as well as the high angiogenic activity of tumors. , Based on data obtained, we suggest that these two models allow to perform systemic therapy of tumor and could be recommended to screen anticancer activity of immunoliposomal drugs directed against to MUC1 antigen.
Key words: MUC1 antigen, subcutaneous xenografts, human tumors, immunodeficient mice, immunomorphology.
Введение
Лиганд-опосредованная доставка препарата в опухоль является эффективной стратегией, направленной на повышение его терапевтической активности [8]. В РОНЦ им. Н.Н. Блохина разрабатываются новые лекарственные иммунолипосо-мальные формы цитотоксических препаратов, имеющих на поверхности «адресную метку» - МКА к поверхностному опухолевому антигену. Одной из «мишеней» создаваемых иммунолипосомальных препаратов является муциноподобный антиген МиС1 [5]. В норме при дисплазиях и доброкачественных опухолях он локализуется в апикальной части мембраны эпителиальной клетки. При раковом процессе для антигена в основном характерна
выраженная экспрессия по всей мембране и в цитоплазме клеток. Она сохраняется при малигнизации эпителия молочной и щитовидной железы, яичника, матки, легких, пищевода, желудка, толстой и прямой кишки, почки.
Гиперэкспрессия МиС1, как правило, сопровождается плохим прогнозом, что может быть обусловлено антиадгезивными свойствами гликопротеина и активацией метастазирования [1; 5; 6]. Для определения специфического противоопухолевого действия адресных форм противоопухолевых препаратов против антигена МиС1 необходимы адекватные модели на животных с адекватными кинетическими параметрами, а также способностью к неоваскуляризации для обеспечения эффективной доставки препарата к мишени.
В качестве специфической характеристики на поверхности опухолевых клеток обязательна стабильная селективная гиперэкспрессия поверхностных антигенов, к которым специфичны моноклональные антитела, конъюгированные с липосомами [2; 7].
Работа посвящена разработке доклинических опухолевых моделей in vivo с помощью MUC1+ клеточных линий аденокарциномы яичников SKOV3 и молочной железы T47D для оценки эффективности «таргетных» препаратов, направленных против антигена MUC1.
Материалы и методы
Лабораторные животные
Использовали 50 конвенциональных мышей-самок Balb/c nude 8-10 нед, массой тела 18-21 г разведения РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Мышей содержали в SPF-зоне специализированного кондиционированного отсека лаборатории комбинированной терапии опухолей НИИ ЭДиТО РОНЦ при нормированном температурно-влажностном режиме на стерильном экструдированном корме («МЭСТ», РФ), стерильной воде и стерильной бумажной подстилке. Для введения в эксперимент мышей ранжировали по массе тела с разбросом не более 10 % у разных особей (n=3).
Клеточные линии
SKOV3 - аденокарцинома яичников человека; T47D - карцинома молочной железы человека. Клеточные линии получены из банка клеточных культур РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.
Условия культивирования
Клеточные линии выращивали в полной питательной среде при 37 °С в атмосфере 5 % СО2. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста.
Трансплантация ксенографтов
Первый пассаж выполняли из культуры клеток в стандартных прививочных дозах. Для получения 1 пассажа опухоли на мышах культуры клеток SKOV3 и T47D имплантировали п/к 5x10 клеток на мышь. Повторные пассажи выполняли взвесью опухолевой ткани (инокулят), полученной из подкожных узлов предшествующего пассажа по 60 мг на мышь в 0,5 мл питательной среды 199. Взвесь опухоли готовили по стандартной методике, принятой в РОНЦ. Всего выполнено по 5 пассажей с интервалом 15-18 дней. Это позволяло при одном культуральном пассаже получить достаточно опухолевого материала для необходимых исследований.
Определение
основных биологических характеристик
п/к ксенографтов
В эксперименте выполняли: мониторинг кинетики роста опухолей под кожей мышей и гистологическое исследование строения опухолевых узлов (морфологический контроль), иммунофенотипиче-ское исследование опухоли для верификации экспрессии MUC1 антигена; определение основных маркеров неоангиогенеза в опухоли.
Мониторинг
роста п/к ксенографтов на мышах
Для выявления п/к опухолевых узлов у мышей проводили визуальное наблюдение, а также периодическую пальпацию места имплантации или трансплантации и наблюдение за характером роста в тече-
ние не менее месяца. Пальпируемые узлы многократно измеряли и рассчитывали объем в динамике (V = ахЬхе, мм3), что позволило рассчитать средние объемы (Уср), а также относительную скорость роста опухолевых узлов, как соотношение объемов;
n - номер измерения.
По этим параметрам строили кривые и определяли в качестве стандартных показателей роста опухоли длительность латентного периода (отсутствие пальпируемых опухолей), экспоненциальной фазы (>3-кратное увеличение) и стационарной фазы (отсутствие динамики роста или <3-кратное увеличение). Критерии стандартности модели: 100% прививаемость опухоли и продолжительность жизни мышей с опухолью.
Морфолологическое исследование
Опухолевый материал фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24-48 ч. Затем промывали в проточной водопроводной воде, фиксировали в 5 сменах этанола по 1-2 ч, в 2 сменах ксилола по 20 мин и в смеси ксилол/парафин 1 ч. Готовые срезы пропитывали парафином в течение 2 ч и заливали в парафин. Депарафинированные срезы толщиной 6-8 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. О ПА судили по числу Ki-67-положитель-ных на 200-300 опухолевых клеток. Использовали антитела к Ki-67 [MIB-1] (DAKO). Индекс Ki-67 определяли по формуле:
_ n Ki-67+ клеток х 100 ПА =-------------------------
n - общее - клеток
Иммунофенотипическое исследование
Опухолевый материал от каждого пассажа типировали с помощью прямой реакции поверхностной иммунофлуоресценции. В исследовании использовали стандартные МКА: CD227 (BD Biosciences), изотипический контроль, коньюгированный с FITC (Beckman Coulter).
Прямая реакция
поверхностной иммунофлуоресценции
Клетки (0,5-1х106) дважды отмывали и ресус-пендировали в PBS с рН=7,4. Затем инкубировали с МКА в течение 30 мин в темноте при 4 °C. После этого клетки дважды отмывали PBS при рН=7,4 и ресуспедировали в PBS, содержащем 1%-ный формалин. Клетки анализировали на проточном цитоф-луориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США).
Определение
основных маркеров неоангиогенеза
Проводили с помощью иммуногистохимиче-ского анализа срезов парафиновых блоков опухолей. Ангиогенную активность опухоли определяли как по экспрессии белков, запускающих процесс ангиогенеза HIF-1a и VEGF, лимфангиогенеза -VEGFR-3 (для T47D), так и по количеству микрососудов в опухоли. Срезы депарафинировали и ре-гидратировали по стандартной методике. Для «демаскировки» антигенов проводили прогревание срезов в предварительно нагретом до 95-99 °С в 10 мМ цитратном буфере в течение 30 мин.
Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы инкубировали 10 мин в темноте с 3% перекисью водорода. Для блокирования неспецифического связывания антител срезы инкубировали 15 мин с 1% раствором бычьего сывороточного альбумина. Инкубацию с первичными антителами проводили при 40 °С в течение 16 ч. Использовали антитела к HIF-1a [Hlalpha 67] (Abcam), VEGF [C-1] (Santa Cruz Biotech), VEGFR-3 [AFL4] (BD Pharmingen), CD31 [polyclonal] (Abcam). Инкубацию с проявочной тест-системой [ARK® (Animal Research Kit) Peroxidase или Envision®+kit, DAKO] проводили при комнатной температуре в течение 20 мин, затем срезы промывали 2 раза по 5 мин. Для визуализации ИГХ-реакции использовали DAB+ систему [DAKO]. Реакцию проводили в темноте в течение 5-10 мин. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в канадский бальзам. Оценку результатов окрашивания проводили с применением светового микроскопа «Nikon» (Япония) под увеличением х20, х40. Для маркеров VEGF, VEGFR-3 и HIF-1a оценивали локализацию окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма, мембрана) и интенсивность иммунного окрашивания. Количество положительных клеток оценивали в зонах, содержащих их максимальное количество. Опухоль считали VEGF+ при окрашивании цитоплазмы >25 % опухолевых клеток. Количество сосудов, окрашенных антителами к CD31, оценивали не менее чем в трех полях зрения, содержащих максимальное количество сосудов.
Статистическая обработка данных Выполняли с использованием компьютерной программы “BIOSTAT” (Version 3.2), Microsoft Excel, Statistica v.5.0. Статистически достоверными считали различия при р<0,05.
Завершение экспериментов Мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза в соответствии с международными требованиями этики при работе с лабораторными животными.
Результаты и обсуждение
Мониторинг
кинетики роста п/к ксенографтов SKOV3 in vivo
У 3 мышей, которым трансплантировали по 60 мг опухолевой ткани, подкожные узлы появились к 8 дню (латентный период) после имплантации, Vср=131 [78+185] мм3.
К 15 дню опухоль увеличилась в 3,6 раза, Vср=480 [408+554] мм3 (экспоненциальная фаза). В период с 15 по 30 день установилась стационарная фаза роста (продолжительность 15 дней): на 21 день Vср=1439 [1048+1830] мм3 (увеличение в 2,9 раза), на 30 Vср=2643 [1806+3480] мм3 (увеличение в 1,8 раз; рис. 1).
Выявленная динамика роста SKOV3, имплантированная первично культурой клеток и пассированная трижды на мышах разведения РОНЦ, была идентична результатам мониторинга развития первично трансплантированных подкожных ксеногра-фтов из Коллекции РОНЦ [3; 4].
Гистологическая
характеристика п/к ксенографтов SKOV3 у мышей-самок Balb/c nude (3 пассаж) Опухоль состоит из сплошного пласта крупных, полиморфных клеток, разделенных узкими прослойками соединительной ткани (рис. 2). Ядра
овально-округлой формы. Редко встречаются железистоподобные структуры. Имеются многочисленные сосуды. Фигуры митоза не многочисленны (2-3 в поле зрения).
Выявлен относительно высокий уровень пролиферативной активности (индекс Ki-67 >50%) (рис. 3).
Иммунофенотипическая характеристика п/к ксенографтов SKOV-3 В культуре клеток, использованных в качестве инокулята для первого пассажа на мышах, исходно выявлен высокий уровень экспрессии антигена MUC1 97±6 % (рис. 4).
На протяжении 5 пассажей уровень экспрессии MUC1 оставался стабильно высоким и составлял соответственно: 1 - 96,8 %, 2 - 89,3 %, 3 - 91,6 %, 4 - 97,0 % и 5 - 92 % (рис. 5 А-Д).
Определение ангиогенной активности п/к ксенографтов SKOV-3 Гипоксия является одним из основных механизмов запуска ангиогенеза в злокачественных опухолях. Происходит активация метаболических путей, регулируемых такими белками, как индуцируемый гипоксией фактор 1 (HIF-1a), что ведет к увеличению экспрессии проангиогенных факторов, включая VEGF. В условиях гипоксии происходит стабилизация белка HIF-1a, что делает возможным его детекцию иммуногистохимическим методом. Наши исследования показали, что значимых различий в накоплении HIF-1a в цитоплазме и ядре опухолевых клеток от пассажа к пассажу нет. Иммунное окрашивание наблюдалось в 80-100 % опухолевых клеток (рис. 6А). Экспрессия основного фактора ангиогенеза VEGF наблюдалась в цитоплазме 60-70 % опухолевых клеток, интенсивность окрашивания и количество положительных клеток значимо не изменялась на протяжении всего периода пассирования (рис. 6Б). Среднее количество микрососудов в опухоли, выявленных антителами к CD31, составило 4±2 в поле зрения при увеличении х40 (рис. 6В) и значимо не изменялось от пассажа к пассажу. Таким образом, стабильно высокая экспрессия факторов неоангиогенеза в п/к ксенографтах SKOV3 на протяжении 5 пассажей указывает на высокую ангио-генную активность этой опухолевой модели.
Мониторинг кинетики роста п/к ксенографтов T47D in vivo
1 пассаж получен имплантацией 1х107 клеток T-47D на мышь. К 9 дню (латентный период) получен 100 % выход опухолей, ^р=266 [257+275] мм3. К 15 дню объем увеличился в 3 раза, V^=817 [705+929] мм3 (экспоненциальная фаза 6 дней). Затем рост опухолей замедлился, и с 15 по 22 день объем опухоли увеличился до ^р=1912 [1448+2376] мм3 (в 2,3 „раза). В период 22-30 дней V^=2307 [1551+3063] мм (увеличение в 1,2 раза). Таким образом, стационарная фаза составила 15 дней (рис. 7).
Гистологическая характеристика п/к ксенографтов T47Dу мышей-самок Balb/c nude
Опухоль состоит из солидных внутрипротоко-вых пролифератов, разделенных стромой. Протоки выполнены полиморфными клетками с круглыми ядрами (рис. 8). Характерны многочисленные фигуры митоза (2-10 в поле зрения). Строма опухоли рыхлая, хорошо развита. Имеются многочисленные сосуды. Выявляется высокий уровень пролиферативной активности, индекс Ki-67 -100% (рис. 9).
Сутин п«л* трлнеялаитлции рлуяоли
Рис. 1. Динамика роста 3 пассажа п/к ксенографта SKOV3y мышей-самок Balb/cnude.
Рис. 7. Динамика роста 1 пассажа п/к ксенографта T47D у мышей-самок Balb/c nude.
Рис. 11. Гистограммы распределения клеток п/к ксенограф-тов Т47Б (1—5-й пассажи, А-Д соответственно) по экспрессии МиС1 антигена:
по оси абсцисс - количество клеток; по оси ординат - интенсивность флуоресценции; закрашенная гистограмма - изо-типический контроль; прозрачная гистограмма - исследуемый антиген.
- и ь -и
Рис. 4. Гистограммы распределения клеток линии БКОУ-З по экспрессии антигена М11С1:
по оси абсцисс - количество клеток; по оси ординат - интенсивность флюоресценции; закрашенная гистограмма - изотипический контроль; прозрачная гистограмма - исследуемый антиген.
Рис. 10. Гистограммы распределения клеток линии Т47Б по экспрессии МиС1 антигена:
по оси абсцисс - количество клеток; по оси ординат - интенсивность флуоресценции; закрашенная гистограмма - изотипический контроль; прозрачная гистограмма - исследуемый антиген.
Рис. 5. Гистограммы распределения клеток п/к ксенографтов БКОУ-З (1—5-й пассажи, А-Д соответственно) по экспрессии М11С1 антигена:
по оси абсцисс - количество клеток; по оси ординат - интенсивность флуоресценции; закрашенные гистограммы - изотипический контроль; прозрачные гистограммы - исследуемый антиген.
П.1+1
Иммунофенотипическая характеристика п/к ксенографтов Т47Б В культуре клеток Т47Б, использованных в качестве инокулята для первого пассажа на мышах, исходно выявлен высокий уровень экспрессии антигена МиС1 98±2 % (рис. 10).
На протяжении всего 5 пассажей уровень экспрессии антигена МиС1 оставался стабильно высоким и составлял соответственно: 1 - 100 %, 2 -95 %, 3 - 94 %, 4 - 90,8 %, 5 - 98,9 % соответственно (рис. 11 А-Д).
Определение
ангиогенной активности п/к ксенографтов Т47Б
Полученные результаты выявили иммунное окрашивание в 80-100 % опухолевых клеток на протяжении всего периода пассирования.
Выводы
Интенсивность окрашивания антителами к Ы1Р-1а была выше в центральной, чем в периферической части опухоли (рис. 12 А).
Экспрессия УЕСР была высокой в стромаль-ном компоненте, интенсивность окрашивания значимо не изменялась на протяжении всего периода пассирования (рис. 12 Б).
С помощью антител к УЕСРК-3 на всех пассажах выявляется небольшое количество лимфосо-судов (1-2 в поле зрения) (рис. 12 В). Среднее количество микрососудов в опухоли, окрашенных антителами к СБ31, составило 7±2 в поле зрения при увеличении х40 (рис. 12 Г) и значимо не изменялось от пассажа к пассажу.
Таким образом, стабильно высокая экспрессия факторов неоангиогенеза в п/к ксенографтах Т47Б на протяжении 5 пассажей позволяет признать данную опухолевую модель высоко ангиогенной.
1. Клетки карциномы молочной железы линии T47D адаптированы к росту на иммунодефицитных мышах-самках Balb/c nude разведения РОНЦ в виде подкожных ксенографтов.
2. П/к ксенографты SKOV3 и T47D:
- в течение 5 пассажей на мышах Balb/c nude имеют стабильно высокий уровень экспрессии антигена MUC1 и пригодны для оценки противоопухолевого действия адресных препаратов, направленных против антигена MUC1;
- обладают высоким уровнем экспрессии факторов ангиогенеза VEGF, HIF-1a и CD31, а в случае T47D, также VEGFR-3 и могут быть использованы для доклинического изучения противоопухолевых препаратов, направленных на ингибирование ангиогенеза;
- на протяжении 5 пассажей имеют стабильную плотность микрососудов, однако опухолевая модель рака молочной железы T47D характеризуется более высокой степенью васкуляризации;
- по прививаемости, динамике роста и ангиогенезу адекватны задачам доклинического изучения противоопухолевых агентов, предназначенных для системной терапии.
Литература
1. Полосухина Е.Р., Барышников А.Ю. Моноклональные антитела: путь от разработки до клинического применения. - Под ред. Давыдова М.И., Барышникова А.Ю. - М.: Издательская группа РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 2003. - С. 525-7.
2. Соколова Д.В., Степанова Е.В., Голубева В А. и др. Основные биологические характеристики ксенографтов лимфомы человека ЛБР-2 как мишени для таргетной терапии // Российский Биотерапевтиче-ский Журнал. - 2010. - T. 9, № 1. - C. 49-52.
3. Трещалина ЕМ. Коллекция опухолевых штаммов человека / Под ред. Давыдова М.И. - М.: Практическая медицина, 2009. - 171 с.
4. Филоненко Д.В, Андронова Н.В., Трещалина Е.М. и др. Разработка моделей для доклинического исследования новых адресных препаратов против HER2/NEU // Российский Биотерапевтический Журнал. -2007. - T. 6, № 2. - C. 33-9.
5. Feng H, Ghazizadeh M, Konishi H. et al. Expression of MUC1 and MUC2 mucine gene products in human ovarian carcinomas // Jpn. J. Clin. Oncol. - 2002. - Vol. 32(12). - P. 525-9.
6. Moase E.H., Qi W, Ishida T. Anti-MUC-1 immunoliposomal doxorubicin in the treatment of murine models of metastatic breast cancer // Biochimica et Biophysica Acta. - 2001. - Vol. 1510. - P. 43-55.
7. Vingerhoeds M.H., Storm G., Crommelin Daan J.A. Immunoliposomes in vivo // Immunomethods. - 1994. -Vol. 4. - P.259-72.
8. Sapra P., Allen T.M. Improved outcome B-cell lymphoma is treated with combinations of immunoliposomal anticancer drugs targeted to both the CD19 and CD20 epitopes // Clinical Cancer Research. - 2004. -Vol. 10. -P. 2530-7.
Издание 2-е, переработанное и дополненное
ЭНЦИКЛОПЕДИЯ
КЛИНИЧЕСКОЙ
ОНКОЛОГИИ
Готовится к печати Издательская группа РОНЦ
