CC BY
8УДК 612.646.014.46
А-В.Лобанов1*, О.Н.Хохлова1, Л.АЛахарова1, И.Ю.Зарайская2, А-Н.Мурашев1
МОДЕЛЬ ДЛЯ АНАЛИЗА НЕЙРОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НА ЭМБРИОНАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ ПО ОЦЕНКЕ СОМАТОСЕНСОРНОГО
СОЗРЕВАНИЯ У МЫШЕЙ
Лаборатория биологических испытаний, Филиал института биоорганической химии им.
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино 2Отдел системогенеза, НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН, Москва
Для создания модели нарушения эмбрионального развития мышей использовалось стандартное вещество ци-тозинарабиноза (Ага-с), которое является ингибитором синтеза ДНК и обладает сильным цитотоксическим свойством в отношении делящихся клеток. Вещество вводилось в критический период развития коры мозга мышей. Изучались последствия введения Ага-с на 12,5—13,5 пренатальные сутки и на 13,5—14,5 пренатальные сутки в отношении соматосенсорного развития у мышей в постнатальный период. Для тестирования потомства использовали модифицированную батарею Фокса. В результате работы было показано, что такая разница в сроках введения вещества приводит к разным нейротоксическим нарушениям у потомства, обнаруженным в ряде сенсомоторных тестов. Данная модель позволяет проводить тонкий анализ нейротоксического действия новых фармакологических веществ на эмбриональное развитие мышей.
Ключевые слова: мыши С57БЬ/6, беременность, цитозинарабиноза, нейротоксическое действие, фармакологическая модель.
Введение. Изучение антенатального повреждающего нейротоксического действия фармакологических веществ при помощи поведенческих тестов в постнатальный период развития потомства возможно двумя методическими подходами. Первый метод называется кросс-секционным и заключается в поэтапном тестировании животных в определенном возрасте в соответствии с постепенным развитием поведения в постнатальный период. Он позволяет оценить наиболее серьезные нарушения развития животных на последних этапах формирования изучаемых признаков [11]. Этот подход лег в основу международных OECD (Organisation for Economie Co-operation and Development) [4] и американских EPA (U.S. Enviromental Protection Agency) [7] руководств по изучению антенатального повреждающего нейротокси-ческого действия фармакологических веществ на потомстве животных. В отечественной доклинической практике в подобных исследованиях возможно использование как кросс-секционного, так и второго — лонгитудинального метода, который позволяет оценивать изучаемый показатель в динамике в течение нескольких дней его формирования [2]. Причем, в соответствии с отечественными и зарубежными протоколами по изучению антенатального повреждающего действия веществ, исследования преимущественно проводятся на крысах; исполь-
* Фрагмент диссертационной работы
зование других видов животных возможно, но требует корректировки методов и сроков исследования. В нашей работе применялся лонгиту-динальный метод, специально разработанный для исследования постнатального развития мышей и позволяющий оценить соматический и неврологический статус у развивающихся животных. Для его апробации была использована модель фармакологического нарушения развития коры мозга в эмбриональном периоде у мышей [5, 10, 12]. В качестве нейротоксическо-го агента использовалось стандартное вещество — цитозинарабиноза (Ara-c), которое является ингибитором синтеза ДНК и обладает мощным тератогенным действием [8, 9, 10].
Целью работы было оценить адекватность метода для использования в изучении антенатального повреждающего действия веществ.
Материалы и методы исследования. В экспериментах использовали мышей C57BL/6 SPF-статуса, полученных из питомника лабораторных животных ФИБХ РАН, Пущино. У самок получали датированную беременность. На 12,5 и 13,5 эмбриональные сутки (ЭС) самкам первой опытной группы и на 13,5—14,5 ЭС — второй опытной группы животных внутрибрюшин-но вводили цитозинарабинозу (1-p-D-Arabino-furanosylcytosine) (Sigma) в дозе 3 мг/кг. Контролем к этим группам служили животные, самки которых получали растворитель — 1% диметил сульфоксид (Dimethyl Sulfoxide (DMSO)) (Servie)
Таблица 1
Распределение животных по группам в эксперименте
Группа Вводимое вещество Эмбриональные сроки введения вещества Количество животных (n)
DMSO 1 растворитель DMSO 12,5-13,5 26
DMSO 2 растворитель DMSO 13,5-14,5 25
DMSO + Ara-c 1 DMSO + Ara-c 12,5-13,5 30
DMSO + Ara-c 2 DMSO + Ara-c 13,5-14,5 30
в те же сроки беременности, что и соответствующая опытная группа (табл. 1).
Для тестирования потомства использовали батарею тестов по оценке развивающегося поведенческого фенотипа мышей, разработанную в НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН [1] и представляющую собой расширенную модификацию батарей сенсомоторных тестов [3, 6]. Тестирование животных проводили непрерывно в период с 1 по 21 сутки после рождения. Все манипуляции с животными осуществляли в соответствии с требованиями институтской комиссии по контролю над содержанием и использованием лабораторных животных.
Результаты и обсуждение. Результаты проведенных тестов позволили оценить влияние Ага-е, введенной в период беременности, на соматическое и соматосенсорное развитие потомства. В работе представлена часть полученных экспериментальных данных.
Наиболее важным показателем соматического развития животных является динамика массы тела. В результате исследования этого показателя было установлено, что при первом сроке введения (12,5—13,5 ЭС) Ага-е не оказывала существенного влияния на физическое развитие потомства. Однако при втором сроке введения (13,5—14,5 ЭС) этого вещества наблюдалось значительное отставание в увеличении массы тела у мышей как по сравнению с соответствующей контрольной группой, так и в отношении первой опытной группы (рис.).
Антенатальное повреждающее нейротокси-ческое действие препарата изучалось по формированию сенсомоторных реакций в постнаталь-ный период. У животных первой опытной группы (DMSO + Ага-е 1) способность переворачиваться на горизонтальной поверхности, а также способность подниматься и спускаться по вертикальному канату характеризовались более бы-
Таблица 2
Изменение показателей сенсомоторного развития у мышей с пренатальным введением Ara-c относительно контроля
Показатель Постнатальные сутки Изменение показателя,%
DMSO + Ara-c 1 DMSO + Ara-c 2
Негативный геотропизм 1 -32*# 10
2 0 0
Переворачивание 2 21*# -5
3 -2 3
Визуальный плейсинг 14 -1 -24**
15 -33* -43**
16 -28* -10
Удержание на вертикальной сетке головой вверх 10 -17*# 0
Удержание на вертикальной сетке головой вниз 10 -37* -47**
11 -29* -24**
12 -2 -10
Подъем по вертикальному канату 10 24* 34**
Спуск по вертикальному канату 13 22* 16**
14 20*# -11
15 22*# 2
Примечания: * — р < 0,05 различия между группами DMSO 1 и DMSO+Ara-c 1 по Фишеру, критерий Chi2 ** — р < 0,05 различия между группами DMSO 2 и DMSO+Ara-c 2 по Фишеру, критерий Chi2 * — р < 0,05 различия между группами DMSO+Ara-c 1 и DMSO+Ara-c 2 по Фишеру, критерий Chi2
0 3 6 9 12 15 18 21
возраст, постнатальные сутки
Рис. Постнатальная динамика массы тела у мышей C57BL/6 с пренатальным введением Ara-c
* - p < 0,05 различия между группами DMSO 1 и DMSO+Ara-c 1 по тесту Ньюмана-Кеулса
** - p < 0,05 различия между группами DMSO 2 и DMSO+Ara-c 2 по тесту Ньюмана-Кеулса
# - p < 0,05 различия между группами DMSO+Ara-c 1 и DMSO+Ara-c 2по тесту Ньюмана-Кеулса
стрыми темпами развития на начальных этапах созревания в сравнении с контрольной группой. В то же время, негативный геотропизм, способность удерживаться на вертикальной сетке головой вверх и вниз, зрительный плейсинг развивались с отставанием по сравнению с контролем на аналогичных начальных этапах (табл. 2).
У животных второй экспериментальной группы (DMSO+Ara-c 2) в формировании способности переворачиваться на горизонтальной поверхности и развитии реакции негативного геотропизма аномалий относительно контроля обнаружено не было. Однако были найдены отставания в формировании визуального плейсинга и способности удерживаться на сетке головой вверх и вниз, а также ускорение в развитии способности передвигаться по канату в обоих направлениях в сравнении с контролем (табл. 2). Межгрупповое сравнение экспериментальных групп мышей с различными сроками пренатального воздействия Ara-c показало, что у животных первой группы по сравнению со второй сенсомоторные нарушении многочисленнее и выраженнее, что свидетельствует о более сильном нейротоксиче-ском действии Ara-c при введении на 12,5—13,5 ЭС. Причем этот эффект выявлен на фоне меньшего физического отставания в развитии. У животных второй группы, несмотря на выраженное отставание в соматическом созревании, нейро-токсическое воздействие Ara-c было ниже.
Заключение. Таким образом, данный метод исследования антенатального повреждающего действия антипролиферативного агента Ara-c позволил выявить токсическое действие вещества и провести его тонкую оценку в зависимости от сроков введения препарата. Причем, нейро-
токсические эффекты были обнаружены на начальных этапах формирования исследуемых показателей развития, что является достоинством лонгитудинального метода исследования.
Список литературы
1. Зарайская И.Ю., Александрова Е.А. Сравнительный подход к изучению системогенеза ранних поведенческих актов // XVIII съезд физиологического общества им И.П.Павлова: тез. докл. — Казань, 2001. — С. 93.
2. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Р.У.Хабриева. — 2-изд, перераб. и доп. — М.: Медицина, 2005. — 832 с.
3. Altman J. Postnatal development of locomotion in the laboratory rat//Anim. Behav, 1975. — V. 23. — Р. 896-920.
4. Draft Test Guideline 426: Developmental Neurotoxicity Study [Электронный ресурс]. — Электрон, дан. (1 файл). — 2006..- Режим доступа http:// www.oecd.org/dataoecd/20/52/37622194.pdf — Загл. с экрана.
5. D'Sa C. Caspase regulation of genotoxin-induced neural precursor cell death, C. D'Sa, B.J.Klocke, F. Cecconi// J. Neurosc.i Res., 2003. — V 74. — № 3. — P. 435-45.
6. Fox M.W. Reflex-ontogeny and behavioral development of the mouse//Anim. Behav., 1965. — V. 13. — P. 234-241.
7. Health Effects Test Guidelines OPPTS 870.6300 Developmental Neurotoxicity Study [Электронный ресурс]. — Электрон, дан. (1 файл). — 2006.. -Режим доступа http://www.epa.gov/opptsfrs/publi-cations/OPPTS _Harmonized/870_Health_Effects_ Test_Guidelines/Series/870—6300.pdf. — Загл. с экрана.
8. Mikita T. Functional consequences of the arab-inosylcytosine structural lesion in DNA // Biochemistry, 1988. — V 27. — № 13. — P. 4698-705.
9. Ohno M. Neuroanatomical study of somatomo-tor cortex in microcephalic mice induced by cytosine arabinoside//Brain Dev., 1984. — V. 6. — № 6. — P. 528-38.
10. Takano T. Neuronal apoptosis and gray matter heterotopia in microcephaly produced by cytosine arabinoside in mice//Brain Res., 2006. — V. 1089. — № 1. — P. 55-66.
11. Williams E. The development of social behavior patterns in the mouse, in relation to natural periods // Behavior., 1953. — V. 6. — P. 35-64
12. Yamauchi H. Involvement of p53 in 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine-induced rat fetal brain lesions // Neurotoxicol. Teratol., 2004. — V. 26. — № 4. — P. 579-86.
Материал поступил в редакцию 03.07.07.
A.V.Lobanov1, O.N.Khokhlova1, L.A.Zakharova1, I.Yu.Zarayskaya2, A.N.Murashov1
PATTERN FOR ANALYZING NEUROTOXIC EFFECT ON THE EMBRYONIC DEVELOPMENT BASING ON SOMATOSENSORY MATURATION IN MICE
laboratory of Biological Assays, Branch of M.M.Shemyakin and Yu.A.Ovchinnikov Institute of Biological Chemistry,
Russian Academy of Sciences, Pushchino 2Division of System Genesis, P.K.Anokhin Research Institute of Normal Physiology, Moscow
To create a pattern of lesion of the embryonic development in mice, a standard substance cytosine arabinoside (Ara-c) was used. Ara-c is an inhibitor of DNA synthesis and produces a strong cytotoxic effect on dividing cells. The substance was administrated in critical periods of the development of cerebral cortex in mice. Consequences of Ara-c administration were investigated on 12.5 and 13.5 prenatal days and on 13.5 and 14.5 prenatal days in relation to the somatosensory development in mice within the postnatal period. Fox battery was used for testing the posterity. The results showed that such a difference in the time of administration of the substance led to different neurotoxic lesions in the posterity which were found out in a number of sensomotor assays. The present pattern allows to perform a refined analysis of neurotoxic effects posed by newly developed pharmacologic preparations on the embryonic development in mice.
УДК 614.715.08
А.А.Масленников, М.М.Тобольская-Поспелова, Э.С.Ермилова
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ЗОМАНА В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЁННЫХ МЕСТ
Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии, Волгоград
Хроническое круглосуточное ингаляционное воздействие зомана в концентрации 1,0-10-6 мг/м3 сопровождается минимальными обратимыми обще -, иммуно — и гонадотоксическими проявлениями.
Предельно допустимая концентрация зомана в атмосферном воздухе населённых мест ообснована на уровне 5,0-10-7 мг/м3.
Ключевые слова: атмосферный воздух, зоман, ингаляционное поступление, хроническая интоксикация.
Введение. Выполнение конвенциальных программ химического разоружения [1] предусматривает обеспечение безопасности персонала объектов уничтожения химического оружия, населения, проживающего вблизи от них, а также исключение негативного воздействия на основные экосистемы. Однако необходимое в этой связи осуществление мониторинга производственной и природной среды возможно только при наличии соответствующих стандартов безопасности.
К настоящему времени для отравляющих веществ, подлежащих ликвидации (в том числе зомана), определены безопасные уровни их содержания в воде, почве, воздухе рабочей зоны, при загрязнении технологического оборудования и трансэпидермальном поступлении. В то же время, для вышеуказанного соединения отсутствует гигиенический норматив его содержания в атмосферном воздухе населенных мест, что и предопределило цель настоящих исследований.
Материалы и методы исследования. Объектом исследования служил образец О-(1,2,2-три-метилпропил)метилфторфосфоната (зомана) с
содержанием основного действующего начала 98%. Характеристика токсических проявлений соединения проведена в соответствии с действующими методическими указаниями [2].
На начальном этапе работы для оценки биологической активности вещества в условиях острых опытов определяли его основные параметры токсикометрии.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) токсиканта была установлена в ходе хронического эксперимента. При выборе уровней хронического поступления ксенобиотика в качестве максимального использовали экспериментально обоснованную величину его ПДК в воздухе рабочей зоны (1,0-10-5 мг/м3) [3]. Кроме того, с целью определения возможной зависимости концентрация-эффект вещество испытывали на уровне 1,0-10-6 мг/м3.
Минимальная величина ингаляционного поступления соединения составляла 5,0-10-7 мг/м3, в пять раз превышающая значение его ориентировочно безопасного уровня воздействия [4].
Всего в исследованиях использовано 412 белых беспородных крыс (198 самцов и 214 самок)
