CC BY
77
УДК 615.015.38:57.086
МИНОРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА В РЕГУЛЯЦИИ БЕЛОК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ
Ф.Н. Гильмиярова, В.М. Радомская, Е.А. Рыскина, О.А. Гусякова,
Н.А. Колотьева, Е.А. Шахнович, Н.А. Нефедова, А.А. Чудинова,
ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»
Гильмиярова Фрида Насыровна - e-mail: [email protected]
Изучено влияние малых молекул - этанола и пирувата - на каталитические и рецепторные белки. Установлено, что этанол активирует глицеральдегидфосфатдегидрогеназу, a-глицерофосфатдегидрогеназу, лактатдегидрогеназу, лизату эритроцитов, а также изолированные гомогенные белки. Пируват специфично изменяет узнавание, полноту взаимодействия антигенов А и В эритроцитов А (II), В (III), АВ (IV) групп крови с антителами, что визуализировано конфокальной микроскопией, проточной цитофлуорометрией.
Ключевые слова: малые молекулы, регуляция межмолекулярного взаимодействия, антигены, группы крови АВО..
It is studied influence of small molecules - ethanol and piruvat on catalytic and receptor proteins. It is established that ethanol activates gluceraldegidfosfatdegidrogenaza, a-glucerofosfatdegidrogenaza, lak-tatdegidrogenaza, a lysate of erythrocytes, and also the isolated homogeneous proteins. Piruvat is specific change recognition, completeness of interaction of antigenes A and B erythrocytes of A(II), B (III), AB (IV) blood types with antibodies that is visualized by confocal microscopy, a flowing fluorometry.
Key words: small molecules, regulation of intermolecular interaction, antigens, blood types ABO..
Получение информации о метаболомном ресурсе органов, тканей и биологических жидкостей не только диагностически значимо, но может быть источником новых представлений о молекулярных регуляторных механизмах в норме и патологии.
В обменных процессах значимую роль выполняют высокомолекулярные соединения, в частности, белки и в первую очередь ферменты, обеспечивающие превращения субстратов в продукты по путям метаболизма. Низкомолекулярные вещества служат объектом каталитического действия, выполняют важнейшую роль информационных молекул, регулируя деятельность биомолекул в различных компартментах клетки, во внеклеточном пространстве, в биологических жидкостях. Являясь продуктами ферментативного или неферментативного превращения, метаболиты создают микроокружение, среду, в которой функционируют ферменты, надмолекулярные комплексы в мембранах, тем самым несут информацию о реальных потребностях, образуя своеобразную память о молекулярном событии [1, 2]. Качество взаимодействия во многом определяется малыми молекулами, их концентрацией, структурой, стерическими, электростатическими свойствами, которые модулируют деятельность высокомолекулярных соединений. Небольшие изменения конформации могут изменить ориентацию лиганда в активном, аллостерическом центре. Это определит характер процесса, его направленность^, 4, 5].
В качестве объекта изучения информационнорегуляторной роли низкомолекулярных соединений в процессах метаболизма нами выбрано два типа белков: во-первых, ферменты, функция которых реализуется каталитической активностью и таким образом визуализируется. Во-вторых - антигены системы АВО, скорость и полнота образования комплексов с антителами определяется структурно-конформационным соответствием. Факторами,
регуляторный потенциал которых оценивается, выбраны этанол, низкомолекулярное соединение с высокой физикохимической активностью, экзогенной и эндогенной природы и естественный метаболит пируват.
Цель исследования: оценить возможность малых молекул моделировать функцию белков, влиять на процесс межмолекулярного взаимодействия.
Материал и методы
В условиях in vitro этанол в конечной концентрации 0,3 мМ
в течение 5 минут инкубировался при температуре 25°С с препаратами ферментов - глицеральдегидрофос-фатдегидрогеназой (КФ 1.1.1.12), a-глицерофосфат-дегидрогеназой (КФ 1.1.1.8), лактатдегидрогеназой (КФ
1.1.1.27). Активность ферментов определялась спектрофотометрически на спектрометре Lambda 20 (PerkinElmer, Швейцария). Аналогичные условия проведения экспериментов с гемолизатом, полученным разведением крови 1:10.
Для изучения биологического действия пирувата на антигены А, В, A(II), В(111), AB(IV) группы крови системы АВО перед постановкой реакции гемагглютинации эритроциты инкубировали с раствором пирувата в конечной концентрации 2мМ. Агглютинация подсчитывалась по W. Marsh с индикацией степени агглютинации (балльная оценка интенсивности агглютинации - р^.Визуализация белок-белковых комплексов проводилась при помощи экспериментального стенда, который реализован на базе конфокального оптического микроскопа OlympusIX 71 (Olympus, Япония), конфокального сканирующего блока и лазерного комбайна (фирма ANDOR); на проточном цитофлуориметре FACSCalibur компании Beckton Dikinson (США), с использованием специфичных моноклональных конъюгированных антител BloodgroupA-antigen (Z2A), BloodgroupB-antigen (89-F), меченными флуорес-цеинизотиоционатом (FITC) фирмы SantaCruzbiotechnology, Inc, (США).
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
М\
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
РИС. 1.
Активность дегидрогеназ гемолизата, модифицируемая этанолом.
рис. г.
Влияние этанола на активность изолированных ферментов.
А Б
РИС. 3.
Экспрессия антигенов АВО системы крови после инкубации пируватом (а) антиген А(П) группы крови; (б) антиген В(Ш) группы крови.
В _
РИС. 4.
Микроскопическая картина образования комплексов антиген -антитело, меченных флуорохромом ПТС в режиме флуоресценции:
(а) эритроциты A(II) группы крови; (б) эритроциты А(П) группы крови после инкубации с пируватом; (в) эритроциты В(Ш) группы крови; (г) эритроциты В(Ш) группы крови после инкубации с пируватом
Статистический анализ данных проводили в среде статистического пакета прикладных программ SPSS 12.0 и в программе MSEXCEL 2007.
Результаты и их обсуждение
Установлено, что в лизате эритроцитов удельная активность ГАФД, ключевого фермента гликолиза, в среднем составляет 0,255+0,001 Е/мг. Этанол вызывает значительное повышение дегидрогеназной активности фермента (рис. 1).
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (Д-глицераль-дегид-3-фосфат:НАД-оксидоредуктазафосфорилирующая КФ 1.2.1.12) катализирует обратимое окислительное фосфо-рилирование Д-глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-дифос-фоглицерата, используя НАД в качестве кофермента. В настоящее время расшифрована структура ГАФД из различных тканей млекопитающих. Существует представление, что ГАФД - это тетрамер, организованный как димер с тремя неэквивалентными поверхностями [6].
Выявленное нами усиление активности ГАФД гемолизата после инкубации с этанолом свидетельствует о том, что этиловый спирт, обладающий реакционоспособной гидроксильной группой в силу наличия короткого двууглеродного радикала и незначительного индуктивного эффекта, может вступить в донорно-акцепторные отношения с функциональными группами апофермента, что ведет к повышению его реакционной способности. Наличие катионных и анионных локусов в холоферменте ГАФД создает реальные условия для взаимодействия с низкомолекулярными лигандами, что может вызвать стерические, конформационные изменения, активацию функциональных групп, повышение активности фермента, так как создает благоприятные условия для протекания катализа [6]. Следует учесть, что действие этанола на активность ГАФД изучалось в системе гемолизата, т. е. в многокомпонентной среде из высоко- и низкомолекулярных соединений сразличными свойствами. Нельзя исключить в этих условиях, наряду с прямым действием этанола, и косвенные эффекты, т. е. опосредованные взаимодействием этилового спирта с другими реакционоспособными соединениями и создание оптимального микроокружения для взаимодействия с коферментом и субстратом.При изучении действия этанола на активность a-глицерофосфат-дегидрогеназы установлено, что активность фермента под действием этанола также увеличивается (рис. 1).
В функциональном отношении a-глицерофосфат-дегидрогеназа сопряжена с ГАФД, реализуя одну из фосфо-триоз в a-глицерофосфат, используемый для пластических целей - в липосинтезе, глюконеогенезе и, кроме того, создает своеобразное депо восстанавливающих эквивалентов в структуре a-глицерофосфата. Димерная молекула a-глицерофосфатдегидрогеназы (а-глицерол-3-фосфат: НАД-оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.8) катализирует обратимое окисление а-глицерол-3-фосфата в диоксиацетонфосфат. В настоящее время фермент охарактеризован и клонирован из многочисленных источников [6, 7].
Сравнивая активирующее влияние этанола на ГАФД и a-ГФД, очевидно более значимое влияние этанола на глице-ральдегидфосфатдегидрогеназу, чем на a-глицерофосфат-дегидрогеназу. Эти данные свидетельствуют, что эффекты этанола при одинаковой биодоступности ферментов определяются их субъединичным составом. Есть данные в литературе, свидетельствующие о том, что этанол за счет
неферментативного взаимодействия с функциональными группами белков модулирует их функцию [7].
Далее нами изучено влияние этанола на активность в гемолизате лактатдегидрогеназы (рис. 1). Инкубация с этанолом ведет к значимому повышению активности лактатдегидрогеназы, величина сопоставима с уровнем активации ГАФД. Это может свидетельствовать о сходстве механизмов влияния этанола на тетрамерные молекулы каталитических белков и об обеспечении им слаженности и преемственности реакций гликолиза.
Лактатдегидрогеназа(1_-лактат-НАД-оксидоредуктаза КФ
I.1.1.27), как известно, катализирует обратимое восстановление пирувата в лактат. Обладая высокой активностью, она вносит весомый вклад в реокисление НАДН, обеспечивая цитоплазматические дегидрогеназы окисленным ко-ферментом, создавая условия бесперебойности гликолиза. Фермент регулирует баланс фонда субстратной пары пируват-лактат, формируя молекулярную базу анаболических и катаболических процессов, в которых лактат служит фактическим резервом пирувата, используемого в разнообразных превращениях синтеза и распада.
Известно, что гликолитические ферменты, а именно гли-церальдегидфосфатдегидрогеназа и лактатдегидрогеназа ассоциированы со структурными белками клеток, в частности с А-актином, что влияет на кинетические свойства ферментов и вызывает структурное изменение белка, с которым дегидрогеназы связаны. Таким образом, этанол может непосредственно влиять на макромолекулу белка, создавать специфическое микроокружение для активного центра, а также действовать опосредовано через белки, с которыми ассоциирован фермент (рис. 1).
В экспериментах с изолированными гомогенными ферментами установлено, что тенденция сдвигов, которые вызывает этанол, аналогична тем, которые выявлены для гликолитических ферментов гемолизата. Характерно, что в количественном отношении они значительно менее выражены. Активность глицеральдегидфосфатдегидрогеназы увеличилась на 30,1%, глицерофосфатдегидрогеназы - на
II,2%, лактатдегидрогеназы - на 26,7% (рис. 2).
Сравнение полученных результатов свидетельствует о
том, что, во-первых, отчетливо прослеживается разница в количественном изменении активности дегидрогеназ. Она существенно выше в гемолизате. Очевидно, в условиях гемолизата суммируются прямое и опосредованное влияние, обусловленное многокомпонентным составом среды, в которой распределены ферменты. Активирующее действие этанола на изолированные белки существенно менее выражено (рис. 2). Воспроизводится направленность изменений, т. е. активация, а также фактическая разница повышения активности глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, о чем свидетельствуют близкие отношения активности ГАФД/ ГФД, ГАФД/ЛДГ, ЛДГ/ГФД ферментов гемолизата и индивидуальных белков. Экстраполируя эти данные к statusvivo, можно предположить, что поступление экзогенного этанола закономерно усиливает процесс окислительного метаболизма углеводов, не вызывая изменения соотношения в активной системе НАД-зависимых дегидрогеназ.
Современные представления о структуре и топографии антигенов А, В, Н позволяют объяснить их высокую иммуно-
генность, роль в формировании иммунного ответа защиты клеток от чужеродного материала [8, 9, 10, 11]. В этом плане перспективным является исследование антигенов и антител АВО системы в качестве объектов межмолекулярных, в том числе белок-белковых взаимодействий.
В условиях in vitro при инкубации пировиноградной кислоты с эритроцитами А(11) группы крови время начала агглютинации увеличилось по сравнению с контролем и с эритроцитами у B(III) группы крови (таблица 1).
ТАБЛИЦА 1.
Влияние пировиноградной кислоты на антигены А и В эритроцитов А(11) и В(Ш) групп крови
Контроль Антиген А Контроль Антиген В
A II) A II) В (III) В (III)
Время (с) Агглютинация с) я м е р В Агглютинация с) я м е р В Агглютинация с) я м е р В Агглютинация
M б* 4+ 7* 4+ б* 4+ б,4 4+
Me б 4+ 7 4+ б 4+ б 4+
Д% 1б б
SE 0 0 0,81 0 0 0 0,51 0
* - р <0,05
ТАБЛИЦА 2.
Влияние пировиноградной кислоты на антигены А и В эритроцитов АВ(Ш) группы крови
Контроль Антиген А Контроль Антиген В
AВ (IV) AВ (IV) AВ (IV) АВ (IV)
Время (с) Агглютинация Время (с) Агглютинация Время (с) Агглютинация Время (с) Агглютинация
M б* 4+ 7,4* 3,6+ 6* 4+ 7,4* 3,6+
Me б 4+ 7 4+ 6 4+ 7 4+
А% 23 23
SE 0 0 0,51 0,51 0 0 0,51 0,51
* - р <0,05
В аналогичных условиях агглютинация антигенов А и В эритроцитов АВ(1У) группы крови время агглютинации возросло на 23%, степень агглютинации выражена слабее, чем в контрольных образцах. Существенно снижается полнота взаимодействия, процесс преципитации белковых комплексов. При этом нивелируется специфика, характерная для анти-А и анти-В антигенов (таблица 2).
В основе неоднотипной тенденции выявленных сдвигов могут быть различия в строении А и В антигенов. Оба они содержат общий структурный компонент - вещество Н, а групповую антигенную специфичность, как известно, антигена А определяет то, что у Ы-ацетилгалактозамина в позиции «С» располагается наиболее реакционно способный ЫНСОСН3, а у Д-галактозы В-антигена в этой позиции находится ОН-группа. Специфичность взаимодействия антигенов с антителами определяется особенностями строения поверхностной структуры антигенов - наличием различных химических групп, их пространственным расположением [12, 13].
Нами с целью количественной оценки результатов взаимодействия антигенов и антител при введении малых
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
ivh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
молекул в систему использован метод проточной цитофлуо-риметрии (рис. 3).
Установлено, что количество образующихся иммунных комплексов уменьшилось в образцах А(11) группы, менее значительно уменьщилось - в В(111) и АВ(!У) группах крови. При визуализировании комплексов антиген-антитело флуоресцентными зондами с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии выявлено уменьшение пиков флуоресценции в эритроцитах А(!!) и В(!!!) группы крови после инкубации с пируватом по сравнению с контролем (рис. 4).
Пируват, по-видимому, конкурирует за активные реакционно способные группы антигенов А и В с моноклональными антителами, меченными флуоресцеинизотиоцианатом, что отражается на конформационной структуре белковой молекулы, способности антигенов образовывать комплексы антиген-антитело.
Заключение
Полученные данные свидетельствуют о регуляторном влиянии этанола на метаболические процессы за счет прямого эффекта на ферментные белки и изменение их микроокружения.
Показано, что пируват выполняет регуляторную роль, определяя характер и интенсивность антиген-антительного взаимодействия. Он изменяет сродство антигена А к антителу более интенсивно по сравнению с антигеном В, что выражается в уменьшении способности образовывать комплексы антиген-антитело, снижении степени и увеличении времени начала агглютинации. Действие пирувата на выраженность антиген-антительного взаимодействия подтверждено методом проточной цитофлуориметрии, выявившим изменение количества образующихся иммунных комплексов. Визуализация антиген-антительных комплексов с помощью конфокальной микроскопии при введении в систему пирувата позволило выявить уменьшение количества антиген-Ь антительных комплексов.
Полученные результаты свидетельствуют об успешном использовании малых молекул, в частности пирувата, в
качестве молекулярных зондов и перспективности применения эритроцитов с экспрессированными на их мембранах антигенными детерминантами системы АВО для изучения белок-белковых взаимодействий в силу наглядности визуализации, возможности количественной оценки этого процесса. из
ЛИТЕРАТУРА
1. Зимин Ю.В., СяткинС.П., Березов Т.Т. Надмолекулярная регуляция активности некоторых оксидоредуктаз клетки в норме и патологии. Вопросы медицинской химии. 2001. № 3. С. 24-30.
2. Kain К. Usingyeasttounderstandproteinfoldingdiseases: aninterviewwith SusanLindquist. /Dis. Modelmech. 2008. V. 1. № 1. P. 17-19.
3. Курганов Б.А. Стабильность и фолдинг белков. Биохимия. 1998. Т. 63. Вып. 3. С. 291-293.
4. Воротников А.В., Крымский М.А., Иринский В.П.Внутриклеточная сигнализация и фосфорилирование белков при сокращении гладких мышц. Биохимия. 2002. Т. 67. Вып. 12. С. 1587-1610.
5. Плетень А.М. Шапероны и формирование устойчивых к протеазам амилоидных структур. Сб. материалов VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов». М. 2007. 17 с.
6. Skarzynski T., Wonacott A.J. Coenzyme-induced conformational changes in glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase from Bacilusstearothermophilus. J. mol. boil. 1988. V. 203/4. P. 1097-1118.
7. Горбунова О.Б. Роль никотиновых холинорецепторов в формировании совместной зависимости от никотина и этанола. 2. Молекулярные механизмы действия этанола и его взаимодействие с никотиновымхолинорецептором. Успехи современной биологии. 2005. Т. 125. № 1. С.48-50.
8. Сахаров Р.С. Кондратова И.В. и др. Современные представления о структуре и функции эритроцитарных антигенов (Обзор литературы к 100-летию открытия групп крови). Судебно-медицинская экспертиза. 2001. № 5. С. 38-43.
9. Оловникова Н.И., Николаева Т.Л. Антигены эритроцитов человека. Гематология и трансфузиология. 2001. № 5. С. 37-45.
10. Донсков С.И. Группы крови в биологии человека - факты и предположения. Гематология и трансфузиология. 2001. Т. 46. № 5. С. 32-33.
11. Smolarek D. et al. Molecularbackground of the AB0 bloodgroupsystem. PostepyHigMedDosw. (online). 2008. № 62. Р. 4-17.
12. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М.: Медицина, 2000. 429 с.
13. Малинка М.К., Петриев В.М., Подгородниченко В.К. Иммунология. 2007. № 1. С. 16-19.
