CC BY
17
ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 581.82:575:633.11
МИКРОСТРУКТУРНЫЕ МАРКЕРЫ НА ПОВЕРХНОСТИ ЛИСТЬЕВ КОЛЛЕКЦИОННЫХ ЗЛАКОВ И ГИБРИДОВ ПШЕНИЦЫ,
ПОЛУЧЕННЫХ ПРИ ОТДАЛЕННОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ
А. В. Бабоша, М. М. Геворкян, П. О. Лошакова, Л. И. Глухова, Л. П. Иванова, В. П. Упелниек
Методом криоСЭМ исследованы микроструктурные особенности поверхности листовой пластинки видов злаков, сортов и гибридов пшеницы из коллекции лаборатории отдаленной гибридизации ГБС РАН. Выявлены элементы микроморфологии, которые могут быть использованы в качестве маркеров для идентификации образцов коллекции в вегетирующем состоянии.
Ключевые слова: пшеница, отдаленная гибридизация, микроморфология поверхности, криоСЭМ.
Анатомическое строение листовой пластинки злаков обладает высоким разнообразием, что позволяет использовать признаки его микроструктуры в систематике и определении видов семейства Роасеае [15]. Известно, что при создании новых сортов пшеницы методом отдаленной гибридизации широко используются дикорастущие злаки, являющиеся донорами полезных признаков [6-10]. Для поддержания коллекции необходимо контролировать сортовую принадлежность и однородность образцов. Микроморфологические признаки природных таксонов имеют адаптивное значение, и могут служить маркерами устойчивости к стрессам в селекции культурных форм злаков. Кроме того, известно, что некоторые анатомические особенности наследуются и могут передаваться следующему поколению при отдаленной гибридизации [11, 12]. Одним из следствий является увеличение разнообразия микроструктуры поверхности листьев у получаемых при этом сортов пшеницы.
Цель работы - изучить анатомические особенности листовой пластинки коллекционных злаков, пригодные для идентификации их сортовой и видовой принадлежности.
Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) успешно используется для определения ряда таксонов сем. Роасеае [4, 5, 13]. Этот метод существует в разных препаративных и аппаратных модификациях, позволяющих решить широкий спектр задач: от изучения тонкого строения при больших увеличениях и высоких разрешениях до экспресс-методов.
В нашем исследовании использована сканирующая электронная микроскопия замороженных образцов (криоСЭМ). Особенностью данной
модификации является минимальная подготовка: отсутствие фиксации, высушивания и нанесения на образец металлического напыления [14]. Благодаря низким температурам, которые препятствуют испарению воды в вакууме, при криоСЭМ растительные ткани не высыхают. Эпидерма листьев пшеницы покрыта толстым слоем кутикулы, поэтому даже при относительно небольших отрицательных температурах значительно снижается вероятность появление артефактов.
Понижение температуры препарата достигается использованием замораживающей приставки c элементом Пелтье, встраиваемой в камеру микроскопа. В нашем случае достаточно использовать относительно простые модификации замораживающего столика с охлаждением до -20...-30 оС. Наилучшие результаты в этих условиях дает детектор обратно рассеянных электронов QBSD, который выявляет не только микрорельеф поверхности, но и различия в ее химической структуре.
В работе использовали полевой материал 50 образцов представителей родов Elymus и Elytrigia, сорта и гибриды пшеницы (Triticum aestivum L.) из коллекции отдела отдаленной гибридизации ГБС РАН (с. Рождествено, Московской обл.). Фрагменты листовой пластинки средней части листа среднего яруса растений в стадии колошения или цветения (июнь-июль 2017-2019 гг.) наклеивали при помощи термопасты КПТ-8 на медную пластинку 2 х 4 см и затем фиксировали на столике замораживающей приставки «Deben Cool stage» (Великобритания) [14]. Образцы исследовали на сканирующем электронном микроскопе LEO-1430 VP (Carl Zeiss, Германия) в условиях высокого вакуума при -25 оС (криоСЭМ). Классификацию морфологических структур проводили по общепринятой для злаков методике [2, 3].
Поверхность листьев злаков образована рядами удлиненных в направлении оси листа эпидермальных клеток. Эти ряды состоят из чередующихся длинных и укороченных клеток и их производных: трихом, устьиц, кремневых клеток. Антиклинальные стенки длинных и укороченных клеток могут быль гладкими или иметь волнистую U- или Q-образную форму. Состав клеток различается в области ребер и в межреберном пространстве. Адаксиальная и абаксиальная поверхности, как правило, отличаются числом и формой характерных элементов [3], что увеличивает уникальность сочетаний разных элементов.
На поверхности изученных злаков наиболее заметными и вариативными являются: кремневые клетки, колючки и волоски.
На адаксиальной и абаксиальной поверхностях кремневые клетки имеют светлые оттенки, что обусловлено их плотной структурой, высоким содержанием кремния и меньшим содержанием воды. Среди исследованных образцов наблюдали следующие типы кремневых клеток: 1) мелкие в виде полукруга в межреберном пространстве и более крупные округлые над ребрами (рис.1, 2); 2) крупные удлиненные клетки с сильно
волнистым краем (рис.1, 1, 4). Первые встречаются в паре с пробковой клеткой. Вторые одиночно над ребрами или образуют длинные ряды из нескольких таких элементов. У некоторых образцов кремневые клетки имели характерную гантелеобразную или седлообразную форму (рис.1, 3).
Рис. 1. Кремневые клетки: 1 - адаксиальная сторона (сорт Рубежная), 2 - абаксиальная сторона (T. aestivum, сорт Московская 39), 3 - адаксиальная сторона (Elymus сanadensis), 4 - абаксиальная сторона (T. aestivum, сорт Ботаническая 3).
Масштабная линейка: 1,3 - 20 мкм; 2,4 -10 мкм.
Заметными элементами поверхности листовой пластинки являются колючки (шипики, крючки - prickles, hooks). Иногда эти элементы трудно отличить от волосков [3]. Колючки более жесткие, могут быть прямыми или иметь один изгиб (коготь). Условно все колючки можно разделить на 3 группы: мелкие, средние и крупные (рис. 2, 1,2,4). Крупные и средние расположены в районе ребра и направлены апикально. Мелкие могут быть апикальными или разнонаправленными. Ярко выделяются колючки в виде щитка, которые прочно закреплены к эпидерме и состоят из округлого основания с волнистым краем и очень короткой бородки (рис.2, 3). Такие колючки встречаются как на адаксиальной, так и на абаксиальной сторонах листа.
Рис. 2. Колючки: 1 - адаксиальная сторона (Elymus canadensis), 2 - адаксиальная сторона (Elytrigia elongata), 3 - абаксиальная сторона (Elymus farctus), 4 - адаксиальная сторона (T. aestivum, сорт Ботаническая 3). Масштабная линейка: 1-3 - 20 мкм; 4 -10 мкм.
Среди образцов коллекции обнаружены макро-волоски, располагающиеся на верхушке ребра адаксиальной стороны листа (рис. 3). Их бородки направлены как в апикально, так и в сторону базальной части листа. Наличие макро-волосков считается диагностическим признаком для некоторых таксонов злаков, а их плотность может варьировать у разных листьев и в разных условиях произрастания [15]. Также отмечены мелкие волоски, бородки которых направлены друг на друга и в сторону устьиц (рис. 3).
Таким образом, криоСЭМ может быть использован в качестве экспресс-метода для быстрого исследования микроструктурных особенностей поверхности листовой пластинки. Исследованные образцы обладали достаточно высоким разнообразием кремневых клеток, микроколючек и волосков. Данные элементы микроморфологии могут быть полезны для идентификации видов, сортов и гибридов, полученных отдаленной гибридизацией, на стадии вегетации.
Рис. 3. Макро-волоски и мелкие волоски на адаксиальной стороне сорта Ботаническая 3 (T. aestivum). Масштабная линейка: 100 мкм.
Работа выполнена в рамках госзадания ГБС РАН «Гибридизация у растений в природе и культуре: фундаментальные и прикладные аспекты» (№19-119012390082-6).
Список литературы
1. Metcalfe C.R. Anatomy of the monocotyledons. 1. Gramineae. Oxford: Clarendon Press, 1960. 731 p.
2. Ellis R.P. A procedure for standardizing comparative leaf anatomy in Poaceae. The leaf blade as viewed in transverse section // Bothalia. 1976. Vol. 12. Pp. 65-109.
3. Ellis R. P. A procedure for standardizing comparative leaf anatomy in the Poaceae. II. The epidermis as seen in surface view // Bothalia. 1979. V. 12(4). P. 641-671.
4. Zhang Y. X., Zeng C. X., Li D. Z. Scanning electron microscopy of the leaf epidermis in Arundinarieae (Poaceae: Bambusoideae): evolutionary implications of selected micromorphological features // Botanical journal of the Linnean Society. 2014. V. 176(1). P. 46-65.
5. Scanning electron and light microscopy of foliar epidermal characters: A tool for plant taxonomists in the identification of grasses / R. Khan, M. Ahmad, M. Zafar [et al.] // Microscopy research and technique. 2017. V. 80 (10). P. 1-18.
6. Цицин Н.В. Отдаленная гибридизация растений. М.: Наука, 1978.
72 с.
7. Pre-harvest sprouting resistance and haplotype variation of ThVp-1 gene in the collection of wheat-wheatgrass hybrids / A.A. Kocheshkova, P.Y. Kroupin, M.S. Bazhenov [et al.] // PloS one. 2017. V. 12(11). e0188049. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0188049.
8. Синтетические формы как основа для сохранения и использования генофонда диких сородичей мягкой пшеницы / Р.О. Давоян, И.В. Бебякина, О.Р. Давоян [и др.] // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2014. №16(1). С. 44-51.
9. Источники эффективной устойчивости мягкой пшеницы и ее родичей к грибным болезням-поиск, создание и использование в селекции / Л.Г. Тырышкин, В.В. Сюков, В.Г. Захаров [и др.] // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 2012. №170. С. 186-199.
10. Новые формы пшенично-пырейных гибридов, полученных в ГБС РАН и перспективы их использования в селекции на качество зерна / П.О. Лошакова, Л.П. Калмыкова, А.В. Фисенко [и др.] // Бюллетень Главого ботанического сада. 2017. №2. С.34-41.
11. Орловская О. А., Корень Л. В., Хотылева Л. В. Морфологический анализ гибридов пшеницы, созданных посредством отдаленной гибридизации в трибе Triticeae // Весщ Нацыянальнай акадэмп навук Беларуси Серыя бiялагiчных навук. 2011. №. 3. С. 29-33.
12. Klimko M., Wysakowska I. Epidermal features of glumes and florets in Aegilops geniculata Roth and Aegilops peregrina (Hack.) Maire et Weiller x Secale cereale L. hybrids, amphiploids and parental forms // Steciana. 2015. V. 19(1). P. 13-24.
13. Гудкова П.Д., Олонова М.В. Микроморфологическое изучение абаксиальной эпидермы листовых пластинок сибирских видов рода Stipa L. // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2012. №3(19). С. 33-45.
14. Рябченко А.С., Бабоша А.В. Применение термопасты в качестве клеящего и теплопроводящего состава при исследовании биологических образцов на сканирующем электронном микроскопе с использованием замораживающей приставки // Патент РФ № 2445660, 20.03.2012. Бюл. № 8.
15. Stace C.A. Cuticular characters as an aid to plant taxonomy. Bull. Br. Mus. Nat. Hist. 1965. V.4. P. 3-78.
Бабоша Александр Валентинович, д-р биол. наук, зав. лабораторией, phimmunitet@yandex.ru, Россия. Москва, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук (ГБС РАН),
Геворкян Маргарита Мартиновна, канд. биол. наук, научный сотрудник, m I3alist.ni, Россия. Москва, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук (ГБС РАН),
Лошакова Павла Олеговна, канд. биол. наук, научный сотрудник, antonloshakov'a.yandex.ru, Россия. Москва, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук (ГБС РАН),
Иванова Любовь Петровна, научный сотрудник, gbsran@yandex.ru, Россия. Москва, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук (ГБС РАН),
Глухова Любовь Ивановна, научный сотрудник, phimmunitetaq.yandex.ru,Россия. Москва, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук (ГБС РАН),
Упелниек Владимир Петрович канд. биол. наук, зав. отделом, vla-upelniek'ayandex. ru, Россия. Москва, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук (ГБС РАН)
MICROSTRUCTURAL MARKERS ON THE SURFACE OF COLLECTION CEREAL LEAVES AND WHEAT HYBRIDES OBTAINED BY REMOTE
HYBRIDIZATION
A. V. Babosha, M. M. Gevorkyan, P. O. Loshakova, L. P. Ivanova, L. I. Gluhova, V. P. Upelniek
The cryoEM method was used to study the microstructural features of the leaf blade surface of cereal species, varieties and hybrids of wheat from the collection of the laboratory of remote hybridization of the NV Tsitsin Main Botanical Garden of the Russian Academy of Sciences. Micromorphology elements that can be used as markers for identifying collection samples in a vegetative state are revealed.
Key words: wheat, surface micromorphology, remote hybridization, cryoSEM.
Babosha Aleksandr Valentinovich, Dr. Sci. Biol., Head of Laboratory, phimmunitet'a yandex.ru, Federal State Budgetary Institution for Science Main Botanical Garden named after N. V. Tsitsin RAS,
Gevorkyan Margarita Martinovna, Cand. Sci. Biol., Researcher, m_13@,list.ru, Federal State Budgetary Institution for Science Main Botanical Garden named after N.V. Tsitsin RAS,
Loshakova Pavla Olegovna, Cand. Sci. Biol., Researcher, antonloshakov@yandex. ru, Federal State Budgetary Institution for Science Main Botanical Garden named after N. V. Tsitsin RAS,
Ivanova Lyubov Petrovna, Researcher, gbsran'ayandex.ru, Federal State Budgetary Institution for Science Main Botanical Garden named after N. V. Tsitsin RAS,
Glukhova Lyubov Ivanovna, Researcher, phimmunite t@yandex. ru, Federal State Budgetary Institution for Science Main Botanical Garden named after N. V. Tsitsin RAS,
Upelniek Vladimir Petrovich, Cand. Sci. Biol., Head of Department, vla-upelniek 'ayandex. ru, Federal State Budgetary Institution for Science Main Botanical Garden named after N. V. Tsitsin RAS
