CC BY
15МРНТИ 14.34.01
МИКРОСАТЕЛЛИТТ1К ТАЛДАУ ЭД1С1 НЕГ1З1НДЕ БИОЛОГ СТУДЕНТТЕРДЩ ГЫЛЫМИ-ЗЕРТТЕУШ1Л1К Ц¥ЗЫРЕТТЫ1Г1Н ЦАЛЫПТАСТЫРУ
Д.М. Мукашева 1, Р.Ц. Жексембиев 2, Е.А. Шрш1баев 3
курс докторанты, 6D011300-Биология, 1,2,3 Каза^ ^лтгьщ цыздар педагогикалыц университетi, Алматы ц., Казацстан
2б.г.к., профессор, 3б.г.к., цауымд. профессор м.а., email: [email protected]
Б^л мацалада биология мамандыгынын студенттерше арналган микросателлитпк талдау ж^мыстарын журпзудщ эдютемеа бер1лген. Терен теориялыц бшм мен практиканы ^штастыра отырып, микросателлитпк талдау эдастерш жYзеге асыруда цолданылатын жабдыцтар мен реактивтер жэне оларды цолданудын эдк-тэалдерш игеруге зертханалыц сабацтарда жагдай жасау арцылы, оны кке асыру барысында биолог студенттердщ гылыми-зерттеушшк цузыреттшгш дамытуга болады. Биолог мамандарга молекулалыц денгейде заманауи ц^рал-жабдыцгармен экспериментпк ж^мыс ютеу эдютерш игеру, цолдану, талдау, синтездеу, зерттеу ж^мыстарын жYргiзу арцылы ел экономикасын жангырту мацсатында жана ешмдер ^сыну жэне функционалдыц сауаттылыцты дамыту факторлары эркiмнiн алга басуына свзсiз цажеттi алгышарттардын санатында. Сол себептi осы аталган факторларды iске асыру мацсатында микросателлиттiк талдау ж^мыстарын менгерудiн манызы зор. Жана мазм^н тудыру Yшiн элементтердi болжау эрi шыгармашылыцпен бiрiктiру, вз тэж1рибес негiзiнде жана модель (ц^рылым) ц^растыруга багытталган бiлiм беру - цазiргi замангы взектi тапсырмалардын бiрi.
Туйт свздер: ДНК,, щант щумайы, сынама, полимеразды тгзбектг реакция (ПТР), праймер
К^рп тацда жеке адам гана емес, тугас халыцтыц взi бэсекелш цабiлет арттырса гана табысца жетуге мYмкiндiк алады.
Бэсекелiк цабiлет дегенiмiз - ^лттыц аймацтыц немесе жаhандыц нарыцта багасы, я болмаса сапасы жвнiнен взгелерден угымды дYние ^сына алуы. Б^л материалдыц внiм гана емес, сонымен бiрге, бiлiм мен гылым, цызмет, зияткерлiк внiм немесе сапалы ецбек ресурстары болуы мYмкiн.
Болашацца ^лттыц табысты болуы оныц табиги байлыгымен емес, адамдарыныц бэсекелш цабiлетiмен айцындалады. Сондыцтан, эрбiр цазацстандыц, сол арцылы тугас ^лт XXI гасырга лайыцты цасиеттерге ие болуы керек [1].
Соган орай биология мамандыгыныц студенттерiне микросателлиттiк талдау жYрriзудщ эдiстемесiн игеру гылымды алга жетелейнш аныц. Микросателлиттiк талдау популяциялыц зерттеулерде кещнен цолданылады. Микросателлиттi талдау деп ДНК-ныц белгiлi бiр бвлiктерiндегi микросателлитпк локустар деп аталатын ДНК-ныц цысца тандемдi цайталанымдарыныц санын аныцтау деп тYсiндiрiледi. Микросателлиттерде цайталанатын сарын (мотив) ^зындыгы 1-9 п.н. (жиiрек 2-4 п.н.). Эдiстi жYзеге асыру Yшiн зертханалыц жабдыцтардыц бiрнеше тYрлерi (ДНК бвлу жабдыгы, ДНК-амплификатор, электрофоретикалыц жабдыц), ал реактивтерден тек цана арнайы праймерлер жэне ПТР (полимеразды нзбекп реакция) Yшiн, сондай-ац ПААГ (полиакриламидн гель) электрофорезi Yшiн басца да реактивтер цажет. Талдау кезiнде эдю салыстырмалы тYрде цымбат емес, дегенмен нацты бiр тYP Yшiн праймерлердi эзiрлеу кезiнде, уацыт жэне царажат шыгындары едэуiр квп бвлiнедi. Алайда квптеген агаш всiмдiктерi Yшiн, праймерлердi сол тектердщ басца тYрлерiнен бешмдеуге болады, ал квптеген
митохондриалды жэне хлоропластты фрагменттер y™ih б1рнеше т^ымдастардыц немесе ретпктердщ екшдервде ^олданылатын эмбебап праймерлер бар.
Локустардыц Yлкен саны (ягни тэуелшз маркерлер), сондай-а^ жогары езгерпштш, аллельдердщ Yлкен саныньщ болуы, кодоминангтылыщ - микросателлитпк талдаудыц артыщшылыгы болып табылады. Кемш1л1ктер1 - на^ты б1р тYP Yшiн арнайы маркерлерд1 эз1рлеу кезшде праймерлердщ ^ымбат болуы. Секвенаторды пайдаланганда мультиплекс кезшде (бiр реакциядагы бiрнеше локустардыц ПТР-амплификациясы) микросателлиттер барынша тиiмдi, алайда орташа форматтагы ^арапайым электрофоретикалыщ жабдыщтарда да (мысалы, 20-га 20 см) жэне бромды этидиймен УК бояуын немесе SYBR-Gold класындагы заманауи бояуларды пайдаланумен, немесе ^мю бояумен секвенирлеуге арналган камерада талдануы да мYмкiн. Микросателлиттердi талдау кезiнде, сондай-а^ «нел-аллельдер» проблемасы (праймердщ ^ыздыру аймагында мутация кезiнде амплификацияныц болмауы), сондай-а^ соныц салдарынан узындыгы бойынша бiрдей фрагменттердщ эртYрлi ^рылымы болуы мYмкiн, кYPделi (жетшмеген) ^айталанымдар проблемасы бар екенiн де ескеру ^ажет. Жогары езгергiштiгi мен полиаллельдтне байланысты, микросателлиттер салыстырылатын топтардыц жуыщ арадагы дивергенциясы кезiнде ^олдану Yшiн, сондай-а^ жеке дара^тар мен клондарды сэйкестендiру Yшiн де ^сынылады [2, 3].
Жабдыктар мен реактивтер. Жалпы жабдыктар: м^здат^ыш камералар (-200С-тан -800С дейiн), тоцазыт^ыштар (+40С), Yдете сал^ындату жYЙелерi, дистиллятор, м^з жасайтын ^¥рылгы, рН-метр, зертханалыщ таразылар, центрифуга сал^ындатылумен (13000 айналым/мин дейiн), магнитпк араластыргыштар, м^зды монша, ^атты денелi термостат 990С дейiн, ротатор, миницентрифуга/вортекс, су-агынды соргы, ламинар-бокс, автоматтыщ пипеткалар -микродозаторлар (5 - 1000 мкл).
Арнайы жабдыктар: ДНК^-амплификатор, ПААГ-тагы (полиакриламидтi гель) тiк электрофорез Yшiн камералар (спейсерлер, тара^шалар, Yстелшелерi бар ^осымша
комплектiлер), теракты то^ кездерi.
Зертханалык ыдыстар: келемдерi эртYрлi зертханалыщ ста^андар (шыны немесе пластикалыщ), келемдерi эртYрлi елшеуiш цилиндрлер (шыны немесе пластикалыщ), ерiтiндiлердi са^тауга арналган ^цпрт шелмектер мен сауытшалар, бояу Yшiн кюветтер.
Шыгын материалдары: микродозаторлардыц ^штары, бiрреттiк пластик тYтiктер (1,5 жэне 0,6 мл), кагаз салфеткалар, пластикалыщ пакеттер, соныц iшiнде сыдырма iлгектi.
Баскасы: тYтiктерге арналган штативтер, ^айшылар, ^ала^шалар (шпатель), iскектер (пинцет), ^андауыр пыша^тар (скальпель) жэне бас^алары. ¥лпаларды гомогенизациялауга арналган Yккiштер келсапшасымен немесе тYрлi жYЙедегi гомогенизаторлар, латекст ^органыш ^олгаптар, ультракYлгiн сэулесiнен ^оргайтын кезiлдiрiктер, далалыщ жагдайда материал жинау Yшiн тоцазыщыш-семкелер, кескiндемелердi графикалыщ таркеудщ жэне талдаудыц жYЙелерi, Трансиллюминатор, гельдердi ^жаттандыру жYЙесi, компьютер + электрофореграмманы талдау Yшiн компьютерлiк багдарламалыщ жаса^тама.
Реактивтер: реактивтер тiзiмi ДН^-ны белш алу тэсiлiне байланысты езгеруi мYмкiн. ДН^-ны микросателлиттiк талдауFа арналFан реактивтер ri3iMi жэне буферлер курамы: Аммоний ацетаты / Ацетат аммония /Ammonium acetate 7.5 M раствор Этил спирт / Спирт этиловый 96 0 и 80 0 Изопропил спирт / Спирт изопропиловый Поливинилпирролидон (PVP 10000) В -меркаптоэтанол Акриламид 2К / Acrylamide 2K
^^метиленбисакриламид / N,N-methylene - bisacrylamide
N,N,N',N' - тетраметилетилендиамин (ТЕМЕД) / N,N,N',N' - Tetramethylethylendiamine (TEMED) Аммоний персульфаты / Персульфат аммония (ПСА) / Ammonium Persulphate (PSA) Трис (гидроксиметил) - аминометан / Trizma base (Tris (hydroxymethyl) - aminomethane Динатрий т^зы / ЕДТА динатривая соль / EDTA Disodium salt (EDTA Na2 ) Бор ^ыш^ылы / Борная кислота / Boric acid
Бром этидий / Бромистый этидий / Etidium Bromide (исходный раствор 10 мг/мл)
Yлгiлердi алу жэне сактау: ДН^-ны белш алу Yшiн, жа;ында жиналган жэне зертханалы; жагдайларда са;тауда турган дэндер, вегетативт бYршiктер, ту;ымдар (гаплоидтi эндоспермнщ жэне диплоидты уры;тардыц улпалары) сия;ты тYрлi улпалар пайдаланылуы мYмкiн.
Кант ;умайы да;ылдарыныц ту;ымдары +40С температурада тоцазыт;ышта, вегетативтi улпалардыц Yлгiлерi - Т = -700С-та немесе белме температурасында силикагельдiц аз мелшерi бар пакеттерде кептiрiлген кYЙде са;талады. ДНК-ны белiп алганда улпаныц типiн ескеру керек, себебi ескi вегетативтi мYшелерде (мысалы, ту;ым) екiншiлiк метаболиттердiц кеп мелшерi болады. ¥лпаларды тацдауга сэйкес ДНК-ны белiп алудыц эртYрлi ;аттамаларын пайдаланады.
ДН^-ны бвлiп алу эдки
^ант кумайы дакылдарынын вегетативтi бYршiктерiнен немесе тукымдарынан ДН^-ны бвлш алу эдкь
Геномды; ДН^-ны белу эдiстерi есiмдiктердiц молекулалы; биологиясын зерттеу Yшiн мацызды болып табылады.
Бгргншг кунг:
1. Эрбiр сынаманы дайындау Yшiн бiр эндоспермдi немесе ту;ымныц урыгын немесе 4-6 вегетативт бYршiктердi (;ант ;умайы да;ылдарыныц) немесе эр Yлгiден бiр вегетативт бYршiк алды; (сурет 1,2 ). ТYтiктерге ;ант ;умайыныц вегетативтi буршштерш жеке белiп алып, 700 мкл. 2% - СТАВ (Cetyltrimetylamoniumbromid) буферлш ;оспага салып, термостат;а 65°С ;ыздырды;. Содан кейiн улпаларды гомогенизатор келсапшасымен унта;тап, бiр тYнге ;ойып ;ойды; (2 сагат;а да ;оюга болады). Дистиллденген суда шыны келсапшаны жуып, таза салфеткамен CYртiп, барлы; сынамалар Yшiн ;айталанып туруы керек. 2% - СТАВ (Cetyltrimetylamoniumbromid) буферi - дэн немесе ескшдердщ ;аттылыгын жою ушш ;олданылады. Эр сынаманы ттст маркерлiк жазуы бар келемi 1,5 мл жеке тупктерге салды;.
Сурет - 1. Цант щумайыныц вегетативт1 буршгктерг (Судандыщ швп, 2018 ж.)
1
Сурет - 2. Цант щумайыныц вегетативт1 бYршiктерi (Гибрид-2, (F2) 2017-2018ж.) Еюншi KYHi:
2. Термостаттан алганнан кешн 5 мин. белме температурасында суытамыз. Эр трткке 800 мкл хлороформ ц^йдыц. Хлороформ ДН^-ны сындыратындыцтан цатты шайцаймау керек. 1. RS-24. Biosan. - ротаторына пробирканы салып 20 минут араластырдьщ (сурет - 3).
Сурет - 3. RS-24. Biosan. - ротаторында mYmiKmepdi араластыру барысы.
2. Коспасы бар тYтiктердi «Центриф. - Mikro-200, Hettich-Zentrifugen». Центрифугасында 10 минут 5000 айналымда центрифугаладыц.
3. Центрифугадан шайцамай алып, сацина жолацты т^нбага тигiзбей интерфазаны цалдырдыц, бетiндегi сацина жолацца дешнп мелдiр ерiтiндiнi, ягни, мелдiр супернатантты автоматтыц пипетканыц кемепмен абайлап алып, тутастай таза тртктерге ауыстырдыц. Мелдiр супернатант - 600 мклдей болады. ТYтiктердщ цацпагы жендi жабылды ма, тексерiп т^рган абзал. Ескi тYтiктердi тастаймыз.
Сурет - 4. Супернатант
4. Коспага алынган супернатанттыц 0,2 белт мелшершде 5% СТАВ буферш цостыц (120 мкл - 5% СТАВ). Жогары жэне темен тецкеру арцылы араластырамыз.
5. 650С температурада тYтiктердi 10 мин бойы термостаттадыц. «Термостат - Термит. ДНК-технология».
6. Коспага хлороформныц тец келемiн цостыц. Хлороформ - ^шцыш зат. Сол себепт цоспа термостаттан алынган соц, белме температурасында суу керек, сосын барып хлороформ (800 мкл) ц^ямыз. Хлороформды белокты ДНК-дан белiп алу Yшiн цолданамыз.
7. Ротаторда 10 мин араластырдыц.
8. Сынамаларды 5000 айналыммен 10 мин бойы центрифугаладыц. Центрифуга - «Mikro-200. Hettich Zentrifugen»
9. Супернатантты жаца тYтiктерге ауыстырдыц. (Супернатант келемi - 600 мкл) Центрифугадан шайцамай алып, сацина жолацты т^нбага тигiзбей интерфазаны цалдырдыц, бетiндегi сацина жолацца дешнп мелдiр ерiтiндiнi, ягни, мелдiр супернатантты автоматтыц пипетканыц кемепмен абайлап алып, тутастай таза тYтiктерге ауыстырдыц.
10. Преципитацияга (шегу процеш) арналган 2 немесе 1,5 келемде ДНК-ны т^нбага тYсiру Yшiн буфер (900 мкл) ц^ямыз. Коспа пробирканыц жогаргы жолагына дейiн болу керек. Коспа кейде 1000 мкл цамтиды.
11. ТYтiктердi 5-10 рет тецкеру арцылы тYтiктердiц iшiндегi цоспаны араластырдыц жэне белме температурасында бiр тYн бойы цалдырдыц.
Yшiншi ^ш:
12. Сынамаларды 10 000 айналыммен 30 мин бойы центрифугаладыц.
13. Абайлап, т^нбага типзбей, су-агынды соргымен супернатантты алып тастадыц.
14. Т^нбаны ер^у Yшiн тYтiктерге HS-TE буферiн (400 мкл) ц^йдыц, шайцауга болмайды, 5-10 минут 65° С термостаттадыц.
15. Термостаттан алып, белме температурасына дешн суыганда 800 мкл 96° - этанол ц^йып, тYтiктердi 5-10 рет тецкеру арцылы тYтiктердiц iшiндегi цоспаны араластырдыц.
16. (-20° С) муздат;ыш;а кемшде 1 сагат;а ;ойды; (муздат;ышта бiр тун ;алдыруга болады). Муздат;ыштан алганнан кешн тез арада сынамаларды сал;ындатылган центрифугада +40С температурада минутына 10 000 айналыммен 10 минут бойы центрифугалады;. Центрифуга - «Centrifuge 5415 R- eppendorf». Сал;ындат;ышымен центрифуганы ;олданып болганнан соц, ешiрiп ;ою керек, немесе бетш жауып ;ою керек, себебi белменi суытып, двигателi жанып кетедь
17. Су-агынды соргыныц кемегiмен супернатантты тунбага тигiзбей абайлап алып тастады;. Тунбаны 65° С термостатта кеппрдш. Тунба тез кебу yшiн тупктердщ ;а;пагын ашып ;ойган дурыс.
18. Эрбiр пробиркага 200 мкл mQ-H2O ;уйды;, ;оспаны толы; гомогендi жагдайга дейiн вортексте му;ият араластырды;. Yстiне 100 мкл NH4 - ацетатын ;уйды; (сурет - 5).
Сурет - 5. Вортекспен жумыс 1стеу барысы
19. 20-30 мин муз моншасына ^ойдьщ.
20. Муз моншасынан алганнан кешн тез арада сынамаларды сал^ындатылган центрифугада +40С температурасына минутына 13 000 айналыммен 10 минут бойы центрифугаладыщ.
21. Супернатантты жаца тYтiктерге ауыстырдыщ. ДНК - осы кезде ертндще болады. ТYтiктердiц тYбiндегi тунбаны ^алдырамыз. Тунбага тигiзбей автоматтыщ пипетканыц квмегiмен супернатантты абайлап аламыз. Керек емес туздар тунбага тYсуi ыщтимал. Супернатант 300 мкл болады.
22. Преципитацияга (швгу) арналган 2 немесе 1,5 квлемде ДНК-ны тунбага тYсiру Yшiн буфер (900 мкл) ^уямыз. Коспа тYтiктщ жогаргы жолагына дейiн болу керек. Коспа кейде 1000 мкл ^амтиды.
23. Коспаныц 2 квлемiнде 96° - этанол (600 мкл) ^уйдыщ.
24. 1 сагат^а (бiр тYнге ;оюга болады) муздат^ыш^а (-20° С) ^ойдыщ.
25. Муздат^ыштан ала салысымен сынамаларды сал^ындатылган центрифугада +40С температурасында минутына 13 000 айналыммен 10 минут бойы центрифугаладыщ.
26. Су-агынды соргыныц квмепмен супернатантты тунбага типзбей абайлап алып тастадыщ.
27. Эр тупктеп тунбага 100 мкл 80° спирт цуямыз.
28. 10 000 айналыммен 5 минут бойы центрифугаладыц.
29. Су-агынды соргынын кемепмен супернатантты тунбага тигiзбей абайлап альп тастадыц. Тунбаны 65° С термостатта кептiрдiк. Тунбаны ерiту Yшiн эр тYтiкке 100 мкл mQ-H2O цуямыз.
30. Алынган препараттарды 5-10 рет тенкеру арцылы араластырып, (-20° С) муздатцышца цойдыц. ДНК, препараты дайын [4].
Бiр адам 100 сынаманы 100 мин iшiнде ендей алатын эдiстер де бар. Ол Yшiн ДИК-ны белiп алуга цолданылатын CTAB буферш дайындау керек. 1000 мл CTAB буферi Yшiн: 26 г СТАВ, 130 мл 1М Tris-HCl pH-8,0, 52,65 г натрий хлорид^ 26 мл 0,5 м ЭДТА (этилендиаминтетрасiрке цышцылы) ерiтiндiлерiн алып, автоклавтайды, цолданар алдында 2-5% Р-меркаптоэтанол цосады. Алынган Yлгiнi бiркелкi езу Yшiн 3 мм болаттан жасалган тот баспайтын шариктерден туратын келемi 2 мл болатын микроцентрифугалыц тYтiктер цолданылады. Осы цаттаманы цолдана отырып, уацытты Yнемдеуге жэне жогары енiмдi ДИК белiп алуга болады. Эр Yлгi Yшiн шамамен 0,05 доллар царжы кетедi жэне ол эртYрлi еамдштерден, сонын iшiнде Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, цызанац, цырыццабат, бидай, жYгерi, соя, арпа, кYрiш сияцты дацылдардан ДИК-ны сэттi белiп алу Yшiн цолданылган. Сонымен цатар, полисахаридтердiн, полифенолдыц цосылыстардын, илiк заттардын жэне алкалоидтардын ете жогары денгейiн цамтитын улпалардан геномдыц ДИК - ны алу кезшде де осы эдiстi цолдану тиiмдi екенiн керсеткен.
Эдiстiн ттмдшп бастапцы материалдын аз мелшерiн гана цажет етедi, одан да маныздысы, Yлгiнi ластаудан тиiмдi цоргайды. ДИК-ны жуу, шаю жэне тазарту кезiнде есiмдiк улпасына арналган микроцентрифуганын тYтiктерiн пайдаланады. Yлгiнi усацтау кезiнде де аз мелшерде суйыц азотты тутынады. Эдiсте салыстырмалы тYрде аз мелшерде химиялыц реактивтер пайдаланылады, буферлi экстракция процес кезiнде де белу 100 мин. цамтиды. CTAB негiзiнде ДИК-ны белш алу цымбат емес, онай орындалатын, жогары енiмдi, цауiпсiз, жылдам жэне тиiмдi, Yлгiлердiн езара ластануын болдырмайды. Бул эдiс тYрлi ешмдштер Yшiн тиiмдi жэне цымбат реактивтердi цажет етпейдi [5].
Микросателлиттiк маркерлер. Полимеразды тiзбектi реакция жэне ПТР-дщ шарттарын онтайландыру Yшiн праймерлердi тандау микросателлиттiк талдаудын манызды кезенi болып табылады. Микросателлиттiк тiзбектердi амплификациялау Yшiн праймерлердi эзiрлеу Yнемi жэне царцынды тYрде жYргiзiледi. Колда бар элемдш эдебиеттi талдау есiмдiктердiн эрбiр туршщ генетикалыц езгергiштiгiн талдау Yшiн онтайлы кептеген микросателлиттiк локустарды iрiктеп алуга мYмкiндiк бередi. Эсiмдiктердiн генетикалыц езгерпшпгш талдау Yшiн микросателлиттiк локустардын ПТР режимдершщ сипаттамалары кестеге толтырылады.. Кестеде Локус, Праймердщ реттiлiгi (5' - 3'), Мотив, Кыздыру температурасы, 0С, Циклдер саны керсетiлуi тиiс.
ПТР^ дайындау жэне ЖYргiзу. Кант цумайы дацылдарынын микросателлиттiк локустарын амплификациялау Yшiн GenePak® PCR Core («Лаборатория Изоген» ЖШ¥) реагенттерiнiн дайын жиынтыгы пайдаланылады. Реагенттер жиынтыгы «ыстыц сере» Yшiн ингибирленген Taq-ДИК-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаттар жэне тшсшше, сонгы концентрациясы 1U, 200 мкМ жэне 2,5 мМ магний хлорид^ сондай-ац бiр стандартты ПТР^ (PCR diluent) жYргiзу Yшiн онтайландырылган буферлiк жYЙесi бар тYтiктердегi (пробиркалардагы) лиофилденген цургац цоспалар (МастерМикс) болып табылады.
^оспаны жинау жэне ПТР^ ЖYргiзу:
1. Тоталды (тутас) ДИК-ны 50-100 нг/мкл концентрациясына дейiн ертщз.
2. Амплификацияга арналган (МастерМикс) цоспасы бар тYтiкке 0,1-0,5 мкМ усынылатын сонгы концентрациясында зерттелетiн локус ушш айрыцша праймерлердiн 5 мкл цоспасын цосыныз (тура жэне керi).
3. Тупкке 10 мкл ПТР-ерiткiшiн (PCR diluent) цосыныз.
4. Тупкке 5 мкл зерттелетш ДИК-ны цосыныз. Егер амплификация термореттеушз цацпагы бар термоблокта журпзшсе (амплификатордын цурылымына байланысты), онда тупкке цоспанын булануын болгызбас ушш шамамен 20 мкл минералды май цосу керек.
5. ТYтiктердi багдарламаланатын термостаттьщ термоблогына апарьщыз жэне амплификацияныц тиiстi багдарламасын icKe ;осыцыз.
6. Реакция ая;талганнан кешн ПТР emMiMeH тYтiктeрдi электрофорез журпзгенге дeйiн тоцазыт;ышта, немесе одан уза; уа;ыт;а -200С-та са;тайды.
ДН^-ныц амплифицирленген фрагменттерш электрофоретикалык белу. ДНК^-ныц амплифицирленген фрагмeнттeрiн электрофоретикалы; белу тiк электрофорезге арналган камераларда полиакриламидтi гельде (мысалы, «Хеликон» ЖШ¥ шыгарган VE - 20) ;уат кездершщ комплeктiciмeн (Мысалы, «НПФ ДНК-Технология» ЖАК шыгарган «Эльф-4») жYргiзiлeдi. Стандартты узынды;тардыц маркeрi ретнде Hae III немесе Hpa I рестриктазамен ецделген pBr322 плазмиданыц ДН^-сы пайдаланылады. 20-базалы; арнайы ДН^-маркер молекулалы; массаныц баламалы маркeрi болып ;ызмет ат;ара алады [5].
Камераларды куру жэне гельдердi дайындау. Полиакриламидт гeльдi (ПААГ) дайындау кeзiндe 30% АКА-1000 мл., 10х ТЕБ-1000 мл., 10% ПСА-10 мл., Бромистый этидий-1000 мл. eрiтiндiлeр пайдаланылады. Гeльдeгi акриламидтщ соцгы концентрациясы 6%-ды ;урайды. Ертндшермен жумысты ;олгаппен жYргiзу керек. Мысалда ертндшердщ «Хеликон» ЖШК шыгарган, шынысыныц (эйнек) кeлeмi 20 х 20 см VE - 20 бiр стандартты камерасына eceптeулeрi кeлтiрiлгeн.
1. Гeльдeрдi ;уюга арналган шыныны бYЙiрлeрiнeн спейсерлермен, ал теменнен - тертке бYктeлгeн CYЗгiш ;агаздыц жщшке жолагымен тесеп, жуптастырып ;ойыцыз. Осындай «Сэндвичи» бYЙiрiнeн ;ыс;ыштармен бeкiтeдi.
2. Шыныларды ;ую Ycтeлiнe тiгiнeн орнатады.
3. Гeльдi ;ую Yшiн ;оспаны дайындайды: 100 мл eлшeуiш цилиндрге 10 мл ТВЕ х10 eрiтiндiciн, 20 мл 30% АКА ертндюш ;уяды. Кeлeмiн 100 мл-ге жeткiзeдi. 1шшдепсш ста;анга ;уйып, оны магниттi араластыргыш;а орнатады. Тура;ты араластыра отырып 100 мкл ТЕМЕД-т ;осады.
4. Юшкентай ста;анга 20 мл нeгiзгi ;оспаны ;уяды. 50 мкл ТЕМЕД-тi ;осып, магниттi араластыргышта араластырады, 250 мкл 10% ПСА ертндюш ;осады. Тез араластыру керек жэне дереу ;оспаны eкi «сэндвич» арасында тец белш, тeмeнгi жиeгiнeн 1,5-2,5 см бшкпкке гeльдi тыгынды ;уяды.
5. *Ескерту: ТЕМЕДпен ПСА-нъщ мвлшер1 жогары болгандыцтан, тыгын Yшiн гель цоспасы вте тез полимерленедШ!
6. Тыгын полимерлегеннен кешн (3-5 минут) непзп ;оспага 670 мкл 10%-ПСА ертндюш ;осады. Араластырады. Крспаны eкi «сэндвичке» де ;уяды.
7. Эйнектщ ойыгы бар жогаргы шeтi мен тара;ша тютершщ жогаргы шeтi арасында шагын сацылау (2 мм-ге жуы;) ;алдыра отырып, уяшы;тарды ;алыптастыруга арналган тара;шаларды суйы; ;оспасы бар «сэндвичтерге» салады.
8. Гeльдi жары;та, белме температурасында 30 минуттан кем емес полимерлеу керек.
9. Гeльдeрдi полимерлегеннен кешн камераны нус;аулы;;а сэйкес жинайды.
10. Камераны (теменп, содан кeйiн жогаргы белштерш) 1 : 20 ;атынасында бастап;ыдан dH2O-мeн араластырылган ТВЕ электродты буфeрiмeн толтырады. Электродты буфер бiрнeшe рет пайдаланылуы мYмкiн.
11. Шприцп немесе жщшке уштыгы бар пипетканы пайдаланып, абайлап тара;шаларды шыгарады, акриламидтщ полимeрлeнуi нэтижeciндe пайда болган ауа кешршштершен, гель бeлiктeрiнeн жэне судан уяшы;тарды электродты буфермен жуады.
Yлгiлердi полиакриламидтi гельге тYсiру. ПТР Yшiн стандартты ;оспа езшщ ;урамында бромфенолды кек боягышты ;амтиды, бул гельге тYciру жэне сынамалардыц гeльдeгi жылжуын ба;ылау процeciн айтарлы;тай жецшдетедь
1. Зерттелетш ПТР-ешмнщ 3 мкл жщшке уштыгы бар микропипеткага сорып алады.
2. Пипетканыц тумсыгыныц ушын, оны сырт;ы шыныга сэл ;ысыц;ырап, уяшы;;а батырады жэне сынаманы алады.
3. Пипетканыц уштыгын электродты буфермен жуып, ;агаз салфеткамен CYртeдi.
4. Эрбiр гельде фрагменттер узындыгын бацылау маркерш тYсiру Yшiн, гельдщ шеттершен жэне олардыц арасында тец цашыцтыцтарда 2 бос уяшыцты цалдыра отырып, 1.-3.-шi тармацтарды барлыц Yлгiлер Yшiн цайталайды.
5. 2-3 мкл-ден фрагменттер узындыцтарыныц маркерiн цосады [7] .
Электрофоретикалык белу.
1. Камераны электродтары бар цацпацпен жабады.
2. Электродтарды турацты тоцтыц цуат квзiне цосады.
3. Куат квзiн цосу керек. Амплификация вшмдерш электрофоретикалыц бвлудi 300 В кернеуде жэне камерага (2 гель) 110 мА аспайтын ток ^шшде 1,5-2,5 сагат бойы жYргiзу керек.
4. Бромфенол квктщ жолагыныц жылжуы бойынша сынамалардыц жYрiс жолын бацылайды.
5. Бояуыштыц жолы гель узындыгыныц 2/3-не жеткенде, электрофорездi тоцтатады.
6. Куат квзiн вшiредi жэне камераныц цацпагын ашады.
7. Электродты буфердi твгедi.
Гельдi шеш1п алу жэне бояу.
1. Электрофорез б^кеннен соц камераны бвлiктерге бузады.
2. ^ысцыштарды квлденец жагдайда «сэндвичтердщ» бiрiнен алып тастайды. Жогаргы (iшкi) шыныны шешедь Кагаз тыгыннан гельдщ твменгi шетш шпательмен кеседi.
3. Сумен суланган цолгаппен гельдi цолмен абайлап алып, оны бояу Yшiн кюветке апарады. Екiншi гельдi де осылай алады.
4. Гельдердi бiр рет дистиллденген сумен жуып, бромды этидий ертндюш цуяды 3-5 минут жYргiзу керек.
Ескерту: бромды этидий квп рет щолданылатындыщтан, бояу уащыты ерттдтщ «есюруте» байланысты езгерт, 10-15 минутща жету\ мYмкiн.
5. Бояп б^кеннен кешн бромды этидий ертндюш сацтауга арналган швлмекке абайлап цую керек.
6. Кюветтеп гельдер 4-6 рет су цубырыныц суымен жэне бiр рет дистиллденген сумен жуылады.
Электрофорез нэтижелерiн визуалдау (керу) жэне кужаттау. Бвлiну вшмдерш визуалдау жэне цужаттау ультракYлгiн жарыцта трансиллюминатордыц, жэне цорганыш ^цпрт цалпацпен тшсп багдарламалыц жабдыцталуы бар компьютерге, немесе бейненi устап цалуга арналган сыртцы терминалга цосылган цифрлыц фотоаппарат юретш гель-цужаттау жYЙесiнiц квмегiмен жYргiзедi [6].
Электрофорез нэтижелерiн ПААГ-та визуалдау.
1. Гельдi кюветтен алып, трансиллюминатор терезесшщ суланган бетiне цояды. Барлыц цыртыстар мен бYктемелердi жазады.
2. Цорганыш цацпацтыц терезесiн жабады. Трансиллюминатордыц УК-шамдарын цосады.
3. Бейненi компьютерлш багдарлама арцылы устап цалады.
4. Бейнеш цатты дискiде немесе басца тасымалдаушыда сацтайды.
Нэтижелердi оку жэне жазып алу. Алынган бейнелер эртYрлi дарацтардыц микросателлиттiк фрагменттерiнiц узындыгы бойынша (цайталаулар саны) взгергiштiгiн кврсетедi. Электрофорез нэтижелерш фрагменттер узындыгы тYрiнде (нуклеотидтер жуптарында) оциды жэне хаттамаларга туиредь Квплокусты генотиптер эрбiр дарацтыц жеке генетикалыц портретш кврсетедi.
Фрагменттердiц узындыгын оцу, оны белгiлi маркерлiк фрагменттердщ узындыгымен салыстыра отырып, фрагменттiц узындыгын (молекулалыц салмагын) автоматты тYрде аныцтауга мYмкiндiк беретiн арнайы багдарламалыц жабдыцтауды пайдалану арцылы жYргiзедi [2].
Жас мамандарга жумысца орналасу цазiргi кезде елеулi мэселелердiц бiрi, себебi ецбек нарыгындагы жогары бэсекелестiкке байланысты ец тэжiрибелi, бiлiктi, цабiлеттi жэне вз саласын жетiк бiлетiн юкер мамандар гана жогары ацы твленетш жумыс орындарында цызмет атцара алады. Когамда жас мамандардыц бiлiмi мен тэжiрибесiнiц жеткiлiксiз децгейi экономикалыц
дагдарыстар мен ецбек нарыгындагы елеулi езгерютерге экеледь Сол себептi бiлiм беру жуйесш жацгырту аясында галымдардыц назары бэсекеге ;абшетп маманды ;алыптастыру мэселесш шешу [7]. Молекулалы; децгейде зертханалы; жумыстарды жетiк бiлген биолог мамандардыц гылым жолындагы жетiстiктерi улкен мэселелердi шешедi деген yмiттемiз. Олай болса, республика жогары о;у орындарыныц алдында жан-жа;ты дамыган, саяси сауатты, терец теориялы; бiлiммен ;аруланган, игерiлген зерттеушшк бiлiмдер мен бiлiктердi шынайы практикада ;олдана алатын, адамдармен ;арым-;атынас мэдениетш мецгерген маман дайындау мiндетi тур.
na^&ttaHbtttFaH эдебиеттер
1. Назарбаев Н.Э. Болашакка багдар: рухани жацгыру. Астана, 2017. - 5-11 б.
2. Политов Д.В., Белоконь М.М., Белоконь Ю.С. Анализ полиморфизма аллозимов И ДНК хвойных. Методическое пособие к практикуму «Анализ полиморфизма аллозимов и ДНК на примере основных лесообразующих пород». Москва - 2011.
3. Ильинов А.А., Топчиева Л.В., Раевский Б.В. Использование микросателлитных маркеров в изучении генофонда ели финской Picea х Fennica (Regel) Ком. в Карелии.
4. Калаева В.Н., Землянухина О.А., Карпеченко И.Ю., Карпеченко К.А., Кондратьева А.М., Вепринцев В.Н., Карпеченко Н.А., Карпова С.С. Разработка метода получения препарата суммарной ДНК высокого качества из растений рода Rhododendron // Научный журнал - Фундаментальная исследования. - 2012. -№ 5-1. - с. 148-152.
5. Deshui Yu, Ju Zhang, Guangxuan Tan, Ningshu Yu, Qiuyue Wang, Qiqi Duan, Xin Qi, Mingjiao Cheng, Chunxue Yan, Zhangkun Wei, Zhenmiao Yu, Wenchao Huang, Chengwei Li. An Easily-performed High-throughput Method for Plant Genomic DNA Extraction. Analytical Biochemistry. Methods in the Biological Sciences. 19 January 2019.
6. Потокина Е.К., Орлова Л.В., Вишневская М.С., Алексеева Е.А., Потокин А.Ф., Егоров А.А. Генетическая дифференциация популяций ели на Северо-Западе России по результатам маркирования микросателлитных локусов // Экологическая генетика. Том X. №2. 2012.
7. Стручкова И.В., Кальясова Е.А. Теоретические и практические основы проведения электрофореза белков в полиакриламидном геле. Электронное учебно-методическое пособие. Нижний Новгород. 2012.
8. Резник С.Д., Сочилова А.А. Личная конкурентоспособность студента вуза: Система и механизмы. Известия Пензенского Государственного педагогического университета им. В.Г.Белинского. Общественные науки. №24. 2011.
ФОРМИРОВАНИЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ КОМПЕТЕНЦИИ СТУДЕНТОВ -БИОЛОГОВ НА ОСНОВЕ МЕТОДА МИКРОСАТЕЛЛИТНОГО АНАЛИЗА
Д.М. Мукашева 1, Р.К. Жексембиев 2, Е.А. Киршибаев 3 1PhD 3 курс, 6Б011300-Биология, 2к.б.н., профессор, 3к.б.н., и.о. ассоц. профессор, 1,2,3 Казахский государственный женский педагогический университет, г. Алматы, Казахстан,
email: [email protected]
В данной статье для студентов-биологов представлена методика проведения микросателлитного анализа. Совмещение научной теории и практики и создание условий для использования оборудования, реактивов и методов их применения при выполнении микросателлитного анализа во время лабораторных занятий способствует формированию научно-исследовательской компетенции у специалистов-биологов. Освоение методов выполнения экспериментальной работы при помощи современного оборудования на молекулярном уровне, применение, анализ, синтезирование, предложение новой продукции посредством выполнения исследовательских работ в целях модернизации экономики страны, также факторы повышения функциональной грамотности, бесспорно, являются для студентов-биологов необходимыми предпосылками их развития. Поэтому в целях реализации вышеперечисленных факторов очень важно освоить микросателлитный анализ. Предопределение новых элементов для создания нового содержания и их связь с
творчеством, образование, направленное на создание новой модели (структуры) с опорой на личный опыт, на сегодняшний день является одной из главных задач.
Ключевые слова: ДНК, сахарное сорго, проба, полимеразная цепная реакция (ПЦР), праймер
FORMATION SCIENTIFIC AND RESEARCH COMPETENCE OF BIOLOGY STUDENTS ON THE BASE OF MICROSATELLITE ANALYSIS METHOD
D.M. Mukasheva1, R.K. Zhexembiyev 2, Ye.A. Kirshibayev3
1PhD student in specialty 6D011300-Biology, 2 Cand. Sci. (Biology), Professor, 3 Cand. Sci. (Biology), Acting Associate Professor 1,2,3 Kazakh National Women's Teacher Training University, Almaty, Kazakhstan email: [email protected]
The technique of carrying out microsatellite analysis designed for biology students is presented in this article. Combining scientific theory and practice and creating conditions for use the equipment and reactants in laboratory classes as well as methods of their use at implementation microsatellite analysis advantages to develop research competence of biology experts. Mastering methods of conducting experimental work by means of modern equipment at the molecular level, application, analysis, synthesizing, offering new products by performing researches for the purpose of national economy modernization, also factors of increasing functional literacy undoubtedly are thought to be necessary prerequisites for biology students development. Therefore, in order to implement the above mentioned factors is very important to master microsatellite analysis. Predetermination of new elements for generation new contents and their connection with creativity, education directed on creation new model (structure) based on personal experience is believed to be one of the main tasks today.
Key words: DNA, sugar sorghum, probe, polymerase chain reaction (PCR), primer.
Редакцияга 10.08.2019 цабылцанды
