CC BY
6УДК: 616.22-006:612.083.3
МИКРООРГАНИЗМЫ В ОПУХОЛЕПОДОБНЫХ ОБРАЗОВАНИЯХ ГОЛОСОВЫХ СКЛАДОК
Е. В. Ильинская1, 2, Ю. Е. Степанова2, Е. Е. Корень2, А. Ю. Юрков2, В. А. Косенко2 MICROORGANISMS IN TUMOR-LIKE SWELLINGS OF VOCAL FOLDS E. V. Iljinskaya, Y. E. Stepanova, E. E. Koren, A. Y. Yurkov, V. A. Kosenko
1 ФБГУ «НИИ гриппа Минздравсоцразвития РФ»
(Директор - акад. РАМН, проф. О. И. Киселев)
2 ФБГУ «СПбНИИ уха, горла, носа и речи Минздравсоцразвития РФ»
(Директор - засл. врач РФ, проф. Ю. К. Янов)
Электронно-микроскопическое исследование шести опухолеподобных образований голосовых складок выявило присутствие бактерий во всех образованиях и наличие вирусных частиц в вакуолях фибробластов у двух больных. Бактерии обнаружены на поверхности эпителия, в межклеточном пространстве, цитоплазме эпителиальных клеток, основном веществе соединительной ткани и фибробластах; выявлены делящиеся формы.
Ключевые слова: голосовые складки, опухолеподобные образования, бактерии.
Библиография: 13 источников.
The electron microscopic observation has revealed presence of bacteria of the six tumor-like swellings of vocal folds and presence of virus particles in vacuoles of fibroblasts at two patients. The bacteria are found on a surface of an epithelium, in intercellular space, in citoplasm of epithelial cells, in the basic material of the lamina propria and in fibroblasts; the divided forms are revealed.
Key words: vocal folds, tumor-like swellings, bacteria.
Bibliography: 13 sources.
Носительство условно-патогенных и патогенных микроорганизмов выявляется более чем у 40% человеческой популяции [1]. Термин «бактерионосительство» подразумевает нахождение патогенного или условно-патогенного микроорганизма на кожных покровах или слизистых оболочках открытых полостей, не сопровождающееся его дальнейшим проникновением во внутреннюю среду макроорганизма или развитием клинической симптоматики. Возможность носительства показана для целого ряда кокков, дифтерийной палочки и др. [1, 5]. Доказано, что «бессимптомное носительство» условно-патогенной и патогенной флоры свидетельствует о нарушении механизмов защиты организма и является маркером вторичной иммунной недостаточности [6]. Кроме носительства определяется еще и явление персистенции бактерий и вирусов в тканях организма, протекающее в течение некоторого времени без клинических проявлений. Эти два явления безусловно способны быть постоянным источником для развития инфекционного процесса. Что касается полости рта, то наиболее изученными с точки зрения взаимоотношений микроорганизмов и ткани являются миндалины. На слизистой оболочке миндалин выявлено как бессимптомное носительство условно-патогенной и патогенной микрофлоры [6], так и наличие микробов в тканях миндалин [3, 7].
Сведений о выявлении микроорганизмов в слизистой оболочке опухолеподобных образований голосовых складок в доступной литературе обнаружить не удалось.
Цель исследования. Электронно-микроскопическое исследование наличия, локализации и взаимоотношения микроорганизмов с клетками слизистой оболочки шести опухолеподобных образований голосовых складок.
Пациенты и методы исследования. Материалом для электронно-микроскопического исследования послужили шесть различных новообразований голосовых складок от 5 больных:
- отечный полип голосовой складки (больной С.);
- фиброзный полип голосовой складки (больной П.);
- жесткий узелок голосовой складки (больной Ф.);
Российская оториноларингология № 6 (55) 2011
- мягкий узелок правой голосовой складки (больная К.) и киста левой голосовой складки этой же больной.
Подробное описание обработки материала для ультраструктурного анализа приведено в публикации [8]. У 4 больных были проведены микробиологические исследования мазков из области гортани. Забор мазков на микрофлору из гортани осуществляли перед удалением полипов, до вливания в гортань анестезирующего раствора при местной анестезии. В условиях наркоза при прямой ларингоскопии непосредственно перед введением интубационной трубки в гортань брали мазок с поверхности голосовых складок. Во всех случаях забор осуществляли стерильным ватным тампоном, а затем содержимое переносили на питательные среды. Идентификацию резистентных и условно-патогенных микроорганизмов осуществляли общепринятыми методами согласно методическим рекомендациям к приказу № 535 МЗ РФ.
Результаты исследования. Микробиологические исследования мазков из области гортани показали наличие патогенной и условно-патогенной микрофлоры у трех (больные П., С., М.) из обследованных четырех больных (больные П., С., М., Ф.). У больных П., С. и М. обнаружен значительный рост микрофлоры, у больного Ф. роста микрофлоры не выявлено. Больной К. микробиологическое исследование мазков не проводилось. При электронно-микроскопическом исследовании шести опухолеподобных образований голосовых складок во всех случаях были обнаружены бактерии и у двух больных, помимо бактерий, выявлено наличие вирусов.
У больного П. в результате исследования посевов мазков выявлено значительное наличие Micrococcus cataralis, Streptococcus viridens, Streptococcus группы А. При электронномикроскопическом исследовании ангиоматозного полипа левой голосовой складки больного П. обнаружено присутствие микроорганизмов как в эпителиальной, так и в соединительнотканной частях полипа. Бактерии представляли собой микробные клетки округлой или овальной формы размером от 200 нм до 1 мкм. Обнаружена внеклеточная и внутриклеточная локализация бактерий. Микробы присутствовали на поверхности эпителия, в межклеточном эпителиальном пространстве (рис. 1), эпителиоцитах, среди основного вещества соединительной ткани, в фибробластах. У форм, находящихся вне клеток, различима микрокапсула. У бактерий, обнаруживаемых внутри клеток полипа, микрокапсула отсутствует. В некоторых бактериях отчетливо виден нуклеоид, иногда в электронно-темной цитоплазме можно различить мелкие вакуоли и единичные рибосомы. Нередко встречались бактерии в стадии деления (рис. 1). Размножающиеся бактерии обнаружены только вне клеток полипа - над эпителием и в межклеточном пространстве. Иногда встречались разрушающиеся бактериальные клетки. Кроме того, у данного больного на электронно-микроскопических срезах ткани полипа были выявлены вирусы (рис. 2). Скопление вирусных частиц обнаружено в вакуолях фибробласта в подэпителиальной области соединительнотканной части полипа. Вирусы представляли собой округлые частицы размером 50-70 нм с отчетливым поверхностным комплексом.
•' І УІ УжШ - и -'Щ Л г Щ І! .
Sf ” . • * ' ~ • • • h. -ТІь..
‘і
Вч If ■- я
V у t • 'ш Вч fM ■k
л ІШ
Рис. 1. Электроннограмма эпителия ангиоматозного полипа (больной П.). Бактерии располагаются над эпителием и в межклеточном пространстве. Многие бактерии находятся в стадии деления. Бд - бактерии в стадии деления, ЭК - эпителиальная клетка.
Рис. 2. Электроннограммма фибробласта из соединительнотканной части ангиоматозного полипа (больной П.). Вч - вирусные частицы, Ф - фибробласт, Я -ядро.
Рис. 3. Электроннограмма эпителия отечного полипа Рис. 4. Электроннограмма участка соединительной
(больной С.). Бактерии располагаются в межклеточ- ткани отечного полипа (больной С.). Бактерия нахо-
ном пространстве. Б - бактерии, ЭК - эпителиальная дится в цитоплазме отростка фибробласта. Б - бакте-
клетка. рии, Ф - фибробласт.
При микробиологическом исследовании мазков больного С. выявлен значительный рост Micrococcus cataralis и Streptococcus viridens. В ходе электронно-микроскопического исследования отечного полипа правой голосовой складки этого больного обнаружены единичные бактериальные клетки в межклеточном пространстве эпителиальной части (рис. 3), межклеточном веществе соединительной ткани и цитоплазме фибробластов (рис. 4). Массового присутствия бактерий ни на поверхности эпителия, ни в ткани полипа не было выявлено. Обнаруженные бактерии имели округлую форму и размеры от 200 до 400 нм. Часть бактерий, расположенных в соединительной ткани в подэпителиальной области, отличалась однородной цитоплазмой средней электронной плотности и довольно мощной клеточной стенкой без отчетливой микрокапсулы. У некоторых бактерий, имевших относительно тонкую стенку и находящихся в цитоплазме фибробластов, вокруг бактериальной мембраны имелась светлая область, напоминающая микрокапсулу. Делящихся бактериальных форм в этом материале не выявлено.
У больного М. мазки из области гортани продемонстрировали значительный рост микрофлоры Micrococcus cataralis и Streptococcus anhaemolytic. На электронно-микроскопическом уровне на поверхности эпителия фиброзного полипа голосовой складки больного М. микроорганизмы не были выявлены. В исследованных фрагментах ткани бактерии отсутствовали в межклеточном пространстве эпителиального слоя и эпителиоцитах. В соединительнотканной области единичные бактерии встречались в основном веществе межклеточного пространства (рис. 5). Бактериальные клетки преимущественно были округлыми или овальными размером от 200 до 500 нм, имели электронно-темную цитоплазму и тонкую слабо выраженную микрокапсулу. Кроме того, бактерии были обнаружены в цитоплазме фибробластов (рис. 6). Внутриклеточно обычно встречались группы бактерий. Размер некоторых микроорганизмов достигал 1 мкм, и микрокапсула у этих форм не определялась. Цитоплазма бактерий, находящихся внутри клеток, была более светлой по сравнению с формами, присутствовавшими во внеклеточном пространстве. В центре некоторых бактериальных клеток различим нуклеоид, а по периферии цитоплазмы располагаются электронно-темные гранулы включений. Иногда встречались бактерии, в которых определялась перетяжка, свидетельствующая о делении микроорганизма.
При микробиологическом исследовании мазков больного Ф. не выявлено роста микрофлоры. Однако на ультратонких срезах жесткого узелка голосовой складки больного Ф. были обнаружены бактерии. Микроорганизмы находились как в эпителии, так и в соединительной ткани преимущественно в цитоплазме клеток. Бактерии имели округлую или овальную форму, размер от 200 до 700 нм, некоторые достигали 1 мкм, микрокапсула отсутствовала. Для цитоплазмы микробов характерно своеобразное чередование электронно-темных и электронносветлых областей. В цитоплазме эпителиоцита обнаружены делящиеся бактерии (рис. 7). В соединительнотканной области микроорганизмы встречались в цитоплазме фибробластов и нередко в цитоплазме макрофагов, а также в макрофагах, проникших в эпителиальный слой.
Российская оториноларингология № 6 (55) 2011
Рис. 5. Электроннограмма бактерии в основном веществе соединительной ткани фиброзного полипа (больной М.). Б - бактерии, Кв - коллагеновые волокна.
Рис. 6. Электроннограмма соединительнотканной области фиброзного полипа (больной М.). Бактерии находятся в цитоплазме фибробласта. Б - бактерии, Бд -бактерии в стадии деления, Ф - фибробласт, Я - ядро.
Кроме того, на некоторых участках поверхности эпителия обнаружены многочисленные округлые электронно-темные структуры, размером менее 100 нм (рис. 8). Наблюдаются тесная адгезия на поверхностной утолщенной мембране эпителиоцитов этих частиц и их отсутствие в инвагинациях и складках люминальной мембраны.
У больной К. результаты микробиологического обследования отсутствуют. У этой больной опухолеподобные образования удалены с обеих голосовых складок. Электронномикроскопическое исследование мягкого узелка правой голосовой складки выявило наличие бактерий как на поверхности эпителия, так и в соединительной ткани. Размер бактериальных клеток варьировал от 200 до 700 нм, некоторые делящиеся формы достигали 1 мкм. У люминальной поверхности эпителия бактерии встречались редко и были единичными. В эпи-телиоцитах и межклеточном пространстве эпителиальной области исследованных образцов микробы не выявлены. В соединительной ткани бактерии обнаружены вне клеток (рис. 9) и в цитоплазме макрофагов и фибробластов (рис. 10). На некоторых участках основной пластинки, сразу под эпителием, обнаружены скопления бактерий (рис. 11). Эти бактериальные клетки имели округлые, овальные, иногда слегка изогнутые очертания, утолщенную стенку и электронно-светлую цитоплазму с незначительным увеличением ее плотности на периферии. Отчетливой микрокапсулы снаружи бактериальной стенки не обнаружено. Бактерии, обнаруженные в цитоплазме макрофагов и фибробластов, выглядели иначе. У этих бактерий стенка не была утолщенной, а в цитоплазме средней электронной плотности обнаруживались электронно-темные включения. В ряде клеток был различим нуклеоид, изредка встречались формы, составленные из двух частей, т. е. из неразошедшихся дочерних бактерий.
Рис. 7. Электроннограмма бактерий в цитоплазме клетки эпителия жесткого узелка (больной Ф.). У некоторых бактерий видны перетяжки деления. Б - бактерии, Бд -бактерии в стадии деления, ЭК - эпителиальная клетка.
Рис. 8. Электроннограмма поверхности эпителия жесткого узелка (больной Ф.). Видна тесная адгезия электроннотемных структур на утолщенной люминальной мембране эпителиоцитов. ЭК - эпителиальная клетка.
Рис. 9. Электроннограмма соединительнотканной области мягкого узелка правой голосовой складки (больная К.). Бактерии находятся в основном веществе между коллагеновыми волокнами. Некоторые бактерии находятся в стадии деления. Б - бактерии, Бд - бактерии в стадии деления, Кв - коллагеновые волокна.
Рис. 10. Электроннограмма подэпителиальной области соединительной ткани мягкого узелка (больная К.). Видны многочисленные бактериальные клетки. Б - бактерии.
Рис. ii. Электроннограмма участка соединительной ткани кисты (больная К.). Бактерии видны в вакуолях фрагментов разрушенного фибробласта. Б - бактерии, Ф - фибробласт.
Рис. 12. Электроннограмма фибробласта из соединительной ткани кисты (больная К.). В вакуоли видны вирусные частицы. Вч - вирусные частицы, Ф - фибро-бласт, Я - ядро.
В исследованных образцах кисты левой голосовой складки больной К. на поверхности эпителия, в межклеточных промежутках и эпителиальных клетках бактерий не обнаружено. В соединительнотканной области немногочисленные бактерии выявлены в цитоплазме фи-бробластов и во фрагментах разрушающихся клеток (рис. 12). Микробы представляли собой округлые образования размером 200-500 нм с отчетливой мембранной стенкой. Микрокапсула отсутствовала, цитоплазма средней электронной плотности содержала единичные электронноплотные включения. Кроме того, в цитоплазме фибробласта была обнаружена вакуоль, содержащая вирусные частицы округлой формы размером около 50-70 нм с фибриллярными структурами на поверхности капсида.
Обсуждение. Известно, что микробные провокаторы играют этиологическую роль во многих острых и хронических заболеваниях ЛОР-органов. Однако решение вопроса об определенном значении инфекционного агента (патогенных, непатогенных и условно-патогенных бактерий) в возникновении заболевания связано с объективными трудностями, так как бактерии в условиях физиологической нормы являются в той или иной степени постоянными обитателями ротовой полости и верхних дыхательных путей. Существует много мукозальных патогенов, которые могут проникать и персистировать в эпителиальных клетках человека. Например, зарегистрировано наличие Streptococcus pyogenes в респираторных, фарингеальных эпителиальных клетках и макрофагах [13]. Так, стрептококки группы А обычно связаны с фарингитами, но есть свидетельства об их потенциях проникновения в глубокие слои ткани и кровеносную си-
Российская оториноларингология № 6 (55) 2011
стему [11]. Однако совершенно не ясна возможность влияния бактерий на возникновение новообразований, и в частности, в области голосовых складок. Как правило, в качестве причин поли-пообразования голосовых складок называют травму или химические раздражители [4, 10, 12]. В этой связи, возможно, особенное значение приобретают наши электронно-микроскопические исследования, в результате которых у всех больных в различных типах опухолеподобных образований голосовых складок были обнаружены микроорганизмы.
Бактерии были обнаружены в двух случаях (больной П. и больная К.) у поверхности эпителия, причем у больного П. в значительном количестве. У трех больных (П., Ф., С.) микробные агенты выявлены в пределах эпителиальной области в межклеточном пространстве и в том числе, в эпителиальных клетках (больные П. и Ф.). Во всех шести образованиях микробные клетки обнаружены в соединительной ткани, причем как во внеклеточном пространстве, так и в цитоплазме фибробластов и макрофагов. Внутриклеточная локализация бактерий, как известно, делает их труднодоступными для антибиотикотерапии. Представительство в цитоплазме клеток не просто единичных бактерий, а скоплений микробов, и особенно делящихся форм, свидетельствует о довольно успешном их существовании.
Подавляющее большинство бактерий имели округлую или слегка овальную форму. Размеры клеток колебались от 200 нм до 1 мкм. Безусловно, неблагоприятным признаком являются делящиеся формы, обнаруженные у четырех (П., М., Ф., К.) из 5 больных. По морфологическим признакам обнаруженные бактерии условно можно объединить в четыре группы:
- клетки с видимой одноконтурной мембраной и электронно-темной цитоплазмой (или чередованием темных и светлых участков);
- бактериальные клетки с двухконтурной мембраной, цитоплазмой умеренной электронной плотности и электронно-темными периферийными включениями;
- бактерии, похожие на предыдущую группу, но не содержащие электронно-темных цитоплазматических включений;
- формы, имеющие утолщенную стенку и относительно электронно-светлую цитоплазму.
Все типы бактерий не были обнаружены ни в одном образовании. Однако у каждого больного выявлены бактерии, как минимум, двух разных типов. Присутствие микрокапсулы не было обязательной принадлежностью, особенно при локализации бактерий внутри клеток. Наличие у многих форм нуклеоида и мезосом является дополнительным аргументом для отнесения обнаруженных образований к разряду бактериальных клеток. По структуре все выявленные бактерии можно отнести к коккам, однако, по мнению Золотарева с соавторами [2], достоверная идентификация патогенов возможна лишь после выделения чистой культуры с исследованием комплекса ее свойств. Результаты микробиологического исследования, определяющего вид микробной флоры в мазках, к сожалению, невозможно прямо экстраполировать на бактерии, обнаруженные в ткани, так как внутритканевой видовой состав бактерий может не совпадать с выявленным в мазках. Например, у больного Ф., несмотря на отсутствие роста патогенной микрофлоры при посеве мазков, при электронно-микроскопическом исследовании обнаружены скопления бактерий и в пределах эпителия, и в соединительной ткани.
Известно, что большая группа вирусных возбудителей, куда входят аденовирусы, ринови-русы, вирусы гриппа и др., ответственна за острые респираторные заболевания, при которых возникает острое воспаление слизистой оболочки. При этом все больше появляется свидетельств о значении сочетанной бактериально-вирусной инфекции, например, в генезе острых и хронических тонзиллитов. Так, у больных с осложненными тонзиллитами обнаружены аденовирусно-стрептококковые ассоциации. При электронно-микроскопическом исследовании опухолеподобных образований голосовых складок нами у двух больных (П., К.) обнаружено наличие вирусных частиц в вакуолях фибробластов. Характер строения и размер частиц дают возможность предположить, что это аденовирусы, хотя персистенция в клеточных вакуолях больше характерна для вирусов гриппа. В соединительнотканной области нодозных образований больных (П. и К.) присутствовали и бактерии, но относятся ли последние к стрептококкам сказать, определенно затруднительно. В настоящее время не подвергаются сомнению явления латенции, обусловленные длительным существованием в клетках субвирусных компонентов, но скрытое существование целых вирусных частиц до сих пор дискутируется,
поскольку не ясны механизмы и особенности ацитопатогенных форм взаимоотношений вирусов и клеток.
Таким образом, результаты наших электронно-микроскопических исследований, свидетельствующие о наличии бактерий и вирусов в тканях опухолеподобных образований голосовых складок, заставляют обратить внимание на возможную этиологическую роль бактериальновирусных агентов в возникновении доброкачественных новообразований голосовых складок.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дерябин Д. Г. Стафилококки: экология и патогенность. - Екатеринбург: УО РАН, 2000. - 239 с.
2. Золотарев А. Г., Дармов И. В., Пименов Е. В. Возбудители особо опасных инфекционных заболеваний бактериальной природы. Морфология и ультраструктура. - М.: Медицина, 2006. - 267 с.
3. Ильинская Е. В., Мальцева Г. С. Ультраструктурные особенности миндалин больных хроническим тонзиллитом // Рос. оториноларингология. - 2008. - № 5. - С. 67-72.
4. Клинико-морфологическая характеристика доброкачественных опухолеподобных образований голосовых складок / Ю.С. Василенко [и др.] // Вестн. оториноларингологии. - 1999. - № 1. - С. 24-27.
5. Костюкова Н. Н. Начальный этап инфекционного процесса - колонизация и пути ее предотвращения // Журн. микробиологии. - 1989. - № 9. - С. 30-44.
6. Некоторые иммунологические механизмы формирования бессимптомного носительства условно-патогенной и патогенной микрофлоры небных миндалин у первичных доноров плазмы крови / В. Ф. Кузнецов [и др.] // Цитокины и воспаление. - 2003. - Т. 2, № 4. - С. 27-30.
7. Пальчун В. Т. Развитие проблемы хронического тонзиллита // Вестн. оториноларингологии. - 2006. - № 6. -С. 7-8.
8. Сравнительное ультраструктур ное исследование полипов голосовых складок / Е. В. Ильинская [и др.]. Рос. оторинолар., 2009. - Прилож. № 2. - C. 329-338.
9. Хронический тонзиллит. Клиника и иммунологические аспекты. / М.С. Плужников [и др.]. - СПб.: Диалог, 2005. - 222 с.
10. Dikkers F. G., Nikkels P. G. J. Benign lésions of the vocal folds; histopathology and phonotrauma // Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. - 1995. - Vol. 104. - N 9, pt. 1. - P. 698-703.
11. Group A streptococci efficiently invade human respiratory epithelial cells / D. LaPenta [et al.] // Microbiology. -1994. - Vol. 91, N 3. - P. 12115-12119.
12. Kleinsasser O. Pathogenesis of vocal cord polyps // Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. - 1982. - Vol. 91, N 4, pt. 1. - P. 378381.
13. Intracellular reservoir of Streptococcus pyogenes in vivo: a possible explanation for recurrent pharyngotonsillitis / A. Osterlund [et al.] // Laryngoscope. - 1997. - V. 107, № 5. - P. 640-647.
Ильинская Евгения Васильевна - вед. науч. сотрудник лаборатории структурной и функциональной протео-мики НИИ гриппа, ст. науч. сотрудник отдела физиологии и патологии голоса и речи НИИЛОР. 190013, Санкт-Петербург, ул. Бронницкая, д. 9; e-mail: ivi-2008@yandex.ru; Степанова Юлия Евгеньевна - д-р мед. наук, руководитель отдела физиологии и патологии голоса и речи НИИЛОР. 190013, Санкт-Петербург, ул. Бронницкая, д. 9; тел.: 8(812)316-41-17, e-mail: lor-obchestvo@bk.ru; Корень Елена Евгеньевна - врач оториноларинголог-фониатр фо-ниатрического отделения НИИЛОР. 190013, Санкт-Петербург, ул. Бронницкая, д. 9; тел.: 8(812)316-41-17, e-mail: lor-obchestvo@bk.ru; Юрков Александр Юрьевич - ст. науч. сотрудник отдела физиологии и патологии голоса и речи НИИЛОР. 190013, Санкт-Петербург, ул. Бронницкая, д. 9; тел.: 8(812)316-41-17, e-mail: lor-obchestvo@bk.ru; Косенко Валентина Александровна - врач-бактериолог лабораторного отдела НИИЛОР. 190013, Санкт-Петербург, ул. Бронницкая, д. 9; тел.: 8(812)317-84-43.
