CC BY
24УДК 616.992.282:61^.34:616,329:616-097-022
ИЗУЧЕНИЕ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПИЩЕВОДА ПРИ КАНДИДОЗЕ У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННОГО БОЛЬНОГО
'Степанова А.А. (вед.н.сотр.)*, 2Шевяков М.А. (профессор кафедры), 'Авдеенко ЮЛ. (ст.н.сотр.), 'Синицкая И.А. (ст.н.сотр.), 'Чилина Г.А. (зав. лаб.)
'НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашки на ГОУ ДПО СПб МАПО;2 кафедра клинической микологии, иммунологии и аллергологии ГОУ ДПО СПб МАПО, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2011
Показано, что у ВИЧ-инфицированного пациента при кан-дидозе пищевода, вызванном Candida albicans, разрушения слизи-стой оболочки протекало не мозаично, а зонально. Выявили уча-стие клеток эпителия пищевода в элиминации элементов гриба, а также бактерий.
Ключевые слова: ВИЧ-инфекция, кандидоз, Candida albicans, пищевод, ультраструктура, эпителий
STUDY OF OESOPHAGUS MUCOUS MEMBRANE IN HIV-INFECTED PATIENT WITH CANDIDOSIS
'Stepanova A.A. (leading researcher), 2Shevyakov M.A. (professor of the chair), 'Avdeenko Y.L. (senior researcher), 'Sinitskaya I .A. (senior researcher), 'Chilina G.A. (head of the laboratory)
1 Kashkin Research Institute of Medical Mycology of SEI APE SPb MAPE;2 Department of Clinical Mycology, Immunology and Allergology, SEI APE SPb MAPE, Saint Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2011
It is shown that in a HIV-infected patient with the oesophageal candidosis caused with Candida albicans, mucous membrane destructed not mosaic, but zonally. Participation of oesophageal epithelium cells in elimination of fungal elements and also bacteria have been shown.
Key words: Candida albicans, candidosis, epithelium, HIV-infection, oesophagus, ultrastructure
ВВЕДЕНИЕ
Проблемы изучения патогенеза кандидоза у больных с ВИЧ-инфекцией остаются актуальными [1, 2]. Целью настоящего исследования было апробировать комплекс методов для изучения патоморфологии слизистой оболочки пищевода у больного кандидо-зом на фоне ВИЧ-инфекции (культурально-морфологические, световая, сканирующая и просвечивающая электронная микроскопия).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
При первичном (до применения антифунгальной терапии) эндоскопическом осмотре практически на всей поверхности слизистой оболочки пищевода у ВИЧ-инфицированного пациента мужского пола (К., 46 лет) были выявлены массивные фибринозные творожистые налеты бело-серого цвета. Диагноз кандидоза был подтвержден обнаружением гиф мицелия Candida spp. при исследовании мазков-отпечатков слизистой оболочки пищевода и гистологическом изучении парафиновых срезов биоптата, окрашенных гематоксилин-эозином и реактивом Шиффа (Рис. 1к).
Биоматериалы пациента были использованы в культуральном исследовании, а также для световой, сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии. Биоптаты (щипцовая биопсия) слизистой оболочки средне-грудного отдела пищевода, полученные с помощью эндоскопа марки Olympus GIF-Е, помещали в две пробирки с фиксатором для последующего изучения в сканирующем и просвечивающем электронном микроскопах. Попутно для определения видовой принадлежности гриба третий биоптат переносили на питательную агаризованную среду Сабуро (pH 5,7) и выдерживали при 37 “С в течение 7 суток. Затем проводили съемку колонии гриба с помощью микроскопа AxioCam MR 5 фирмы Carl Zeiss. С целью детального изучения морфологии клеток выделенной культуры небольшой кусочек питательной среды с колонией гриба фиксировали для сканирующей (Рис. 1д) и просвечивающей (Рис. 1е) электронной микроскопии. Также небольшую часть колонии гриба переносили микробиологической петлей в раствор 1% метиленового синего на предметном стекле, накрывали предметным стеклом и изучали в световом микроскопе Leica DM LB при увеличении хЮОО.
* Контактное лице: Степанова Амалия Аркадьевна Тел.: (812) 303-51-40
m л ия
Рис. 1. Фрагменты поверхности эпителия пищевода ВИЧ-инфицированного пациента в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ, a-и), световая микроскопия полутонких эпоксидных срезов (к-м) и общий вид колонии С. albicans (н, натуральная величина). Условные обозначения (здесь и на рис. 2): Б - бактерии;
БМ - базальная мембрана; БС - базальный слой; ВЧ - вирусоподобные частицы; Г - гало; ДКГ - дрожжевая клетка гриба; КМ - клетка мицелия; КС - клеточная стенка; КСЭ - клетка слизистого эпителия; М - мицелий; ОКМ - отмершая клетка мицелия; ОДКГ - отмершая дрожжевая клетка гриба; Пл - плазмалемма; ПМ - поверхностный мицелий; ПДКГ - почкующаяся дрожжевая клетка гриба; РТ - ростковая трубка; С - септа; Я - ядро. Цифрами (рис. Зв,д,е) показаны слои клеточной стенки,
стрелками (Рис. Зж) - светлый ободок в составе рубчика.
Ув.: а - х4200; б - х1700; в - х1600; г - х2000; д - хЗООО; е - х2700; ж - х1500; з, и - х1200; к - х400; л - х900; м - х1000
Для сканирующей электронной микроскопии биоптаты фиксировали 3 часа в 3% растворе глута-ральдегида на веронал-ацетатном буфере (pH 7,2) при комнатной температуре, проводили через серию спиртов возрастающей концентрации (30, 50 и 70°), обрабатывали в приборе (НСН-2) для высушивания в критической точке. Образцы приклеивали двусторонним скотчем на металлические столики и напыляли золотом на приборе для ионного напыления металлов марки IB-3. Материал исследовали в сканирующем электронном микроскопе марки JSM 6390-LA фирмы Jeol.
Для просвечивающей электронной микроскопии биоптаты фиксировали по методике, описанной нами ранее [3]. С целью предварительного светооптического изучения материала с эпоксидных блоков на приборе «Пирамитом» марки LKB 11800 получали полутонкие эпоксидные срезы толщиной 1-2 мкм, которые препаровальной иглой помещали на предметное стекло в каплю 50% ацетона, после испарения которого срезы окрашивали толуидиновым синим, заключали в Bio Mount (синтетическая среда для заключения срезов под покровное стекло) и исследовали в световом микроскопе Leica DM LB для выбора участка блока с наибольшей концентрацией клеток гриба. После Этого на пирамитоме проводили заточку блоков для последующей ультрамикротомии с помощью стеклянных ножей на ультратоме LKB-V. Сетки с ультратонкими срезами контрастировали 10 минут в 2% растворе уранилацетата, затем 5 минут в растворе цитрата свинца и исследовали в электронном микроскопе Jem-100SX.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Сканирующая электронная микроскопия поверхности биоптата. При просмотре поверхности слизистого слоя биоптата, обращенного в полость пищевода, в сканирующем электронном микроскопе выявили следующие друг за другом участки: 1) с интактной поверхностью, имеющей вид плотно расположенных, сильно извилистых, невысоких гребневидных складок, лишенных грибов, бактерий и вирусов |® 5% От общей площади биоптата) (Рис. 1а); 2) с вышеописанным микрорельефом поверхности, но редкими одиночными, продольно ориентированными дрожжевыми клетками гриба, сохраняющими эллипсоидную форму, но имеющими слегка (Рис. 16) либо сильно деформированные очертания поверхности клеточных стенок и ростковые трубки, полностью погруженные в слизистый слой. Здесь также выявили многочисленные поверхностные или в разной степени погруженные бактерии и редко -скопления из небольшого числа (от 2 до 6) палочковидных (в среднем, 9,7x0,33 мкм) вирусоподобных частиц (~ 5% от общей площади среза, Рис. 1в); 3) с неровной поверхностью (Рис. 1г), целостность которой разрушена ввиду присутствия многочисленных поверхностных и полупогруженных дрожжевых клеток гриба (часть которых имела в разной степени де-
формированные клеточные стенки), палочковидных бактерий разной протяженности и толщины, часто находящихся в довольно плотном контакте с первыми (Рис. 1д). Также можно было редко наблюдать немногочисленные (от 1 до 3) скопления разрушающихся вирусоподобных частиц. Площадь описанного участка поверхности эпителия пищевода составляла и 10%); 4) с сильно деформированной (с элементами десквамации собственно поверхности эпителия, Рис. 1е) поверхностью слизистого слоя, обширными скоплениями бактерий, умеренным количеством одиночных, иногда почкующихся дрожжевых (Рис. 1ж) клеток гриба (~ 10% от общей площади среза); 5) с полностью разрушенной поверхностью слизистого эпителия пищевода (« 60% от общей площади среза, Рис. 1з,и), остатки которого и более глубоко лежащих тканей его были «перемешаны» со скоплениями бактерий, умеренным количеством одиночных нитей мицелия разной протяженности (без признаков деформации) и редкими одиночными дрожжевыми клетками как интактными (судя по их форме и размерам), так и находящимися на разных стадиях старения (Рис. 1и).
Световая микроскопия биоптата слизистой пищевода. При изучении продольных полутонких эпоксидных срезов биоптата, окрашенных толуи-дининовым синим, выявили участки с отсутствием эпителия и наличие неровного наружного контура. В верхней трети анализируемых срезов были видны темно-синие «прожилки» характерной неправильной формы, представляющие собой скопления большого числа бактерий (Рис. 1л). Сходные, но менее выраженные, скопления бактерий определяли и в более глубоких слоях биоптата. Частота встречаемости и плотность расположения грибных элементов была заметно ниже, чем бактерий. Она была сходной по всей толщине изучаемого фрагмента ткани слизистой оболочки. Округлой (2,5-3,0 мкм) и эллипсоидной формы (1,5-1,7x3,0-3,5 мкм) дрожжевые клетки гриба (Рис. 1л,м), а также гифы мицелия (1,7-2,5 мкм) были легко различимы благодаря наличию практически черной окраски (Рис. 1м).
Культурально-морфологические исследования. При помещении одного из биоптатов в чашку Петри на поверхность агара Сабуро с глюкозой отмечали рост колонии, которая через 7 дней после посева достигала в диаметре 2,7 см. Полученная колония - светло-кремовая, гладкая, блестящая, пастообразная, с четко очерченным периферическим, слегка складчатым ободком, шириной 3 мм и неровным краем (Рис. 1н). При небольшом увеличении сканирующего электронного микроскопа очевидно, что гриб в условиях культуры формирует характерные кратерообразные скопления, или «ласточкины гнезда» — по
Н.П. Блинову (Рис. 2а), а не сплошную пленку, как это представляется при визуальном просмотре и, даже, в световом бинокулярном микроскопе.
m л ия
ющ
Ъ Ш:Ш %т %Б
' jt - • V X-. ter - ** - г
Рис. 2. Сканирующая (а,б), световая (в, г) микроскопия колонии С. albicans и трансмиссионная электронная микроскопия эпителия пищевода ВИЧ-инфицированного пациента (д-у). Стрелкой (Рис. 2з) показана бактерия на начальной стадии фагоцитоза клеткой слизистого эпителия.
Ув.: а - хЮО; б -1400; в - хЮОО; г - х8000; д - х2400; е, т - хЗбОО; ж - 2200; з - х7200; и - х2200; к - х4400; л, м, н - х2900; о - х17000; п - х6200; р, с - х3800; у - xSOOO.
Культура в световом микроскопе, после окрашивания ее 1%-ным раствором метиленового синего (Рис. 26), включает одиночные или в небольших группах (округлые либо эллипсоидной формы), иногда почкующиеся дрожжевые клетки, а также тонкие гифы истинного мицелия или, крайне редко, псевдомицелия (Рис. 2в). Последние в тканях пищевода пациента нам выявить не удалось. На полутонких эпоксидных срезах культуры гриба, окрашенных толуидиновым синим, выявили вертициллы шаровидной формы (тип роста Mycotorula, Рис. 2г); хламидоспоры не были обнаружены. Таким образом, по особенностям морфологии культуры и составляющих ее клеточных элементов выделенный штамм (РКПГУ-1317) можно идентифицировать как Candida albicans.
Просвечивающая электронная микроскопия. Нам удалось выявить в биоптате, зафиксированном для просвечивающей электронной микроскопии, участок с ингакными клетками плоского эпителия (Рис. 2д), непосредственно прилегающий к очагу поражения и соответствующий участку 1 (Рис. 1а), согласно данным сканирующей электронной микроскопии. Клетки эпителия имели расширенную апикальную (Рис. 2д) и суженную базальную части (Рис. 2е). Собственно основание клеток слабо извилистое (Рис. 2е), иногда практически ровное, упиралось в тонкую базальную мембрану умеренной электронной плотности. За последней следовал тонко-фибриллярный базальный слой.
В центре апикальной части клетки наблюдали одно крупное (1,0x0,5 мкм) ядро, локализующееся продольно и занимающее основной ее объем. Нукле-оплазма плотная, с умеренным содержанием конденсированного хроматина, глыбки которого, с одной стороны, были приурочены кядерной оболочке, создавая подобие ободка, а с другой, равномерно распределены по площади среза ядра. Ядрышко одно, довольно крупное (0,4 мкм), эксцентричное, либо локализованное в центре ядра, довольно плотное, с неровным контуром. Митохондрии мелкие (0,2-0,3 мкм), редкие, равномерно распределены по площади среза клетки. Преобладающим компонентом цитоплазмы были скопления цистерн гранулярного и агранулярного эндоплазматического ретикулума, располагающиеся параллельно относительно друг друга и формирующие «обкладку» вокруг ядра. Вакуоли встречали как исключение, одиночные, мелкие, в основном светлые, реже - с темными включениями разной морфологии. Запасные вещества наблюдали крайне редко в виде мелких одиночных липидных капель электронной плотности. Цитозоль плотный, содержал в умеренном числе свободные рибосомы и многочисленные пучки темных микрофибрилл, разной протяженности (0,10-0,30 мкм) и толщины (0,090,35 мкм), равномерно расположенные на площади среза клетки. Клетки слизистого эпителия пищевода имели трехслойную асимметричную плазмалемму, невысокие (0,10-0,15 мкм) тонкие (0,05-0,07 мкм) складки которой в апексе формировали, как видно
в сканирующем электронном микроскопе, характерный рисунок поверхности слизистого слоя, непосредственно обращенного в просвет пищевода. В верхней расширенной 2/3 части клеток была хорошо развита система латеральных межклеточных контактов, четко выявляемая на поперечных срезах анализируемого слоя (Рис. 2ж) и перемежающаяся со складками плазмалеммы. Основание клеток эпителия, упирающееся в базальный слой и базальную мембрану, также иногда формировало складки плазмалеммы, однако более протяженные (0,3-0,5 мкм) и толстые (0,15-0,25 мкм), чем в апексе и латеральных участках клетки. Толщина межклеточного просвета составляла, в среднем, 0,2 мкм. Оно светлое, со скоплениями топко-фибриллярного вещества разнообразной формы и размеров; бактерии, элементы гриба и вирусоподобные частицы в межклеточном пространстве отсутствовали.
Таким образом, судя по ультраструктуре, клетки эпителия, непосредственно прилегающие к пораженному участку пищевода (включая зону межклеточных контактов), имели вид интактных и не проявляли деструктивных признаков ультраструктуры.
По степени сохранности ультраструктуры, вслед за вышеописанным участком, выявляли следующие очаги поражения: 1) участки 2 и 3 (согласно данным сканирующей электронной микроскопии) с довольно хорошо сохранившимися клетками эпителия; 2) участок 4 с умеренно сохранившимися клетками эпителия; 3) участок 5 с сильно деградированными и полностью отмершими клетками эпителия.
Участки 2 и 3. Клетки слизистого эпителия теряли присущую им форму (Рис. 2з,-м), между ними отмечали сильно расширенные, часто лишенные морфологических элементов межклеточные контакты, и заполненные многочисленными бактериями (Рис. 2з,и), либо, напротив, сильно суженные (Рис. 2л) межклетники без каких-либо инфекционных структур. На поверхности апикальной и латеральной частей клеток еще встречали складки плазмалеммы, однако они были редкие, невысокие и часто сильно видоизмененной формы. Базальная мембрана полностью разрушена; вместо базального слоя выявляли небольшие по объему скопления тонко-фибриллярного материала, которые ранее его составляли. Клетки эпителия различались между собой по степени сохранности ядра, цитозоля и органелл. В клетках, лишенных цитозоля, вьмвляли ядра, Тогда как митохондрии обычно отсутствовали, либо, если встречались, то проявляли деструктивные признаки - они были гипертрофированы, лишены матрикса и часто крист.
Только в этом участке биоптата пищевода нам удалось наблюдать последовательные картины фагоцитоза дрожжевых клеток (Рис. 2и-л,о) гриба и контакта клеток истинного мицелия с клетками эпителия. Вблизи таких зон цитоплазма имела густо расположенные скопления микрофибрилл (Рис. 2л), сократительная активность которых, по-видимому, в норме выполняла моторную функцию клеток сли-
зистого эпителия, а в описываемом случае вносила свою роль в «захвате» и последующем более глубоком «погружении» элементов гриба и их фиксации в содержимом клеток эпителия. Также в цитоплазме последних можно было видеть от 1 до 4-5 (Рис. 2з,к,л,м) клеток септированного мицелия диаметром
1,5-2,0 мкм, часто без содержимого, а также с разрушающимся содержимым и скоплениями бактерий. Нередко отмечали картины контакта одной гифы мицелия одновременно с 4-6 клетками эпителия (Рис. 2н). При этом клетки мицелия были окружены плаз-малеммой клетки эпителия (Рис. 2о) и находились с ней в плотном контакте* Реже выявляли картины фагоцитоза одиночных бактерий клетками эпителия (Рис. 2з, бактерия показана стрелкой). Одиночные бактерии всегда присутствовали внутри клеток эпителия и даже в содержащихся в них отмирающих клетках мицелия (Рис. 2з,к), однако массовое их появление было отмечено после разрыва плазмалеммы.
Участок 4. Клетки слизистого эпителия имели неправильную форму, просветы межклетников еще более увеличились (Рис. 2п). Для них было характерно наличие гипертрофированного ядра неправильной формы, без нуклеоплазмы и с хроматином в виде крупных бесформенных скоплений высокой электронной плотности. В цитоплазме клеток цитозоль и оформленные органеллы отсутствовали, отмечали скопления микрофибрилл и тонко-гранулярного материала разного объема и электронной плотности. Также наблюдали фагоцитированные и разрушающиеся дрожжевые клетки гриба и гифы мицелия.
Участок 5. Выявили сильно деформированные фрагменты (еще окруженные отрезком плазмалеммы) клеток эпителия (Рис. 2р,с), между которыми очевидны крупные межклетники, заполненные многочисленными бактериями, дрожжевыми клетками (иногда почкующимися), а также полностью отмершие клетки мицелия, часто содержащие обрывки мембран и скопления фибриллярного материала. В содержимом разрушающихся клеток эпителия встречали многочисленные бактерии, которые завершали деструкцию их содержимого и поглощали продукты распада. Часто бактерии наблюдали в разрушающихся и разрушенных (без содержимого) дрожжевых клетках гриба и гифах мицелия (Рис. 2у), где они интенсивно размножались, практически полностью заполняя просвет некогда живых клеток. Последующие утоныпение и разрыв клеточной стенки приводили к их освобождению. В описанных участках бактерии преобладали, однако число их заметно снижалось (Рис. 2т) в тех зонах, где полностью отсутствовали разрушающиеся клетки эпителия и элементы гриба.
Специально следует остановиться на анализе снимков поверхности, а также тонкого строения клеточных стенок развивающихся дрожжевых клеток гриба и гиф мицелия. Дочерние клетки почкующихся (Рис. 1ж) и растущих (Рис. 1г) дрожжевых клеток гриба in vivo имели гладкую поверхность, тогда как в зре-
лых - грубо-складчато-ячеистую (Рис. 1д,3а) благодаря присутствию внеклеточной слизи. Присутствие последней на поверхности дрожжевых клеток гриба, выращенных in vitro, также очевидно (Рис. 26). Слизь, безусловно, способствует усилению адгезивных свойств дрожжевых грибов в период их контакта с поверхностью клеток эпителия пищевода, а также помогает им формировать в условиях культуры своего рода биопленку, характерную для этого вида морфологии (Рис. 2а). Поверхность гиф мицелия выглядела гладкой, лишь в области расположения септ по всему их периметру можно было наблюдать небольшое углубление (Рис. Зб). Дрожжевые клетки гриба, по сравнению с гифами мицелия, имели более электронноплотные стенки. Строение их было идентичным как в клетках, локализованных внутри эпителиоцитов, так и вне их. Они двухслойные (Рис. Зв), с внутренним (цифра 1, Рис. Зв) более широким слоем (0,22-0,27 мкм), состоящим из плотно расположенных гранул, и наружным более тонким (0,06-0,09 мкм), темным и гомогенным слоем (цифра 2, Рис. Зв). Иногда между клеточной стенкой фагоцитированной или находящейся на разных стадиях этого процесса дрожжевой клеткой гриба и плазмалеммой клетки слизистого эпителия можно было наблюдать светлое аморфное «гало» (Рис. Зг), равномерное по толщине (0,3-0,4 мкм) и повторяющее форму первой. Интегральной частью клеточной стенки дрожжевых клеток С. albicans был так называемый «рубчик» (Рис. Зж) диаметром в 0,8 мкм. Число рубчиков в пересчете на одну клетку варьировало от 1-го до 3-х и соответствовало количеству сформированных дочерних клеток гриба. На продольных ультратонких срезах рубчика видно, что он имел слегка выпуклую форму и представлял собой фрагмент собственно клеточной стенки, окруженный светлым ободком толщиной 0,05 мкм (показан стрелками, Рис. Зж), присутствие которого позволяло ему легко отделяться от клеточной стенки, облегчая рост ростковой трубки. Остается открытым вопрос о таксономическом значении тонкого строения рубчика на уровне рода Candida-, этот вопрос нуждается в дальнейшей разработке.
Рис. 3. Сканирующая (а,6) и трансмиссионная (в-з) электронная микроскопия дрожжевых клеток (а, в, г, ж) и гиф мицелия (6, д, е) С. albicans. Ув.: а,б - х 6000; в, д-з —х 17000; г—xllOOO
Клеточные стенки гиф истинного мицелия, расположенные вне клеток слизистого эпителия, имели двухслойные строение (Рис. Зд): с внутренним более толстым (0,20-0,25 мкм) слоем умеренной электронной плотности, гранулярной структуры (цифра 1, Рис. Зд) и наружным более тонким (0,08-0,12 мкм), темным, рыхло-фибриллярным слоем (цифра 2, Рис. Зд), имеющим вид «бахромы>к Последний слой в составе стенки гиф мицелия, находящихся в контакте с эпителиоцитом, отсутствовал (Рис. Зе). В просвете гиф мицелия выявляли трехслойные (со светлым аморфным внутренним слоем) клиновидные септы (Рис. Зз), толщина которых вблизи латеральных клеточных стенок, в среднем, составляла 0,33 мкм, а вблизи септальной поры, соответственно, 0,16 мкм.
Полученными в настоящей работе данными подтверждены исследования других авторов [2,4 и др.] о том, что основным этиологическим фактором канди-доза при ВИЧ-инфекции и в ее отсутствии [5] является С. albicans. В нашем случае, микогенная инфекция была сопряжена с бактериальной, что также описано для такого рода пациентов [6, 7]. Вирусоподобные частицы мы обнаружили только на поверхности слизистой оболочки пищевода; они не принимали непосредственного участия в развитии инфекционного процесса, как это было показано в других работах, характеризующих ВИЧ-инфицированных пациентов [6, 8 и др.].
Деструктивные изменения клеток слизистого эпителия пищевода у ВИЧ-инфицированного пациента носили тотальный характер, хотя степень и глубина этих изменений в пределах анализируемых биоптатов имела не мозаичный, а последовательный (зональный) характер, что и позволило нам, при совместном использовании современных методов сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии, довольно четко выделить в них соответствующие участки и описать особенности инфекционного процесса, вызванного С. albicans и сопутствующей бактериальной микробиотой.
В изученных фрагментах слизистой оболочки пищевода ВИЧ-инфицированного пациента мы не нашли клеток иммунной системы как в очагах поражения, так и вне их, обычно участвующих в элиминации элементов грибного патогена [9 и др.]. В нашем материале в этот процесс были вовлечены клетки собственно слизистого эпителия. Ранее в экспериментах была показана способность культуры эпидермальных клеток пищевода фагоцитировать клетки С. albicans [10]. Отметим, что с помощью сканирующей электронной микроскопии поверхности слизистой оболочки пищевода при кандидозе у пациентов без ВИЧ-инфекции удалось выявить не только микроорганизмы, но и лейкоциы, мигрирующие через межклеточные контакты [11]. Общеизвестно, что при ВИЧ-инфекции возникает вторичная иммунная недостаточность, выражающаяся в нарушении функции фагоцитов и возможном развитии кандидоза пищевода, что для таких пациен-
тов является маркером перехода болезни в стадию синдрома приобретенного иммунодефицита [2]. Нам не удалось наблюдать картин колонизации в системе «гриб—>11оверхпость клеток эпителия». Однако нельзя исключать того факта, что при полном отсутствии или подавленной функции клеток иммунной системы у ВИЧ-инфицированного пациента возможна инициация инфекционного процесса с участием только одиночных прорастающих клеток С. albicans, что мы и наблюдали.
При анализе серийных ультратонких срезов био-птата показано, что гифы мицелия, вплоть до полного отмирания клеток слизистой оболочки пищевода, были «обернуты» плазмалеммой клетки эпителия (часто нескольких) и располагались в глубине клетки, а не продырявливали ее плазмалемму. Иными словами, взаимоотношения клеток эпителия с гифами истинного мицелия происходили по типу «частичного» фагоцитоза, обусловленного значительной протяженностью гиф мицелия и невозможностью поглотить их полностью намного более мелкими клетками первого. Очевидно, что в исследуемом материале деструктивные изменения содержимого клеток слизистой оболочки пищевода происходили под влиянием токсинов гриба, способных проникать в цитоплазму первых через плазмалемму в зоне их плотного контакта. Первыми из компонентов клеток слизистой оболочки пищевода деструктивным изменениям подвергались митохондрии, затем полностью исчезал цитозоль, нуклеоплазма, хроматин ядер собирался в бесформенные сгустки высокой электронной плотности. Последующий разрыв ядерной оболочки приводил к нарушению морфологической целостности ядра и освобождению его содержимого внутрь клетки. В разрушающихся клетках эпителия наиболее долго можно было наблюдать сильно деформированные и лишенные нуклеоплазмы ядра, а также массивные скопления нитей микрофибрилл, в основном, расположенные вблизи элементов гриба.
Наши данные не совпадают с мнением других авторов [12 и др.], согласно которому именно факт проникновения гиф мицелия в цитоплазму клеток слизистой оболочки (влагалище мышей, экспериментальный кандидоз) приводит к гибели последних.
В исследованных биоптатах представители бак-териобиоты доминировали над элементами гриба, которые, в основном, были представлены гифами мицелия. На начальных и более поздних стадиях инвазии гриба бактерии в большом числе выявляли как на поверхности пищевода, так и в его толще; они полностью утилизировали продукты распада не только клеток собственно эпителия, но и мицелия гриба. Очевидно, что начальные стадии развития смешанной инфекции проходили с участием ростковых трубок дрожжевых клеток гриба, тогда как тотальное разрушение содержимого клеток плоского эпителия пищевода и подлежащих участков проходило с помощью гиф мицелия. Представители бактериальной микробиоты проникали внутрь тканей
пищевода по системе межклетников, с ослабевающей или в разной степени разрушенной системой латеральных межклеточных контактов (Рис. 2з, и). Бактерии доводили «до конца» начатые элементами гриба деструктивные процессы в клетках слизистого эпителия, с одной стороны, а также в содержимом разрушающихся клеток С. albicans, с другой.
Таким образом, проведенными исследованиями показано, что в слизистой оболочке пищевода ВИЧ-инфицированного пациента кандидоз носил характер не моноинфекции, а микст-инфекции с участием бактериобиоты. Ранее в ряде работ также было продемонстрировано участие бактерий в развитии кан-дидозного поражения слизистой оболочки пищевода как у обычных [13], так и у ВИЧ-инфицированных пациентов [14,15]. Очевидна целесообразность дальнейших микробиологических исследований, уточняющих видовую принадлежность бактериобиоты и ее патогенетическую значимость при кандидозе пищевода.
Мы считаем актуальным продолжить начатые ис-
следования в сравнительном аспекте и, по возможности, выявить характерные черты течения инфекционного процесса (включая его мониторинг в ходе лечения пациента) у лиц с другими видами патологий и без нее, особенно, в тех случаях, когда видовой состав микробиоты более разнообразен и сопряжен с участием других видов рода Candida [16] и/или других родов, в том числе мицелиальных грибов [17].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Электронную микроскопию можно рассматривать в качестве дополнительного экспресс-метода диагностики кандидоза пищевода, в случаях, требующих уточнения особенностей патогенеза, в том числе определения сопутствующей бактериальной и/или вирусной инфекции, а также выяснения общей картины взаимоотношений компонентов смешанной микробиоты на разных стадиях инфекционного процесса и доли участия каждого из них в микст-инфекциях подобного рода.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ганковская О.А., Блинкова А.П., Лавров В.Ф. Изучение in vitro факторов врожденного иммунитета в защите от инфекции, вызванной Candida albicans // Тез. докл. второго Всерос, съезд микологов России «Современная микология в России». - М., 2008. - С. 485-486.
2. Караев З.О., Лебедева Т.Н. Патогенез кандидоза и аллергии к грибам рода Candida. - Баку: Тэбиб. - 2007. - 215 с.
3. Степанова А. А., Синицкая И. А. Ультраструктура клеток Aspergillus niger. Вегетативный мицелий// Проблемы мед. микологии. - 2003. - Т. 5, №4. - С. 32-39.
4. Мозжерова М. А., Колу паев BE., Локшина Р. И. Определение видового спектра Candida spp. - возбудителей орофарингеального кандидоза у ВИЧ-инфицированных пациентов // Проблемы мед. микологии. - 2010. - Т.12, №2. - С. 113-114.
5. Мелехина Ю.И., Фролова Е.В., Учеъаткина А.Е. и др. Иммунологические и иммуно-гистологические особенности рецидивирующего кандидоза пищевода у больных без ВИЧ-инфекции пациентов // Проблемы мед. микологии. -
2010. - Т.12, №2, - С-111-112.
6. Wilcox С.М., SchwartzD. A. Endoscopic-pathologic correlates of Candida esophagitis in acquired immunodeficiency syndrome ft Dig. Dis. Si i. - 1996. - Vol. 41, №7. - P. 1337-1345.
7. Rossit A.R., de Almeida M.T., Nogueira C.A., et al. Bacterial, yeast, parasitic and viral enteropathogens in HIV-infected children fromSao Paulo State, Southeastern Brazil f] Diagn. Microbiol. Infect. Dis. - 2007. - Vol. 57, №1. - P. 59-66.
8. Vidal A.P., Pannain V.L., Bottino A.M. Esophagitis in patients with acquired human immunodeficiency syndrome: an histological and immunohistochemistry study 11 Arq. Gastroenterol. - 2007. - Vol. 44, №4. - P. 309-314.
9. d Ostiani C.F., Del Sero G., Bacci A., et al. Dendritic cells discriminate between yeasts and hyphae of the fungus Candida albicans. Implications for initiation of T helper cell immunity in vitro and in vivo // J. Exp. Med. - 2000. - Vol. 191, №10.
- P. 1161-1674.
10. Csato М., Bozoky B., Hunyadi /., Dobozy A. Candida albicans phagocytosis by separated human epidermal cells // Arch. Dermatol. Res. - 1986. - Vol. 279, №2. - P. 136-139.
11. Zhavoronkov A.A., Rostovshchikov A.S., Sakhirov N. Ultrastructure of the surface of the epithelial layer in esophagitis // Arkh. Patol. - 1986. - Vol. 48, №12. - C, 29-35.
12. Быков В.Л., Хохлов С. Г.. Патогенез кандидоза слизистых оболочек (ультраструктурный анализ) II Вест. Дермат. и венер. - 1986. - Vol. 12. - Р. 9-14.
13. Wilox С.М., Schwartz D.A. Endoscopic-pathologic correlates of Candida esophagitis in acquired immunodeficiency syndrome It Dig. Dis. Si i. - 1996. - Vol. 41, №7. - P. 1337-1345,
14. Rossit A.R., de Almeida M.T., Nogueira C.A., et al. Bacterial, yeasts, parasitic, and viral ebteropathogens in HIV-infected children fromSao Paulo State, Southeastern Brazil f] Diagn. Microbiol. Infect. Dis. - 2007. - Vol. 57, №1. - P. 59-66.
15. Marrie T.J., Costerton J.W. The ultrastructure of Candida albicans infections // Can. J. Mocrobiol. - 1981. - Vol. 27, №11.
- P. 1156-1164.
16. Cartledje JD.,MidgleyJ, GazzardB.G. Non-albicans oral candidosis in HIV-positive patients // J. Antimicrob. Chgemother.
- 1999. - Vol. 43, №3 - P. 419-422.
17. Мозжерова M.A., Колупаев B.E., Локишина Р.И. Определение видового спектра Can-dida spp. - возбудителей орофарингеального кандидоза у ВИЧ-инфицированных пациентов // Проблемы мед. микологии. - 2010. - Т.12, №2.
- С. 113-114.
Поступила в редакцию журнала 21.02.2011 Рецензент: Митрофанов В. С.
