CC BY
15
)1[игиена и санитария 3/2008
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2008 УДК 613.287:547.9171*074
В. А. Храмов, А. С. Коломейцева, Н. В. Папичев
МИКРОМЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛАКТОЗЫ В МОЛОКЕ НА ОСНОВЕ ЦВЕТНОЙ РЕАКЦИИ ЯФФЕ
ВНИТИ ММС и ППЖ, Волгоградская сельскохозяйственная академия
Описанная еще в 1886 г. цветная реакция с пикриновой кислотой лежит в основе наиболее распространенного метода определения креатина в биологических жидкостях [1,6]. В фундаментальном каталоге Sigma-Aldrich сот "Реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук за 2002—2003 гг." раствор пикриновой кислоты заявляется как "реагент для колориметрии креа-тинина" (стр. 1649). Многие авторы обращают внимание на существенную неспецифичность данной цветной реакции: кроме креатина и креатинина, с пикриновой кислотой реагируют, например, аскорбиновая и пировино-градная кислоты, ацетон [2, 4]. И. М. Коренман [3] указывает, что цветная реакция с пикриновой кислотой неспецифична, поскольку обусловлена восстанавливающими свойствами любого анализируемого вещества.
Анализируя мясные изделия на содержание в них креатина с помощью реакции Яффе, мы обратили внимание на то, что заметно завышенные результаты получаются в тех случаях, когда в состав мясного фарша добавляют молочные продукты.
Проведя реакцию Яффе с образцами цельного молока и молочными продуктами, мы удостоверились в том, что последние дают резко положительную реакцию со щелочными растворами пикриновой кислоты, хотя практически не содержат креатина. В дальнейшем выяснилось, что цветная реакция Яффе с молочными изделиями определяется присутствием в них восстанавливающего ди-сахарида лактозы. Настоящая работа посвящена разработке микрометода определения лактозы в образцах молока на основе цветной реакции Яффе.
Материалы и методы
Материалом для исследования служили образцы молока, закупленные в магазинах Волгограда (табл. 1). Опыты проводили с использованием 1 % водного раствора пикриновой кислоты, 10% водного раствора гидро-ксида натрия, 0,001 М растворов лактозы и глюкозы, 0,1—1% растворов аналитов, указанных в табл. 2.
Применяли следующую технику анализа. Молоко разводили в мерной колбе в 250 раз. Затем забирали 2 мл разбавленного молока и к пробе последовательно прибавляли 0,1 мл 1% раствора пикриновой кислоты и
Таблица I Содержание углеводов в образцах молока, ммоль/л
Анализируемый образец
Результаты опытов
Указано на упаковке
№ I "Веселый молочник", 3,2% № 2 "Беляночка", 2,5% № 3 "Кубанская буренка", 6% № 4 "Кубанская буренка", 3,5% № 5 "Топленое молоко" № 6 "Волжская буренка", 3,5% № 7 "Тема"
№ 8 "Краснодонское", 3,2% № 9 "Заповедный уголок", 3,2% № 10 "Заповедный уголок", 2,5% № 11 "Домик в деревне", 6% № 12 Сливки "Кубанская буренка" № 13 "Простоквашино" № 14 "Вкуснотеево"
10%
0,134 0,135 0,128 0,120 0,148 0,134 0,131 0,135 0,135 0,131 0,129 0,130 0,133 0,134
0,137 0,137 0,137 0,137 0,140 0,137 0,140 0,140 0,137 0,137 0,137 0,128 0,140 0,140
0,2 мл 10% раствора гидроксида натрия. Пробу перемешивали и колориметрировали при длине волны 500 нм. Полученную величину оптической плотности учитывали для компенсации мутности пробы и собственно цвета пикриновой кислоты. Затем пробу сливали обратно в пробирку и кипятили в водяной бане не менее 10 мин. (За это время развивается заметное оранжевое окрашивание, что объясняется восстановлением пикриновой кислоты до пикраминовой.) Пробу охлаждали и повторно колориметрировали при тех же условиях. Из полученной оптической плотности вычитали первоначальный результат и по разности оптической плотности, пользуясь калибровочным графиком с 0,001 М раствором лактозы, находили концентрацию данного дисахарида в образце разбавленного молока. Результат для исходного молока получали умножением найденной величины на 250 и выражали в молях лактозы на 1 л молока. Для перевода молярной концентрации в традиционную форму (г на 100 г молока) полученную величину необходимо умножить на 34,2.
Результаты и обсуждение
Поскольку в литературе есть данные о невысокой специфичности реакции Яффе и даже существует термин "псевдокреатиновые хромогены" (другие вещества, дающие реакцию с пикриновой кислотой), мы провели серию опытов с рядом биохимических субстратов, присутствующих в молоке. Результаты, доказывающие, что пикриновая кислота восстанавливается (образует окрашенную пикраминовую кислоту) целым рядом соединений, приведены в табл. 2. Положительная реакция с
Таблица 2
Специфичность цветной реакции Яффе при 0,1—1% концентрации анализируемых веществ
Анализируемое вещество
Результат реакции
Аскорбиновая кислота
Ацетон
Аргинин
Альбумин сыворотки (раствор с
концентрацией > 0,3%) Глицерин Глюкоза Лакгоза Сахароза Крахмал
Глюкозо-6-фосфат
Креатин
Креатинин
Мочевая кислота
Мочевина
Гистидин
Метионин
Цистеин
Изопропиловый спирт Формиат натрия 2-Глицерофосфат Пируват натрия
Примечание. "+" —обнаружена, "-+" — двоякий результат.
+ +
-+ + + + -+ + + +
— не обнаружена,
Влияние содержания пикриновой кислоты на развитие цветной реакции с лактозой.
По оси абсцисс — содержание пикриновой кислоты в пробе (в мг); по оси ординат — оптическая плотность пробы при длине волны 500 нм.
крахмалом была сомнительной, но заметно усиливалась после частичного гидролиза последнего.
Способность восстанавливать пикриновую кислоту белками (альбумин сыворотки) наблюдалась только при высоких концентрациях (1% раствор альбумина). Следует заметить, что в исследуемых нами пробах уровень молочных белков был на 1—2 порядка ниже. Аминокислоты вообще не давали эту реакцию.
В рамках изучения особенностей реакции углеводов с пикриновой кислотой исследовали зависимость интенсивности цветной реакции от концентрации пикриновой кислоты (см. рисунок). На основании этих опытов следует считать оптимальным внесение в пробы 0,05—0,1 мл 1% раствора пикриновой кислоты.
Разработанную процедуру использовали для анализа 14 образцов молока. Результаты этой серии опытов представлены в табл. 1, в которой параллельно даны также концентрации углеводов, заявленные производителем на упаковке (концентрация углеводов на 100 г молока переведена нами в молярную концентрацию). Как видно из табл. 1, экспериментально полученные нами величины отличаются вариабельностью и в целом чуть ниже указанных производителем (в среднем на 5—6%). Исключение составляет образец молока № 5, где полученный нами результат был выше заявленного более чем на 12%.
Представленный фотометрический микрометод определения лактозы в молоке отличается достаточной простотой и высокой чувствительностью (для одного анализа требуется не более 4—5 мкл исходного молока). Метод хорошо воспроизводим: коэффициент вариации составил не более 2,27% при п = 6, что весьма неплохо для микрометода.
На наш взгляд, описанный метод можно рассматривать как альтернативу общепринятым методам определения лактозы в молочных продуктах [5]. То, что реакцию с пикриновой кислотой дает также глюкоза, расширяет сферу применения данной цветной реакции. Очевидно, что ее можно использовать для определения глюкозы (и других восстанавливающих углеводов) в биологических объектах.
Перспективно использование данного метода в практике клинической биохимической лаборатории для определения, например, содержания углеводов в молоке родильниц с эндокринной патологией (сахарный диабет).
J1 итература
1. Асатиани В. С. Новые методы биохимической фотометрии. — М., 1965.
2. Камышников В. С. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика. — Минск, 2003. — Т. 1.
3. Коренман И. М. Фотометрический анализ, методы определения органических соединений. — М., 1970.
4. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. В. В. Меньшикова.
5. Методы анализа пищевых с/х продуктов и медицинских препаратов. — М., 1974.
6. Справочник по лабораторным методам исследования / Под ред. Л. А. Даниловой. — СПб., 2003.
Поступила 14.03.07
Summary. The picric acid reaction (Jaffe test) that is widely used in clinical biochemical practice to determine creatinine has proven to be suitable for the assay of lactose in milk samples. The reaction conditions (picric acid concentration, sample heating time, etc.) were examined to optimize this method. The specificity of this color test was also studied. Other reducing sugars, as well as glucose-6-phosphate and glycerol yielded a picric acid reaction. The level of lactose in the test milk samples (n = 14) ranged from 0.120 to 0.148 mmol/l.
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2008 УДК 613.281-07:546.15]<07Э. 175
В. И. Баранов, Н. А. Солдатенкова, Е. Г. Кекина
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЙОДА В МОРЕПРОДУКТАХ МЕТОДОМ ИНВЕРСИОННОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ
Российская медицинская академия последипломного образования, Москва
Йод является элементом, имеющим высокую биологическую активность. Его соединения играют важную роль в процессах обмена веществ в организме человека. В этой своей функции йод не может быть заменен никаким другим химическим элементом.
Большое значение имеет дефицит йода, который вызывает многочисленные тяжелые заболевания. Дефицитным считается поступление йода в организм человека менее 100 мкг/сут. При этом возможно возникновение и развитие таких болезней, как гипоидоз — увеличение щитовидной железы, кретинизм и недоразвитие скелета у детей, гипотиреоз — микседема, различные генетические дефекты, болезнь Хошимото [1—3].
По различным литературным источникам, 70—80% йода в организм человека поступает с пищей в виде не-
органических соединений — йодидов и йодатов, а также йодированных аминокислот.
Наиболее высокая концентрация йода присутствует в морской рыбе и морепродуктах. При этом уровень содержания данного элемента в обитателях моря зависит от степени удаления от берега моря и от глубины места обитания: чем глубже обитают рыбы, тем больше йода они накапливают. Наблюдаются сезонные колебания концентрации йода у морских обитателей: максимум приходится на осенне-летний период, минимум — на зиму (4].
Основная часть пищевой рыбной продукции должна поступать в торговую сеть в виде живой, охлажденной и мороженой рыбы. Соленая, копченая и консервированная в герметической таре рыба должна составлять примерно равные части остального количества производи-
