CC BY
24
Исследовательские работы школьников
Микроклональное размножение растений рода Колокольчик
Micropropagation of Plants of the Genus Campanula (Bellflower)
Аннотация. Сохранение редких видов растений — это часть общей проблемы восстановления и рационального использования природных растительных ресурсов. Для поддержания биоразнообразия в настоящее время наряду с традиционными методами используется способ сохранения исчезающих видов растений в виде растущих коллекций в условиях in vitro. В работе представлены результаты исследований по оптимизации условий стерилизации семян растений рода Campanula L., а также по оптимизации состава питательной среды для наиболее эффективного образования побегов и корней из микрочеренков при микрокло-нальном размножении in vitro.
Ключевые слова: микроклональное размножение, колокольчик, редкие виды растений, in vitro, микрочеренкование
Abstract. Preservation of rare plant species is a part of the overall problem of restoration and rational use of natural plant resources. To maintain biodiversity, along with traditional methods, a method of preserving rare plant species in the form of growing collections in vitro is currently being used. The paper presents the results of researches on optimizing conditions for seed sterilization of plants of the genus Campanula L., as well as on optimizing nutrient condition for the most effective shooting and rooting during micropropagation in vitro. Keywords: micropropagation, bellflower, rare plant species, in vitro, microcutting
Введение
Род Campanula L., семейство Campanulaceae Juss., включает исключительно травянистые растения и объединяет около 400 видов [Османова, Лаврик, 2012]. На территории РФ и сопредельных стран насчитывается около 150 видов колокольчиков, из них 13 видов произрастают в средней полосе России. В основном все они относятся к редким, находящимся под
Авторы:
Куприянова Дарья Михайловна,
Савлуковская Софья Владимировна,
Репина
Анастасия Сергеевна,
ученицы 11-го класса Университетской гимназии Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова, г. Москва
E-mail: dahkup@gmail.com
Научные руководители:
Галахова
Оксана Борисовна,
наставник проектного офиса Университетской гимназии Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова, г. Москва
Соловьев
Александр
Александрович,
доктор биологических наук, профессор кафедры генетики биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова, заведующий лабораторией маркерной и геномной селекции растений ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии, г. Москва
Константинов Захар Сергеевич,
Университет «Сириус», г. Сочи, Краснодарский край
Гарибян
Цовинар Саркисовна,
кандидат технических наук, старший научный сотрудник лаборатории маркерной и геномной селекции растений ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии, наставник проектного офиса Университетской гимназии МГУ имени М. В. Ломоносова, г. Москва
угрозой вымирания видам [Землянухина и др., 2016]. В Красную книгу Москвы и Московской области внесены три вида Колокольчика: Бубенчик лилиелистный (Adenophora liliifolia), Колокольчик алтайский (Campanula altaica) и Колокольчик сибирский (Campanula sibirica) [Варлыгина и др., 2018].
Колокольчики очень распространены в медицине и в садоводстве. Многие виды даже без селекционных преобразований обладают высокими декоративными качествами [Балобанова, Викторов, 2017]. Колокольчик сибирский синтезирует много вторичных метаболитов, важных для фармацевтики, таких как алкалоиды, флавоноиды и другие.
В эпоху научно-технического прогресса особенно острыми становятся проблемы охраны флоры и фауны. Исчезают места обитания многих дикорастущих растений.
Сохранение редких видов растений — это часть общей проблемы восстановления и рационального использования природных растительных ресурсов, в том числе колокольчика. Для поддержания биоразнообразия в настоящее время наряду с традиционными методами используется способ сохранения редких и исчезающих видов растений в виде растущих коллекций в условиях in vitro [Чернышенко, Загреева, 2012].
Для этого используется биотехнологический метод ми-кроклонального размножения. Микроклональное размножение — это способ вегетативного размножения, позволяющий с помощью культуры тканей in vitro получить растения, генетически идентичные исходному экземпляру. Соматические клетки растений способны полностью реализовывать свой потенциал развития in vitro и давать начало зрелому растительному организму, что называется тотипотентностью. Для сохранения редких и исчезающих видов, в том числе занесенных в Красную книгу, микроклональное размножение in vitro позволит сохранять генотипы таких растений, размножать их и возвращать в природную популяцию [Чернышенко, Загреева, 2012].
В процессе микроклонального размножения можно выделить следующие основные этапы: введение в культуру in vitro, собственно микроразмножение, укоренение и адаптация ex vitro.
Этот метод позволяет проводить работы в лабораторных условиях круглогодично, независимо от сезона, используя при этом малые производственные площади. Растения размножаются достаточно быстро, даже если они представлены минимальным количеством исходного материала, и это особенно важно для растений, имеющих длительный период развития.
Данный метод использовали для размножения колокольчика неоднократно во множестве работ. Например, при подборе питательных сред для укоренения микрочеренков было определено, что применение питательных сред без добавления фитогормонов группы ауксинов увеличивало срок укоренения до месяца, в то время как на питательной среде % Мурасиге
Микроклональное размножение растений рода Колокольчик
Куприянова Дарья, Савлуковская Софья, Репина Анастасия
и Скуга с 1 мг/л индолил-3-масляной кислоты (ИМК) укоренение занимало неделю [Чернышенко, Загреева, 2012]. В других работах применялись и другие фитогормоны: 0,5 мг/л индоли-луксусной кислоты (ИУК) [Соколов и др., 2013].
Не всегда удается найти публикации работ по конкретным видам рода Колокольчик. Даже по идентичному виду результаты и методы работы с ним в разных источниках разнятся. Исходя из этого, возникает необходимость проведения оптимизации процесса микроклонального размножения.
Исходя из вышеописанной проблемы была поставлена следующая цель: оптимизировать условия микроклонального размножения растений рода Колокольчик.
Для достижения результатов были поставлены следующие задачи:
ознакомление с тематической литературой; изучение и освоение методов приготовления маточных растворов и питательных сред различного состава; изучение и освоение методов стерилизации инструментов, лабораторной посуды и питательных сред; изучение и освоение метода введения семян в культуру in vitro в асептических условиях;
определение оптимального режима стерилизации посевного материала;
изучение и освоение метода микроклонального размножения растений в условиях in vitro;
оптимизация состава питательной среды для укоренения побегов;
адаптация полученных клонов растений к условиям ex vitro; анализ полученных экспериментальных данных.
Материалы и методы исследований
Объектом исследований являлись растения Колокольчика сибирского.
После изучения литературных источников по микрокло-нальному размножению Колокольчика были приготовлены следующие варианты питательных сред:
• питательная среда Мурасиге и Скуга (MS);
• питательная среда Мурасиге и Скуга половинчатого состава макросолей (/ MS).
В работе использовались стандартные методы культуры органов и тканей растений [Болвелл и др., 1989; Калинин и др., 1992; Бутенко, 1999; Калашникова и др., 2006].
В ходе подготовки к микроразмножению были приготовлены маточные (концентрированные) растворы макросолей, микросолей, витаминов, хелата железа, CaCl2*2H2O, фитогормонов.
Аuthors:
Daria Kuprianova,
Sofia Savlukovskaya,
Anastasia Repina,
Students of the 11th grade, Lomonosov Moscow State University Gymnasium, Moscow
Research advisors:
Oksana Galakhova,
Mentor of the Project Office, Lomonosov Moscow State University Gymnasium, Moscow
Alexander Solovyov,
Doctor of Biology, Professor of the Department of Genetics, Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, Head of the Laboratory of Marker-Assisted and Genomic Plant Selection, All-Russia Research Institute of Agricultural Biotechnology, Moscow
Zakhar Konstantinov,
Sirius University, Sochi, Krasnodar krai (territory)
Tsovinar Garibyan,
Ph. D. in Technical Sciences, Senior Researcher at the Laboratory of Marker-Assisted and Genomic Plant Selection, All-Russia Research Institute of Agricultural Biotechnology, Mentor of the Project Office, Lomonosov Moscow State University Gymnasium, Moscow
Рисунок 1. Микрочеренки на питательной среде сразу после посадки
Рисунок 2. Образовавшиеся из микрочеренков побеги на 3-ю неделю
Все питательные среды содержали 20 г/л сахарозы в качестве источника углерода и 6 г/л агар-агара в качестве структурообразующего компонента сред. рН сред доводили до значений 5,6-5,8 раствором щелочи 1М KOH.
Стерилизацию питательных сред, дистиллированной воды, пробирок с ватно-марлевыми тампонами, бумажных матрасиков, пробирок типа эппендорф и пластиковых контейнеров проводили в автоклаве при 120 °C, 1,2 атм. в течение 20 минут.
Скальпели, пинцеты, баночки и стаканчики стерилизовали в сухожаровом шкафу при температуре 170 °C течение 3 часов. Растворы фитогормонов (индолил-3-масляная кислота, ин-долилуксусная кислота) стерилизовали с помощью мембранных фильтров с размером пор 0,22 мкм (холодная стерилизация).
Семена колокольчика стерилизовали в условиях лами-нар-бокса. Так как семена некрупные, они помещались в эппендорф объемом 1,5 мл, и непосредственно к ним добавлялись растворы для проведения стерилизации. Сначала к семенам добавляли 70 % раствор этилового спирта и эппендорф переворачивали в течение 1 мин. Далее спирт удалялся при помощи автоматической пипетки, и к семенам добавляли раствор NaOCl («Белизна») разной концентрации и выдерживали в нем в течение различного времени. Затем семена трехкратно промывали стерильной дистиллированной водой.
Статистическую обработку данных проводили согласно стандартным методам [Лакин, 1990] с использованием пакета программ Microsoft Office (Excel 2010).
Повторность каждого варианта опыта — трехкратная.
Результаты исследования
Для получения асептических растений необходимо освободить вводимые в культуру in vitro экспланты от патогенов. Часто патогены находятся на поверхности эксплантов, поэтому необходимо проводить поверхностную стерилизацию. В работе мы использовали семена в качестве материала для получения растений колокольчика in vitro. Изучая литературу, мы остановились на стерилизующем агенте NaOCl. Так как в разных источниках описаны отличающиеся друг от друга концентрации NaOCl и различное время действия агента, то возникла необходимость подобрать оптимальную концентрацию и экспозицию с тем условием, чтобы процент заростов (разрастания бактериологических колоний или плесневых грибов) был минимален. Нужно заметить, что угнетающее действие стерилизующего агента распространяется не только на патогены, но и на сами экспланты, поэтому нужно учитывать и жизнеспособность проросших семян. Для каждого варианта было взято по 7 семян колокольчика в трех повторностях.
Микроклональное размножение растений рода Колокольчик_
Куприянова Дарья, Савлуковская Софья, Репина Анастасия
Таблица 1. Влияние вариантов стерилизации на стерильность и жизнеспособность семян Колокольчика при введении в культуру in vitro
Стерилизующий агент Вариант Концентрация, % Экспозиция, мин Количество заросших семян, % Всхожесть семян, %
1 5 5 33,3±4,8 81,0±9,5
2 10 5 23,8±4,8 81,0±4,8
3 15 5 4,8±4,8 71,4±8,2
4 5 10 4,8±4,8 71,4±8,2
NaOCl 5 10 10 0 71,4±8,2
6 15 10 0 61,9±9,5
7 5 15 4,8±4,8 52,4±4,8
8 10 15 0 33,3±4,8
9 15 15 0 28,6±8,2
На основе анализа полученных экспериментальных данных можно сделать вывод о том, что наиболее оптимальным является вариант 5 с использованием концентрации NaOCl 10 % и экспозиции 10 мин. В этом случае доля заросших семян равнялась 0 % при всхожести растений равной 71,4±8,2 %.
Отметим следующую тенденцию: с ростом концентрации или времени выдерживания семян в стерилизующем агенте снижается всхожесть семян из-за угнетающего воздействия
Полученные проростки пересадили из чашек Петри в пластиковые контейнеры для дальнейшего роста растений и поместили в световую комнату при температуре 22±2 °С с фотопериодом 16/8 часов.
Для непосредственно микроклонального размножения взрослые асептические растения колокольчика в ламинар-бок-се были разделены на одноузловые сегменты стебля (микрочеренки), которые помещали нижним концом черенка в пробирки с питательной средой / MS так, чтобы пазушная меристема не была погружена в среду (Рисунок 1). Дальнейшее культивирование проводили в световой комнате при температуре 22±2 °С с фотопериодом 16/8 часа.
Далее черенки с образовавшимися побегами (3 недели) (Рисунок 2) пересаживали на среду для укоренения.
Для каждого варианта было посажено по 10 микропобегов в трехкратной повторности. Оценку ризогенеза проводили на 3-ю неделю после пересадки побегов на среду для укоренения (Рисунок 3).
Нами было изучено влияние различных вариантов сред на частоту ризогенеза микропобегов (Рисунок 4).
Рисунок 3. Побеги на начальных стадиях ризогенеза, 6 недель
Рисунок 4. Влияние состава питательной среды и концентрации различных ауксинов на укоренение микропобегов
Анализ полученных экспериментальных данных показал, что выбор питательной среды (MS или У MS) достоверно не оказывает влияния на укоренение, кроме использования концентраций ИМК 0,5 и 1 мг/л, где различия по этим концентрациям между MS и У MS существенны.
Отмечены различия между применением различных ауксинов по укоренению черенков. При использовании питательной среды У MS различия между применением ИМК и ИУК достоверны — ИМК действует эффективнее. При использовании среды MS — различий нет.
Для проверки жизнеспособности полученные растения были извлечены из стерильных условий, посажены в подготовленную в пластиковой посуде почву с покрытием (Рисунок 5). Покрытие открывали на 5 минут по несколько раз в день, с каждым днем увеличивая время. Через неделю покрытие убирали на весь день, закрывая только на ночь. Через 2,5 недели растение полностью адаптируется к условиям ех уйто, и покрытие удаляется за ненадобностью.
Адаптированные растения были переданы в Ботанический сад им. С. И. Ростовцева, а также были высажены в поселке Снегири (городской округ Истра, Московская область, северо-запад). Растения успешно адаптировались (Рисунок 6).
Рисунок 5. Клоны Колокольчика сибирского на адаптации, 1-й день
Микроклональное размножение растений рода Колокольчик
Куприянова Дарья, Савлуковская Софья, Репина Анастасия
Выводы
В результате проведенных исследований показано, что для стерилизации семян Колокольчика сибирского оптимальным режимом является следующий: 1 мин в 70 % растворе этанола, 10 мин в 10 % растворе NaOCl, трехкратная промывка в стерильной дистиллированной воде.
Установлено, что наиболее эффективной средой для укоренения является 1А MS (Мурасиге и Скуга) с добавлением 1 или 2 мг/л ИМК (индолил-3-масляная кислота). Растения успешно адаптированы к условиям ex vitro и пересажены в открытый грунт: в ботанические и в естественные условия. В дальнейшем планируется работа по выделению и изучению ДНК полученных клонов растений, а также исследование влияния микро-клонального размножения на количество выделяемых растением метаболитов. И/"
Литература:
Балобанова, Викторов, 2017 — Балобанова Н. П., Викторов В. П. Практическое значение видов рода Campanula L // Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине, 2017. С. 24-27.
Болвелл и др., 1989 — Болвелл Г. П., Вуд К. Р., Гонзалес Р. А. Биотехнология растений: культура клеток. — М.: Агропромиздат, 1989.
Бутенко, 1999 — Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: учебное пособие. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. С. 160.
Варлыгина и др., 2018 — Варлыгина Т. И., Зубакин В. А., Соболев Н. А. Красная книга Московской области. — М.: КМК, 2008.
Землянухина и др., 2016 — Землянухина О.А., Калаев В. Н, Воронина В. С., Корнеева О. С. Микроклональное размножение пяти видов колокольчиков, произрастающих на территории ботанического сада им. проф. Б. М. Козо-Полянского Воронежского госуниверситета // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий, 2016. № 1. C. 198-202.
Калинин и др., 1992 — Калинин Ф. Л., Кушнир Г. П., Сарнацкая В. В. Технология микроклонального размножения растений. — К.: Наукова думка, 1992. С. 232.
Калашникова и др., 2006 — Калашникова Е. А., Кочиева Е. З, Миронова О. Ю. Практикум по сельскохозяйственной биотехнологии. — М.: Колос, 2006. С. 144.
Лакин, 1990 — Лакин Г. Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов. — М.: Высшая школа, 1990. С. 352.
Османова, Лаврик, 2012 — ОсмановаГ. О., ЛаврикМ. В. Экологическая характеристика местообитаний Campanula bononiensis L // Известия Самарского научного центра РАН, 2012. № 1-7.
Соколов и др., 2013 — Соколов Р. Н, Коломиец Т. М, Маляровская В. И. Введение в культуру in vitro некоторых редких и исчезающих видов флоры Западного Кавказа // Научный журнал КубГАУ, 2013. № 94.
Чернышенко, Загреева, 2012 — Чернышенко О. В., Загреева А. Б. Создание природных популяций редких и исчезающих видов с помощью клонального микроразмножения // Вестник МГУЛ — Лесной вестник, 2012. № 7. С. 90.
Рисунок 6. Клоны Колокольчика сибирского в Ботаническом саду им. С. И. Ростовцева
