Микроклональное размножение хризантем Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК: 631. 147

МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ ХРИЗАНТЕМ

ГРАНДА РОБЕРТО (Кафедра с.-х. биотехнологии)

Разработаналабораторнаятехнологияклональногомикроразмноженияхри-зантем российской селекции сиспользованием различных первичных эксплан-тов.МетодомПЦР-анализаустановленоналичиевирусаС^гдоатс^етит Virus B внижнихярусахиегоотсутствиевверхнихярусахпробирочныхрастений.

Ключевые слова: хризантемы, культура ткани, морфогенез, экспланты, питательные среды, каллусогенез, БАП, ИУК, 2,4-Д, ПЦР-анализ, вирус

При выращивании хризантем часто возникают проблемы, связанные с физиологией растений. Например, культивирование растений в условиях ограниченного пространства питания часто приводит к угнетению роста, нарушению образования бутонов и развитию дегенеративных цветков, поражению листьев. Данные физиологические отклонения могут привести к гибели растения [2].

Вегетативное размножение хризантем обусловливает существенное накопление в их искусственных популяциях различных заболеваний. Наибольший урон наносят в этом случае вирусные заболевания, которые не поддаются химическому контролю. Наибольшее распространение в растениях хризантем получил вирус Chrysanthemum Virus B (CVB) (РНК-содержа-щий вирус длиной около 670 н.п.) [7]. Распространение вирусов диктует необходимость постоянно поддерживать высокий уровень агрофона, а также вести активную селекционную работу, позволяющую проводить быструю смену сортов. Частично эта проблема может решаться за счет размножения

безвирусного материала в культуре тканей и клеток растений in vitro методом клонального микроразмножения [6], в основе которого лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипо-тентность. Сортовое многообразие хризантем в значительной степени проявляется на уровне тотипотентности клеток и регенерационном потенциале, что вызывает необходимость дифференцированного подхода к применению и совершенствованию технологий клонального микроразмножения для каждого изучаемого генотипа.

Maтepиaлыимeтoды

Объектом исследования служили сорта хризантем отечественной селекции — Снежка, Камила, Белый Снег, Вдохновение и Октябрь. В качестве первичного экспланта использовали сегменты листовых пластинок, побегов, черешков и лепестков. Экспланты стерилизовали 0,1%-м раствором сулемы с подбором оптимального времени их обеззараживания и многократным промыванием стерильной дистиллированной водой. Оптимальное время

Научный руководитель — д. б. н. Е.А. Калашникова.

стерилизации определяли по жизнеспособности первичных эксплантов и зараженности их фитопатогенами.

В работе придерживались принятых на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева методик приготовления и стерилизации питательных сред, инструментов и оборудования [1].

При культивировании изолированных эксплантов в условиях in vitro использовали минеральную основу питательной среды Мурасига и Скуга (МС) [5], в сочетании с агаром и сахарозой. В качестве регуляторов роста в питательные среды добавляли БАП, ИУК и 2,4-Д в различных концентрациях и комбинациях.

Для проведения ПЦР-анализа использовали праймеры из компании Синтол (CVB-CP1-F, CVB-CP1-R; CVB-CP2-F, CVB-CP2-R) и МГУ (CVB-CP-CM, CVB-CP-CP), которые были выбраны с таким расчетом, чтобы при ПЦР амплифицировалась высококонсервативная последовательность внутри гена капсидного белка (СР). Предполагается, что такая конструкция праймеров должна обеспечить выявление практически любого изолята CVB независимо от его штам-мовой принадлежности.

Результаты и их обсуждение

Исследования показали, что различный гормональный состав питательной среды приводит к изменению морфофизиологических процессов, которые выражаются: 1 — в формировании каллусной ткани из первичного эк-спланта с последующей регенерацией растений; 2 — в регенерации растений непосредственно из клеток первичного экспланта; 3 — в индукции развития существующих в растении меристем.

Экспериментально установлено, что культивирование изолированных листовых пластинок, черешков и сегментов междоузлий на питательной среде, содержащей ИУК в различных концент-

рациях, приводит к образованию плотной каллусной ткани зеленеющей на свету (рис. 1, А). Добавление в питательную среду 2,4-Д стимулировало процесс ризогенеза (рис. 1, Б), а присутствие комплекса гормонов (БАП 1 мг/л и ИУК 1 мг/л) стимулировало прямую регенерацию растений из клеток первичного экспланта (рис. 1, В). Последующее культивирование сформировавшихся микропобегов на питательной среде аналогичного состава приводило к формированию микрорастений (рис. 1, Г), у которых не были отмечены изменения в морфологии листа и стебля. Такие растения легко адаптировались к условиям in vivo. Применение метода индукции образования адвентивных почек непосредственно на первичном экспланте позволяет существенно повысить коэффициент размножения и сохранять генетические особенности растения-донора.

Культивирование лепестков на питательных средах, содержащих различные концентрации БАП и ИУК, приводило к образованию рыхлой каллусной ткани, реже плотной, в которой не происходила деффиренциация меристематических очагов, дающих начало развитию побегов. Однако в вариантах, где ИУК присутствовала без сочетания с БАП, наблюдали процесс ризогенеза.

Проведенные исследования по тестированию пробирочных растений хризантем на наличие вируса Chrysanthemum Virus B с применением ПЦР-ана-лиза показали его присутствие в трех исследуемых сортах. Причем экспериментально установлено, что наличие вируса отмечено лишь в эксплантах, изолированных с нижних ярусов растений, в то время как в верхней части пробирочных растений он обнаружен не был (рис. 2).

Таким образом, в результате исследований разработана лабораторная технология клонального микроразмножения отечественных сортов хризантем

А

Рис. 1. Морфогенетическая активность изолированных первичных эксплантов:

А — каллусогенез на изолированных сегментах листовых пластинок (присутствие в питательной среде ИУК 1 мг/л), Б — индукция ризогенеза на сегментах междоузлий побега (присутствие в питательной среде 2,4-Д), В — индукция образования адвентивных почек на листовых пластинках (присутствие в питательной среде БАП 1 мг/л и ИУК 1 мг/л), Г — активация развития существующих меристем, формирование микропобегов (присутствие в питательной среде БАП 1 мг/л, иУк 0,5 мг/л)

в условиях in vitro, которая включает

3 этапа: культивирование сегментов стебля с одной или двумя пазушными почками на среде, содержащей БАП 1 мг/л и ИУК 0,5 м/л, приводящее к активации роста существующих меристем и формированию побегов; микрочеренкование с одновременным образованием корней; адаптация пробироч-

ных растении к почвенным условиям выращивания.

Клональное микроразмножение растений — сложный многофакторный морфофизиологический процесс, состоящий из двух принципиально разных этапов, проходящих в разных условиях — in vitro и in vivo, базирующихся на процессах онтогенеза, мор-

Б

В

Г

Рис. 2. Электрофореграммы результатов ПЦР (маркер 50-1000Ьр).

А. 1 — Сорт Снежка (нижний ярус), 2 — сорт Снежка (верхний ярус), 3 — маркер мол. веса 50Ьр+1КЬ, 4 — сорт Камила (нижний ярус), 5 — сорт Камила (верхний ярус),

6 — положительный контроль, 7 — отрицательный контроль; Б. 1 — сорт Белый Снег (нижний ярус), 2 — сорт Белый Снег (верхний ярус), 3 — сорт Вдохновение (нижний ярус),

4 — маркер мол. веса 50Ьр+1КЬ, 5 — сорт Вдохновение (верхний ярус), 6 — сорт Октябрь (нижний ярус), 7 — сорт Октябрь (верхний ярус), 8 — положительный контроль,

Brunt A Chrysanthemum B carlavirus. In: Viruses of Plants Kescriptios and Lists from the VIKE Database. CAB international, 1995. P. 398-400. — 4. Hill M.F., Giles R.J., Moran J.R., Hepworth G. The incidence of chrysanthemum stunt viroid, chrysanthemum B carlavirus, tomato aspermy cucumovirus and tomato spotted wilt tospovirus in Australian chrysanthemum crops. Australian Plant Pathot, 1996, 25(3). P. 174-178. — 5. Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassaya with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum, 1962. Vol. 15. N 3. P. 473-497. — 6. Rout G.R.,Kas P. Recent trends in the biotechnology of Chrysanthemum: a critical review. Sci Horti, 1997, 69. P. 239-56. — 7. Wetter C, Milne R.G. Carlaviruses In Plant Virus Infections: Comparative diagnosis. Edited by Kur-stak E. Amsterdam-New York-Kxford: Elsevier, North Holland, Biomedical Press, 1981. P. 695-730.

Рецензент — д. б. н. А.А. Соловьев

SUMMARY

Laboratory technology of chrysanthemums clonal micropropagation in vitro was developed, various primary explants used. Existence of Chrysanthemum Virus B in lower layers was discovered and the absence of the virus was discovered in upper layers of test-tube plants by PSR method.

фогенеза и регенерации растений в условиях in vitro и на структурно-функциональной адаптации пробирочных растений в условиях in vivo. Экспериментально установлено, что реализация морфогенетического потенциала хризантем зависит от генотипа, соответствующей оптимизации состава питательной среды, типа первичного эк-спланта, его полярности и времени изоляции с растения-донора, а также условий культивирования.

Библиографическийсписок

1. Калашникова Е.А., Кочиева Е.З., Миронова О.Ю. Практикум по сельскохозяйственной биотехнологии. М.: КолосС, 2006. — 2.Миронова О.Ю. Микроклональ-ное размножение хризантем для промышленного цветоводства / / Доклады ТСХА. Вып. 275. М.: МСХА, 2003. — 3.

А

Б