Микрофлора желчевыводящих путей больных некалькулезным холециститом Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Э п и де м и о ло ги я

УДК Б1Б.3Б1-008.87:Б1Б.3ББ-002

МИКРОФЛОРА ЖЕЛЧЕВЫВОДЯЩИХ ПУТЕЙ БОЛЬНЫХ НЕКАЛЬКУЛЕЗНЫМ ХОЛЕЦИСТИТОМ

О.К. Поздеев1, Ю.В. Валеева1, А.О. Поздеева2,

1ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», 2ГОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия»

Валеева Юлия Владимировна - e-mail: [email protected]

Проведено изучение характера микробной колонизации желчевыводяших путей больных с

хроническим некалькулезным холециститом. Установлено, что в более чем 50% исследованных образцов присутствуют различные микроорганизмы, среди которых доминировали представители семейства Enterobacteriaceae, энтерококки и Helicobacter pylori.

Ключевые слова: хронический некалькулезный холецистит, желчевыводяшие пути, микробная колонизация, чувствительность к антибактериальным препаратам.

The nature of microbiological colonization of the bile duct was studied in patients with non-calculous cholecystitis. That was found, that in more than 50% of the samples the various microorganisms were presenting, among which the members of the family Enterobacteriaceae, enterococcus and Helicobacter pylori were dominated.

Key words: chronic nekalkulezny cholecystitis, bile path, microbial colonization,

the sensitivity to antibiotics.

Хронический некалькулезный холецистит является одним из самых распространенных заболеваний желчевыводящих путей. В патогенезе подобных поражений многие исследователи важную роль отводят микробному фактору [1, 2, 3]. Принято считать, что в норме желчь является стерильной. Это обеспечивается комплексом бактерицидных

факторов: желчные кислоты, секреторный ^, слизистое отделяемое эпителиальной выстилки желчевыводящих

путей и т. д. [4, 5].

Микробная колонизация желчевыводящих путей возможна за счет нисходящего проникновения микроорганизмов гематогенным и лимфогенным путями из хронических очагов

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

Эпидемиология

IVh

МЕДИЦИНСКИЙ

АЛЬМАНАХ

инфекции либо, чаще, восходящим путем из желудочнокишечного тракта.

В последние годы особый интерес вызывают сообщения о находках Helicobacter pylory в органах гепатобилиарной системы при различных патологиях [6, 7, 8, 9, 10].

Цель исследования: изучить характер микробной колонизации желчевыводящих путей больных хроническим некалькулезным холециститом и определить чувствительность выделенных штаммов к антибактерильным препаратам.

Материалы и методы

Материалом для исследования служили образцы желчи, отобранные при дуоденальном зондировании в асептических условиях у 50 человек, страдающих хроническим некалькулезным холециститом (20 мужчин, 30 женщин). Порции желчи доставляли в лабораторию в течение 2-3 часов с момента взятия.

Выделение аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов производили посевом на 5% кровяной агар (КА), среды Эндо, Плоскирева, желчно-щелочной агар (ЖЩА), с последующей биохимической идентификацией.

Для выделения Н. pylori использовали эритрит-кровяной агар. Посевы культивировали в микроаэрофильных и кап-нофильных условиях при 37°С. Идентификацию культур проводили с учетом морфологии, характерной подвижности и определением уреазной активности в CLO-тесте.

Выделение анаэробных бактерий проводили на среде для контроля стерильности (СКС), модифицированной добавлением среды 199 (в соотношении 9 : 1), 5% эмбриональной телячьей сыворотки (Serva, Германия), 10% лизированной ^ двукратным замораживанием и оттаиванием донорской крови и 10% глицерина. Для выявления анаэробов рода Bacteroides образцы (по 8-10 мл) засевали на среды СКС-199; СКС-199, дополненную налидиксовой кислотой из расчета 30 мкг/мл (СКС-199 НК) и среду СКС, дополненную канамицином (1 мг/мл) и желчью, добавляя 20 г сухой желчи к 1 л готовой среды. Посевы культивировали в анаэро-стате при при 37°С. В случае отсутствия видимого роста в течение 24-48 часов, посевы сохраняли в анаэростате до 5 суток. После появления признаков роста проводили пересев на анаэробный гемагар.

При выделении прочих анаэробов производили непосредственный высев на свежеразлитые или прередуциро-ванные чашки с анаэробным гемагаром, дополненным 10% ЭТС, 100 мкг витамина К (Serva, Германия), 80 мкг гемина (Sigma, США), 1% дрожжевого экстракта (Difco, США) и 50 мкг тиамин пирофосфата (Sigma, США). Также в среды вносили неомицин, канамицин (по 75-80 мкг/мл), гентамицин ^ (50 мкг/мл) или налидксовую кислоту (40 мкг/мл). Затем рН сред доводили до 7,5 с помощью NaHCO3, вносили 25 мМ буфера HEPES (Serva, Германия). Посевы культивировали в анаэростате при 37°С.

Для определения чувствительности штаммов к антибактериальным препаратам применяли диско-диффузионный метод со стандартными дисками. В работе использовали диски импрегнированные антибиотиками и антибактериальными химиопрепаратами. После идентификации выделенной культуры готовили бактериальную взвесь: изолированные колонии суспензировали в изотоническом растворе хлорида натрия. Мутность суспензии культуры соответство-

вала стандарту по шкале Мак-Фарланду 0,5 (<109). Затем 1 мл взвеси наносили на кровяной агар и равномерно распределяли покачиванием чашки, избыток удаляли пипеткой. Через 10 мин. пинцетом на поверхности среды раскладывали шесть дисков на одинаковом расстоянии друг от друга. Чашки культивировали пять суток в микроаэрофильных условиях при 37°С. Затем с помощью штангенциркуля измеряли диаметры зон задержки роста вокруг дисков и сопоставляя с данными таблиц, содержащих пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно чувствительных и чувствительных штаммов. Полученные значения диаметров зон задержки роста сравнивали с пограничными значениями и относили изучаемые штаммы к одной из трех категорий чувствительности.

Результаты исследования

Бактериологическое исследование образцов желчи больных хроническим некалькулезным холециститом (ХНХ) показало присутствие аэробных и факультативноанаэробных бактерий в 32 образцах базальной желчи (порция А), в 21 образце пузырной порции желчи (порция В) и 13 образцах протоковой желчи (порция С) (таблицы 1, 2 и 3). Уровни микробной обсемененности были низкими, в пределах 1,0-1,5х102 КОЕ/мл.

Установлено, что у лиц старшего возраста (от 45 лет и более) в порции А микроорганизмы присутствуют в виде микстов, в том числе, включающих 5 и более видов микроорганизмов. В частности, в пяти образцах были одновременно выделены Escherchia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonasaeruginosa,Enterococcusfaecalis иStaphylococcus aureus, в трех - Escherchia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, виды Aspergillus. Helicobacter pylori был обнаружен в 22±5,9% образцах порции А. Уровни обсемененности составили, в среднем, 1,8х103 КОЕ/мл. Анаэробные бактерии были обнаружены у 11 пациентов (22%). В 7 образцах были выделены бактерии группы Bacteroides fragilis (14%), на гемагаре - 2 изолята Clostridium perfringens (4%).

ТАБЛИЦА 1.

Аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, наиболее часто выделяемые из порции А желчи больных хроническим некалькулезным холециститом (n=50)

Микроорганизм Количество положительных находок (%)

Escherchia coli 32 (64%)

Klebsiella pneumoniae 19 (38%)

Enterobacter agglomerans 11 (22%)

Citrobacter koseri 6 (12%)

Acinetobacter calcoaceticus 8 (16%)

Enterococcus faecalis 14 (28%)

Staphylococcus aureus 6 (12%)

Candida albicans 7 (14%)

Виды Aspergillus 9 (18%)

Helicobacter pylori 11 (22%)

Исследование пузырной желчи (порция В) выявили присутствие аэробных и факультативно-анаэробных бактерий в 21 образце. При этом, в порции В спектр микроорганизмов был существенно более узким, а уровень обсемененности

Эпидемиология

составил, в среднем, 1,2х103 КОЕ/мл. H. pylori был обнаружен в 20±5,7% образцов пузырной порции желчи; уровни обсемененности составили, в среднем, 1,6х103 КОЕ/мл.

ТАБЛИЦА 2.

Аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, наиболее часто обнаруживаемые в порции В желчи больных хроническим некалькулезным холециститом

Микроорганизм Количество положительных находок (%)

Escherchia coli 21 (42%)

Klebsiella pneumoniae 10 (20%)

Enterobacter agglomerans 6 (12%)

Enterococcus faecalis 4 (8%)

Acinetobacter calcoaceticus 7 (14%)

Staphylococcus saprophyticus 6 (12%)

Helicobacter pylori 10(20%)

Candida albicans 5 (10%)

В образцах порции C у лиц старшего возраста (от 45 лет и более) были также выделены многокомпонентные миксты. В 4 образцах были одновременно выделены Escherchia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, Enterobacter agglomerans, Acinetobacter calcoaceticus, Staphylococcus saprophyticus и Candida albicans, в 2 - Escherchia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter agglomerans, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticus и Candida albicans.

Исследования образцов протоковой желчи (порция С) позволили идентифицировать аэробные и факультативноанаэробные бактерии в 13 образцах. При этом виды микроорганизмов в порции С был в значительной степени сходны с таковыми, выделенными в порции В.

В образцах желчи порции С у лиц старшего возраста (от 45 лет и более) были выделены смешанные культуры бактерий, но в состав этих микстов входили максимум 3-4 вида бактерий. Всего таковые были обнаружены в 7 образцах. В 5 образцах были одновременно выделены Escherchia coli, Klebsiella pneumoniae и Enterococcus faecalis, в 2 - Escherchia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter calcoaceticus. Helicobacter pylori был выделен в 16±5,2%. образцов желчи порция С. Уровни обсемененности составили, в среднем, 1,3х103 КОЕ/мл. Анаэробные бактерии группы Bacteroides fragilis были обнаружены в 5 образцах порции С (10%).

ТАБЛИЦА 3.

Аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, выделенные из порции С желчи больных хроническим некалькулезным холециститом

Микроорганизм Количество положительных находок (%)

Escherchia coli 13 (26%)

Klebsiella pneumoniae 8 (16%)

Enterobacter agglomerans 6 (12%)

Enterococcus faecalis 5 (10%)

Acinetobacter calcoaceticus 5 (10%)

Helicobacter pylori 8 (16%)

Для изучения чувствительности к антибактериальным препаратам нами были отобраны культуры бактерий, наиболее часто выявляемых из порций желчи больных хроническим некалькулезным холециститом: Escherchia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter agglomerans, Enterococcus faecalis, Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus saprophyticus, Helicobacter pylori.

Установлено, что наибольшую чувствительность штаммы Escherchia coli проявляли к имипенему (96%) и тобрамици-ну (78,%), эритромицину (78%), ципрофлоксацину (74%), амоксицилину и тетрациклину (70%). Штаммы отличала достаточно высокая резистентность выявлена в отношении фуразолидона (40%) и линкомицина (68%). Исследованные штаммы Escherchia coli были абсолютно устойчивы к действию метронидазола. У другого представителя семейства Enterobacteriaceae - Klebsiella pneumoniae - отмечена сходная чувствительность к большинству антибактериальных препаратов, исключая, макролиды: эритромицин (46%) и кларитромицин (42%), к которым они проявляли умеренную чувствительность. Бактерии оказались устойчивыми к действию линкозамидов (62%). Аналогичные свойства проявляли и другие представители семейства - энтеробактеры, оказавшиеся высокочувствительными к большей части исследованных антибактериальных препаратов. В то же время бактерии были малочувствительными к линкозами-дам и резистентными к действию метронидазола. Умеренную чувствительность, не превышающую 60%, проявляли к большинству препаратов штаммы Enterococcus faecalis. При этом бактерии были высоко резистентыми к амоксициллину, линкомицину, метронидазолу и фуразолидону. Выраженная полирезистентность отличала Acinetobacter calcoaceticus, ^ оказавшиеся умеренно чувствительными только к импинему (62%), тобрамицину (50%) и тетрациклину (38%). В противоположность этому, выделенная в 4 образцах порции А желчи Pseudomonas aeruginosa проявляла чувствительность к амоксициллину (74%), имипенему (75%) ципрофлокса-цин (76%) и тобрамицину (50%). Выделенные штаммы сапрофитического стафилококка проявляли достаточно высокую чувствительность к тестируемым антибактериальным препаратам, исключая метронидазол.

Анализ полученных результатов показывает, что выделенные штаммы Helicobacter pylori были чувствительны к Р-лактамным антибиотикам, ингибирующим синтез клеточной стенки, наибольшую активность проявлял амоксицил-лин: к нему были чувствительны 26 штаммов из 32 выделенных из всех порций желчи, что составило 81,2%. Двенадцать штаммов Helicobacter pylori были чувствительны к производному карбапенемов (имипенему), что составило 37,5% от всех изученных изолятов.

Среди макролидов, подавляющих синтез белка, нами установлена высокая чувствительность Helicobacter pylori к кларитромицину. Из выделенных 32 штаммов чувствительными были 26 изолятов (81,2%). В меньшей степени Helicobacter pylori были чувствительны к эритромицину (71,8%).

В то же время бактерии проявляли умеренную чувствительность к аминогликозидам, обладающих сходным механизмом действия. Среди изученных штаммов Helicobacter pylori к тобромицину были чувствительны 18 изолята (56,2%), а к канамицину - 14 (43,7%).

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

Э п и де м и о логи я

ivk

МЕДИЦИНСКИЙ

АЛЬМАНАХ

Чувствительными к тетрациклину оказался 21 штамм (65,6%). Несколько меньшую чувствительность бактерии проявляли к доксициклину - чувствительными оказались 20 изолятов, что составило 62,5% от числа всех изученных штаммов. Нами была установлена высокая резистентность Helicobacter pylori к производному линкозамидов - линко-мицину, к действию которого были устойчивы 59,3% штаммов.

Также нами была изучена чувствительность в отношении некоторых антибактериальных химиопрепаратов. Было установлено, что 24 штамма (75%), выделенных из желчи

больных с хроническим некальклезным холециститом, были чувствительны к ципрофлоксацину. Из исследованных 32 штаммов Helicobacter pylori только 13 изолятов (40,6%) были чувствительны к метронидазолу (хотя его практически всегда включают в комбинацию при проведении антихели-кобактерной терапии). Аналогичную низкую чувствительность бактерии проявляли к производным нитрофуранов; чувствительными к фуразолидону были лишь 12 штаммов из изученных 32, что лишь составило 37,5%.

Выводы

1. Установлено присутствие микроорганизмов в желчи Escherchia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter agglomerans, Enterococcus faecalis, Acinetobacter calcoaceticus, Staphylococcus saprophyticus, Candida albicans, Helicobacter pylori у больных хроническим некалькулезным холециститом. Во всех изученных образцах доминировали Escherchia coli, Klebsiella pneumoniae и Enterococcus faecalis.

2. У пациентов с хроническим некалькулезным холециститом частота выделения Helicobacter pylori из порций желчи

^ составила, в среднем, 19,2%.

3. Наибольшую чувствительность выделенные штаммы Escherchia coli и Klebsiella рneumonia проявляли к амоксицил-лину (77,2%), имипенему (91,2%), наименьшую - к линко-

мицину (52,3%) и фуразолидону (48,6%). Штаммы Enterococcus faecalis проявляли умеренную чувствительность к тетрациклину (48%), тобрамицину (57,5%), имипенему (51,5%) и каномицину (45,4%). Изоляты Helicobacter pylori были чувствительны к амоксицилину b кларитромици-ну (81,2%), ципрофлоксацину (75%), эритромицину (71,8%) и проявляли резистентность к линкомицину(55,1%), фуразолидону (44,8%) и метронидазолу (41,3%).

ЛИТЕРАТУРА

1. Fox J.G. et al. Hepatic Helicobacter species identified in bile and gallbladder tissue from Chileans with chronic cholecystitis. Gastroenterology. 1998. Vol. 114. № 4. P. 755-763.

2. Bulajic М. et al. Helicobacter pylori and the risk of benign and malignant biliary tract disease. Cancer. 2002. Vol. 95. № 9. P. 1946-1953.

3. Figura N. et al. Most Helicobacter pylori-infected patients have specific antibodies, and some also have H. pylori antigens and genomic material in bile: is it a risk factor for gallstone formation? Dig. Dis. Sci. 1998. Vol. 43. № 4. P. 854-862.

4. Keclik М. et al. Immunoglobulins and antibodies in gallbladder bile. Am. J. Gastroenterol. 1970. Vol. 54. № 1. P. 19-29.

5.Hall J.G., Andrew Е. Biliglobulin: a new look on IgA. Immunol. Today. 1980. № 1. P. 100.

6. Avenaud Р. et al. Detection of Helicobacter species in the liver of patients with and without primary liver carcinoma. Cancer. 2000. Vol. 89. № 7. P. 1431-1439.

7. Fan X.G. et al. Helicobacter species ribosomal DNA recovered from the liver tissue of Chinese patients with primary hepatocellular carcinoma. Clin. Infect. Dis. 2002. Vol. 35. № 12. P. 1555-1557.

8. Fukuda К. et al. Comparative analysis of helicobacter DNAs and biliary pathology in patients with and without hepatobiliary cancer. Carcinogenesis. 2002. Vol. 23. № 11. P. 1927-1931.

9. Rocha М. et al. Association of Helicobacter species with hepatitis С cirrhosis with or without hepatocellular carcinoma. Gut. 2005. Vol. 54. № 3. P. 396-401.

10. Pradhan S.B. Study of Helicobacter hepaticus in gallbladders with cholelithiasis and its sensitivity pattern. Kathmandu Univ. Med. J. (KUMJ). 2009. Vol. 7. № 26. P. 125-128.