CC BY
53
УДК 579.61, 616-008
Е.И. Иванова Л.И. Колесникова Л.В. Рычкова М.В. Савелькаева У.М. Немченко ', Е.Б. Ракова 2
МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКАЯ И АССОЦИАТИВНАЯ СТРУКТУРА КИШЕЧНОГО БИОЦЕНОЗА ДЕТЕЙ С ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ НАРУШЕНИЯМИ ПИЩЕВАРЕНИЯ
1ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека», Иркутск, Россия 2 ФГБОУ ВО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России, Иркутск, Россия
Цель исследования: изучить микробный пейзаж и ассоциативную структуру микробиоты толстого кишечника у детей с функциональными нарушениями пищеварения. С помощью бактериологического метода изучен состав кишечного микробиоценоза 225 детей с функциональными нарушениями пищеварения и 100 здоровых детей. Отличительной особенностью микроэкологического статуса кишечного биоценоза является значительно большая, по сравнению со таковой у здоровых детей, распространённость энтерококков, что может стать риском для появления штаммов с наличием ряда факторов патогенности, вызывающих инфекционные процессы. Ключевые слова: функциональные расстройства пищеварения, кишечная микробиота, ассоциации микроорганизмов, дисбиотические изменения.
MiCROECOLOGiCAL AND ASSOCiATiVE STRUCTURE OF iNTESTiNAL BiOCENOSiS iN CHiLDREN WiTH FUNCTiONAL GASTROiNTESTiNAL DiSORDERS
E.I. Ivanova L.I. Kolesnikova L.V. Rychkova M.V. Savelkaeva U.M. Nemchenko \
E.B. Rakova 1 2
1 Scientific Сentre for Family Health and Human Reproduction Problems, Irkutsk, Russia
2 Irkutsk State Medical University, Irkutsk, Russia
The article is devoted to one of actual problems of gastroenterology - study of microbiocenosis of gastrointestinal tract in functional disorders. Functional gastrointestinal disorders (FGID] or minimal dysfunctions of digestion are frequent in the first months of child's life and provoke anxiety both in parents and in pediatricians.
Aim: to explore the microbial landscape and the associative structure of the microbiota of the large intestine in children with functional disorders of the gastrointestinal tract.
Subjects and methods: Intestinal microbiota composition of225 children with functional gastrointestinal disorders and 100 healthy children was studied using bacteriological method.
Results. The 88.4 % frequency of detection of intestinal eubiosis disorders is discussed. Information is provided on the species composition of the major opportunistic organisms that inhabit this biotope. According to the results, decrease of bifidobacteria amount in structure of large intestine microbiota increases rate of detection of opportunistic microorganisms - predominantly, Klebsiella genus bacteria and Staphylococcus aureus. The intestinal microbial community is dominated by multicomponent transient association. The frequency of detection of pathogenic Staphylococcus in children under one year is discussed in detail.
Conclusions. A distinctive feature of the intestinal biocenosis microecological status is significantly greater spread of enterococci than in healthy children, which can be a risk for the emergence of strains with the presence of a number of pathogenecity factors that cause infectious processes.
Key words: functional gastrointestinal disorders, intestinal microbiota, associations of microorganisms, dysbiotic changes
Состояние микробиоты кишечника является важнейшим фактором здоровья ребёнка. Как показывают последние исследования, индивидуальность и определённое постоянство микробиоты каждого человека во многом определены генетически, но в то же время микробиоценоз чутко реагирует на любые внешние воздействия, что характеризует его лабильность [6, 7]. Нарушение бактериальной составляющей микробиоты кишечника может привести к угнетению метаболической и секреторной активности клеток кишечного эпителия, снижению резистентности слизистых барьеров, изменению метаболизма колоноцитов и повлиять на местный иммунный ответ [8, 9]. Очевидно, что поддержание гомеостаза и нормального обмена веществ невозможно без восстановления разнообразия нормальных ассоциаций микроорганизмов кишечника [3].
Цель исследования: изучить микробный пейзаж и ассоциативные структуры микробиоты толстого кишечника у детей с функциональными нарушениями пищеварения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования служили копро-пробы 225 детей с функциональными нарушениями пищеварения (ФНП) (колики, функциональная диарея, функциональные запоры, дисфункция билиарно-го тракта в течение не менее 12 недель за последние 12 месяцев) и 100 здоровых детей в возрасте до 15 лет. Факторами исключения из исследования были хронические заболевания, в том числе желудочно-кишечного тракта, приём антибактериальных и пробиотиче-ских препаратов в предшествующие до обследования 3 месяца. Исследования проводились в соответствии с этическими стандартами Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2008 г.).
Изучение видового и количественного состава кишечной микробиоты проводили с использованием классических бактериологических методов на базе лаборатории микробиома и микроэкологии ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека». Степень дисбиотических нарушений микробиоты толстого кишечника определяли со-
гласно Отраслевому стандарту «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника».
Для выявления долевого участия разных видов в структуре биоценоза использовали показатель постоянства (с), определяемый по формуле:
с = (p / P) х 100 %, где с - показатель постоянства; p - число наблюдений, содержащих изучаемый вид; P - общее число наблюдений. В зависимости от полученного значения, виды подразделяли на постоянные (с > 50 %), добавочные (25 % < с < 50 %) и случайные (с < 25 %) [4].
Для статистической обработки полученных данных использовали стандартный пакет программ Excel. Вычисляли средние значения, стандартное отклонение, стандартную ошибку.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
По результатам бактериологических исследований копрологических проб установлено, что почти у всех детей с ФНП регистрируются дисмикробиоце-нотические нарушения. Более чем у половины из них отмечался дисбиоз кишечника II степени (62,2 %), а дисбиоз I и III степени - в 22,2 % и 4,0 % случаев соответственно. И только у 11,6 % детей микробиота находилась в состоянии динамического равновесия и соответствовала понятию нормы.
У большей части обследованных (73,3 ± 2,9 %) наблюдался дисбаланс облигатной микробиоты. Так, дефицит бифидобактерий зарегистрирован у половины детей (55,5 ± 3,3 %), а дефицит лактобацилл -только у 1,3 ± 0,7 %. В 16,4 ± 2,4 % случаев (40 чел.) у детей определялся дефицит E. coli с нормальными ферментативными свойствами.
На фоне снижения доминирования и значимости индигенной симбиотической биоты в микроэкологической системе кишечника отмечалась персистенция различных представителей условно патогенных микроорганизмов (УПМ) в значительном количестве (5-7 lg КОЕ/г).
Всего в кишечной микробиоте идентифицированы следующие виды микроорганизмов с показателем постоянства (с): для Enterococcus spp. - 71,6 % (средний уровень популяционной плотности - 6,8 ± 0,5 lg КОЕ/г), Klebsiella spp. - 37,3 % (6,0 ± 1,0 lg КОЕ/г), E. coli со слабой ферментативной активностью - 27,1 % (7,2 ± 0,6 lg КОЕ/г), Staphylococcus spp. - 24,5 % (4,8 ± 0,6 lg КОЕ/г), Clos-
tridium spp. - 17,3 % (4,6 ± 1,4 lg КОЕ/г), Candida spp. -15,1 % (4,7 ± 0,7 lg КОЕ/г), E. coli с гемолитической активностью - 11,6 % (7,3 ± 0,6 lg КОЕ/г), Enterobacter spp. - 9,7 % (5,6 ± 0,9 lg КОЕ/г), Citrobacter spp. - 4,4 % (5,6 ± 0,8 lg КОЕ/г), Pseudomonas spp. - 3,1 % (5,1 ± 1,1 lg КОЕ/г) и Proteus spp. - 1,8 % (6,7 ± 0,5 lg КОЕ/г) (рис. 1).
Таким образом, доминирующим видом, формирующим ядро микробиоценоза кишечника, являлся Enterococcus spp, добавочными (видами-наполнителями) - Klebsiella spp., E. coli со слабой ферментативной активностью и Staphylococcus spp., остальные выявленные виды относились к транзиторной (случайной) микробиоте [5].
У большей части детей (66,2 %) из копропроб выделены различные виды условно-патогенных микроорганизмов. В монокультуре представители УПМ встречались у каждого третьего ребёнка (31,6 %). Наиболее выявляемыми в монокультуре являлись следующие представители факультативной микро-биоты: Klebsiella spp. (12,4 %), реже - Clostridium spp. (5,8 %), Enterobacter spp. (4,9 %), Staphylococcus aureus (4,4 %) и Candida spp. (2,7 %); Pseudomonas aeruginosa (1,3 %), Citrobacter spp. (0,4 %) и S. epidermidis (0,4 %). В 34,7 % случаев у обследованных детей выделены ассоциации, состоящие от 2 до 4 компонентов (ассо-циантов) в биотопе, что является критерием выраженных нарушений формирования нормобиоценоза кишечника. Кроме того, необходимость изучения микроорганизмов как ассоциантов в сообществе, а не как суммы монокультур, обосновывается тем, что в ассоциациях микробные продукты действуют синер-гически, способствуя росту и размножению бактерий, экспрессии факторов патогенности [1, 2].
У четверти обследованных детей (25,3 %) в кишечном биотопе обнаруживались двухкомпонентные сочетания УПМ. Ассоциации, состоящие из 3 и 4 ас-социантов, регистрировались крайне редко (7,1 % и 2,2 % соответственно) (рис. 2).
Из двухкомпонентных ассоциаций преобладали Klebsiella spp. + S. aureus (28,1 %), Klebsiella spp. + Candida spp. (26,3 %), реже встречались Klebsiella spp. + Clostridium spp. (8,8 %), Enterobacter spp. + S. aureus (7,0 %), Klebsiella spp. + Citrobacter spp. (3,5 %). Другие двухкомпонентные сочетания УПМ встречались крайне редко (около 2 % случаев).
80
Кишечная микробиота
Рис. 1. Спектр и частота встречаемости микроорганизмов желудочно-кишечного тракта у детей с ФН ЖКТ (п = 225).
Рис. 2. Ассоциативная структура кишечного микробиоценоза у детей с ФН ЖКТ (%).
Таблица 1
Частота обнаружения и количество микроорганизмов в 1 г копроматериала у здоровых детей
Наименование микроорганизма Частота обнаружения (коэффициент постоянства, с), % Популяционная плотность (М ± m), lg КОЕ/г
Анаэробные микроорганизмы
Бифидобактерии 100 8,2 ± 0,1
Лактобактерии 100 6,2 ± 0,1
Аэробные микроорганизмы
E. coli с нормальной ферментативной активностью 100 6,2 ± 0,3
E. coli со слабой ферментативной активностью 12,7 ± 3,3 6,1 ± 0,5
Enterococcus spp. 13,0 ± 3,3**4 4,1 ± 0,2
Staphylococcus spp. 5,6 ± 2,3 3 ± 0,1
Примечание. **i - p < 0,01, по сравнению с аналогичным показателем у детей с ФН.
В группе здоровых детей микробный пейзаж копропроб характеризовался доминирующим положением облигатных анаэробных микроорганизмов (бифидобактерий и лактобацилл), из числа аэробных микроорганизмов в 100,0 % случаев выделялась нормальная кишечная палочка (табл. 1).
Состав микробиоты толстой кишки у детей первого года жизни и старше с ФНП имел свои особенности. Распространённость дефицита представителей ин-дигенной биоты у детей первого года жизни и детей старшего возраста с ФНП регистрировалась приблизительно на одинаковом уровне. Частота встречаемости E. coli со слабой ферментативной активностью и патогенных энтеробактерий (Klebsiella spp.) у детей первого года жизни была почти в 2 раза выше, по сравнению с детьми старше года. Носительство S. aureus у детей младшей группы регистрировалось в 6 раз чаще, по сравнению с детьми старшей возрастной группы, и составляло 49,4 %, что свидетельствует о более глубоком нарушении микробиоты именно у детей первого года жизни. Эти возрастные особенности микроэкологическиххарактеристик согласуются с процессами сукцессии кишечного тракта, особенно активно проходящих в первый год жизни детей.
С возрастом у детей спектр регистрируемых нами условно патогенных микроорганизмов снижался, за исключением грибов рода Candida. Колонизация кишечника дрожжеподобными грибами рода Candida среди детей старшей группы была выше в 3 раза таковой у детей младшей группы и составляла 20,0 ± 3,3 %.
Таким образом, наряду с общими закономерностями, связанными с широким распространением среди детей с ФНП дефицита индигенной микробиоты, отличительной особенностью микроэкологического статуса кишечного биоценоза является значительно большее, по сравнению со здоровыми детьми, распространение энтерококков. Это может быть риском для появления штаммов с наличием ряда факторов патогенности, вызывающих инфекционные процессы. Кроме того, нами отмечено, что у детей с пониженной колонизационной резистентностью, к коим относятся дети с ФНП, процессы сукцессии, установление микроэкологического гомеостаза завершаются достаточно поздно - к 3-4-му году жизни. Совокупность полученных результатов настоящего исследования существенно расширяет и дополняет имеющиеся представления для оценки микроэкологического статуса кишечника при функциональных нарушениях у детей, что может служить прогностическим критерием течения заболевания.
ЛИТЕРАТУРА REFERENCES
1. Бухарин О.В., Кремлева Е.А., Сгибнев А.В. Роль ассоциативных микросимбионтов в функционировании ассоциативного симбиоза // Журнал микробиологии. - 2012. - № 6. - С. 89-95.
Bukharin OV, Kremleva EA, Sgibnev AV (2012). Role of associative microsymbionts in functioning of associative symbiosis [Rol' assotsiativnykh mikrosimbiontov
v funktsionirovanii assotsiativnogo simbioza]. Zhurnal mikrobiologii, (6), 89-95.
2. Бухарова Е.В., Попкова С.М., Ракова Е.Б., Джио-ев Ю.П., Шабанова Н.М., Иванова Е.И., Немченко УМ., Савелькаева М.В. Микроэкологическая характеристика региональных популяций Klebsiella spp. в кишечной микробиоте детей г. Иркутска // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2013. - № 2, Ч. 2. - С. 93-96.
Bukharova EV, Popkova SM, Rakova EB, Dzhioev YP, Shabanova NM, Ivanova EI, Nemchenko UM, Savelkaeva MV (2013). Microecological characteristics of Klebsiella spp. regional populations in the intestinal microbiota of Irkutsk children [Mikroekologicheskaya kharakteristika regional'nykh populyatsiy Klebsiella spp. v kishechnoy mikrobiote detey g. Irkutska]. Bulleten' Vostocno-Sibirs-kogo naucnogo centra., 2 (2), 93-96.
3. Егшатян Л.В., Ткачева О.Н., Кафарская Л.И., Шко-поров А.Н., Тяхт А.В. Изменения кишечной микрофлоры, ассоциированные с возрастом и образом жизни // Ожирение и метаболизм. - 2015. - Т. 12, № 2 - С. 3-9.
Egshatyan LV, Tkacheva ON, Kafarskaya LI, Shkopo-rov AN, Tyakht AV (2015). The changes of gut microbiota associated with age and lifestyle [Izmeneniya kishechnoy mikroflory, assotsiirovannye s vozrastom i obrazom zhizni]. Ozhirenie i metabolism, 12 (2), 3-9.
4. Захарова Ю.В. Биологические свойства бифидо-бактерий в ассоциативном симбиозе толстой кишки // Медицина в Кузбассе. - 2010. - № 1. - С. 14-16.
Zakharova YV (2010). Biological properties of bifidobacteria in associative symbiosis of the large intestine [Biologicheskie svoystva bifidobakteriy v assotsiativnom simbioze tolstoy kishki]. Meditsina v Kuzbasse, (1), 14-16.
5. Иванова Е.И., Попкова С.М., Джиоев Ю.П., Ракова Е.Б., Немченко УМ., Рычкова Л.В. Выявление шига-токсинпродуцирующих штаммов Escherichia coli в популяциях нормальной кишечной микробиоты у детей с функциональными нарушениями желудоч-
сведения об авторах information about the authors
но-кишечного тракта // Клиническая лабораторная диагностика. - 2014. - Т. 59, № 11. - С. 56-60.
Ivanova EI, Popkova SM, Dzhioev YP, Rakova EB, Nemchenko UM, Rychkova LV (2014). Detection of Shiga toxin-secreting Escherichia coli strains in the populations of normal intestinal microbiota in children with functional disorders of the gastrointestinal tract [Vyyavlenie shiga-toksinprodutsiruyushchikh shtammov Escherichia coli v populyatsiyakh normal'noy kishechnoy mikrobioty u detey s funktsional'nymi narusheniyami zheludochno-ki-shechnogo trakta]. Klinicheskaya laboratornaya diagnos-tika, 59 (11), 56-60.
6. Макарова С.Г., Намазова-Баранова Л.С. Кишечная микробиота и использование пробиотиков в практике педиатра. Что нового? // Педиатрическая фармакология. - 2015. - Т. 12, № 1 - С. 38-45.
Makarova SG, Namazova-Baranova LS (2015). Intestinal microbiota and use of probiotics in pediatric practice: What's new? [Kishechnaya mikrobiota i ispol'zovanie probiotikov v praktike pediatra. Chto novogo?]. Pediatrich-eskaya farmakologiya, 12 (1), 38-45.
7. Мамонтова Л.М., Савилов Е.Д., Протодьяконов А.П., Маркова Ю.А. Инфекционная «агрессивность» окружающей среды: концепция микробиологического мониторинга. - Новосибирск, 2000. - 240 с.
Mamontova LM, Savilov ED, Protodyakonov AP, Markova YA (2000). Infectious "aggressiveness" of the environment: microbiological monitoring concept [Infektsionnaya «agressivnost» okruzhayushchey sredy: kontseptsiya mikrobiologicheskogo monitoringa], 240.
8. Garcia Rodriguez С (2007). Toll-like receptor 4 dependent pathways as sensors of endogenous «danger» signals. New evidences and potential therapeutic targets. Immunology, 26 (4), 210-215.
9. Sawant PD, Venkatraman J, Ducrotte PR (2010). Evaluation of Lactobacillus plantarum 299v Efficacy in IBS: Results of a randomized placebo-controlled trial in 200 patients. Digestive Disease Week, 34.
Иванова Елена Иннокентьевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» (664025, г Иркутск, ул. Карла Маркса, 3, тел.: 8 (3952) 33-34-41; e-mail: ivanova.iem@gmail.com)
Ivanova Elena Innokentyevna - Candidate of Biological Sciences, Senior Research Officer of Scientific Centre for Family Health and Human Reproduction Problems (664025, Irkutsk, Karl Marks str., 3; tel.: +7 (3952) 33-34-41; e-mail: ivanova.iem@gmail.com) Колесникова Любовь Ильинична - член-корреспондент РАН, заслуженный деятель науки РФ, научный руководитель ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» (664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16, тел.: 8 (3952) 20-73-67)
Kolesnikova Lyubov Iljinichna - Corresponding Member of RAS, Scientific Advisor of Scientific Centre for Family Health and Human Reproduction Problems (664003, Irkutsk, Timiryazev str., 16; tel.: +7 (3952) 20-73-67)
Рычкова Любовь Владимировна - доктор медицинских наук, профессор, директор ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» (e-mail: zam_gunc@mail.ru)
Rychkova Lyubov Vladimirovna - Doctor of Medical Sciences, Professor, Director of Scientific Centre for Family Health and Human Reproduction Problems (e-mail: zam_gunc@mail.ru)
Савелькаева Марина Владимировна - заведующая отделением гастроэнтерологии клиники ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» (тел.: 8 (3952) 33-34-45; e-mail: for-samarina@yandex.ru) Savelkaeva Marina Vladimirovna - Head of the Department of Gastroenterology of the Clinic of Scientific Centre for Family Health and Human Reproduction Problems (tel.: +7 (3952) 33-34-45; e-mail: for-samarina@yandex.ru)
Немченко Ульяна Михайловна - кандидат биологических наук, научный сотрудник ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» (e-mail: umnemch@mail.ru)
Nemchenko Ulyana Mikhaylovna - Candidate of Biological Sciences, Research Officer of Scientific Centre for Family Health and Human Reproduction Problems (e-mail: umnemch@mail.ru)
Ракова Елена Борисовна - кандидат биологических наук, научный сотрудник ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека»
Rakova Elena Borisovna - Candidate of Biological Sciences, Research Officer of Scientific Centre for Family Health and Human Reproduction Problems
