CC BY
69
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
© Коллектив авторов, 2012 г. УДК 612.31:612.313.63
В. В. Тец, М. Ф. Вечерковская,
A. А. Доморад, Д. С. Викина,
Д. В. Михайлова, Е. И. Онищенко, Г. В. Тец, Ю. А. Трофимова,
B. В. Харламова
МИКРОБЫ, НЕ ИЗВЕСТНЫЕ КАК ПРЕДСТАВИТЕЛИ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ ЧЕЛОВЕКА
Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова
Чистые культуры идентифицированы по биохимической активности с помощью автоматической системой У^ес -2 (Б1оМег1ё).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Практически все микроорганизмы в использованных нами условиях вырастали в составе смешанных биопленок, которые по виду похожи на колонии чистых культур бактерий (рис. 1, а).
Выявленные смешанные биопленки по организации идентичны смешанным микробным сообществам, описанным нами ранее [1, 18-20]. В результате пересева на разные среды удается разделить минимальное количество смешанных биопленок. Смешанные бактериальные биопленки оказались устойчивыми сообществами, которые выдерживали многократные (изу-
ВВЕДЕНИЕ
Одной из важнейших проблем современной медицины является изучение и идентификация микроорганизмов, представляющих нормальную микрофлору (микробиота). Несмотря на очевидное значение микрофлоры человека в поддержании жизнедеятельности и участии в формировании различных патологий, она остается малоизученной. Считается, что мы знаем не более 5 % микроорганизмов нормальной микрофлоры [8, 12]. Причиной недостаточной изученности нормальной микрофлоры является отсутствие методов культивирования, обеспечивающих выделение чистых культур этих микробов. В число не изученных и практически не известных входят различные бактерии, археи, грибы и вирусы. В пользу их присутствия говорят результаты изучения ДНК микробиоты, которое показывает наличие большого числа генов, принадлежащих неизвестным бактериям [7].
Целью работы было выявление и идентификация в нормальной микрофлоре ротовой полости малоизученных или не известных ранее аэробных бактерий.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материал для исследования: слюна людей в возрасте от 19 до 60 лет.
Культивирование. Для выделения бактерий использовали различные жидкие и агаризованные питательные среды - бруцелла агар, эндо, кровяной агар, ага-ризованная среда LB.
Полученные на агаризованной среде колонии анализировали по морфологии.
Для изучения бактерий использованы методы окраски по Граму и световой микроскопии, микроскоп Olympus BX51TF (Olympus Corp., Japan), Digital Microscope Camera ProgRes® CF. Программа для компьютера - ProgRes® MAC CapturePro Version 2.7.6 Jenoptic (Germany), Camera adapter (Projection lens) U-TV0.63X-C, Sensor CCD, Color 2/3".
Рис. 1. Смешанные биопленки (а); фото стекла с биопленки с двумя и более бактериями (б)
Рис. 2. Pseudomonas putida, изолированная из слюны (окраска по Граму)
чено до 10 и больше) пересевы на аналогичные среды. Вместе с тем были выявлены смешанные сообщества, которые не сохранялись более одного пересева, что ограничивало возможность их детального изучения. Чистые бактериальные культуры в использованных нами условиях практически не высевались. Образование на питательных средах большого числа разнообразных смешанных биопленок свидетельствует о существовании тесного взаимодействия между различными неродственными бактериями. Устойчивое воспроизведение смешанных бактериальных биопленок и невозможность получения на использованных средах чистых культур указывают на выраженный мутуализм у бактерий нормальной микрофлоры. В этом типе взаимодействия каждая из бактерий дает другой какие-то факторы, которые получатель не может синтезировать сам. Очевидно, что эти факторы отсутствуют в использованных нами питательных средах. При этом надо учитывать, что такие среды, как бруцелла агар с эритроцитами человека и сывороткой или кровяной агар, являются одними из самых богатых по числу содержащихся органических и неорганических компонентов, необходимых для роста различных неродственных бактерий.
Из части смешанных микробных биопленок были изолированы чистые культуры. Среди них были известные представители нормальной микрофлоры, идентифицированные по морфологическим, тинкториальным и биохимическим (с достоверностью 98-99 %) свойствам. Среди них можно отметить Rotrhia dentocariosa, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Streptococcus gordonii, Micrococcus luteus, Neisseria subflava и др. [2, 9, 10].
Часть бактерий, изолированных из смешанных биопленок в виде чистых культур, которые удалось иден-
тифицировать (с достоверностью 98-99 % по биохимическим тестам), принадлежат к известным родам и видам, но не описаны или мало известны как представители нормальной микрофлоры ротовой полости человека. К таким бактериям следует отнести Aerococcus virinands - грамположительный микроорганизм, способный вызывать заболевания человека и относящийся к возбудителям оппортунистических инфекций [16]; Klebsiella oxytoca - грамотрицательная бактерия, представитель условно-патогенной микрофлоры человека, не является типичным обитателем нормальной микрофлоры ротовой полости человека и известен как возбудитель оппортунистических инфекций [14]; грампо-ложительные стафилококки - Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis ssp hominis, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus lugdunensis и Staphylococcus warneri, которые входят в состав нормальной микрофлоры кожи человека и не считаются представителями микрофлоры ротовой полости, относятся к возбудителям оппортунистических и нозокомиальных инфекций [3, 4, 11, 13, 15, 17]; грамотрицательная Pseudomonas putida (рис. 2), известна как представитель микрофлоры вод и почвы и практически не описана как представитель нормальной микрофлоры человека [6].
Все бактерии, имеющие сходство по биохимической активности меньше 98 %, предположительно, относятся другому виду, а при сходстве в 95 % и меньше -к другому роду. Автоматическая система идентификации биохимической активности бактерий Vitec-2 имеет одну из самих больших баз данных.
Из ротовой полости были также выделены микробы, которые по морфологии были похожи на известные бактерии, но по биохимической активности не могли быть достоверно отнесены к представителям известных родов и видов (Aerococcus viridans - 89 %, Streptococcus epidermidis - 89 %, Staphylococcus aureus 84 - 8 %, Staphylococcus warneri - 82 %, Staphylococcus lugdunesis - 93 %, Streptococcus mitis/S. oralis - 86 %, Micrococcus luteus - 86 % и некоторые другие). Бактерии, имеющие сходства (86 %) с видом Micrococcus luteus, отличались от известного М. luteus характером роста - свойствами колоний и размером и формой клеток (рис. 3).
Некоторые из изолированных в чистом виде бактерий не были по биохимической активности отнесены к известным бактериям и классифицированы системой Vitec 2 как «Unidentified organism».
Таким образом, в ходе исследования были изолированы бактерии по части признаков (типу колоний, морфологии клеток или уровню идентификации биохимической активности), которые не могли быть точно идентифицированы и отнесены к известным видам бактерий, обитающим в ротовой полости человека. Эти данные указывают, что использованные методические подходы позволили изолировать неизвестные бактерии, условно отнесенные в «некультивируемым».
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
В результате проведенных исследований удалось получить принципиально новые данные о нормальной микрофлоре ротовой полости. Установлено, что первоначально практически все бактерии слюны людей вырастают на питательных средах в виде смешанных биопленок. Смешанные микробные биопленки, дающие исходный рост в использованных условиях, включали от 2-х до 7-ми разных неродственных грамотри-цательных и грамположительных аэробных бактерий.
Подавляющее большинство микробов, образующих эти смешанные биопленки, не давали изолированного, независимого роста. Вместе с тем некоторые бактерии удалось получить в виде чистых культур и идентифицировать их биохимическую активность.
Таким образом, полученные данные указывают, что новые подходы в изучении состава нормальной микрофлоры, основанные на культивировании смешанных микробных биопленок, позволяют изолировать малоизвестные и не известные ранее бактерии микробиоты человека.
ЛИТЕРАТУРА
1. Тец, В. В. Бактериальные сообщества / В. В. Тец // Клеточные сообщества. - СПб.: СПбГМУ, 1998. - C. 15-73.
2. Barksdale, L. Identifying Rothia dentocariosa / L. Barksdale // Ann. Int. Med. - 1979. - Vol. 91. - P. 786-788.
3. Campoccia, D. Characterization of 26 Staphylococcus warneri isolates from orthopedic infections / D. Campoccia [et al] // Int. J. Artif. Organs. - 2010. - Vol. 33. - № 9. - P. 575-581.
4. Chesneau, O. Staphylococcuspasteuri sp.nov., isolated from human, animal, and food speciements / O. Chesneau [et al] // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1993. - Vol. 43. - P. 237-244.
5. Collins, M. D. Characterization of a Rothia-like organism from a mouse: description of Rothia nasimurium sp. nov. and reclassification of Stomatococcus mucilaginosus as Rothia mucilaginosa comb. nov. / M. D. Collins [et al] // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2000. - Vol. 50. - № 3. - P. 1247-1251.
6. Conti, S. Enterobacteriaceae and pseudomonadaceae on the dorsum of the human tongue / S. Conti [et al] // J. Appl. Oral Sci. - 2009. - Vol. 17. - № 5. - P. 375-380.
7. Duncan, M. J. Genomics of oral bacteria / M. J. Duncan // Crit. Rev. Oral. Biol. Med. - 2003. - Vol. 14. - № 3. - P. 175-187.
8. Epstein, S. S. General Model of Microbial Uncultivability, in Uncultivated Microorganisms / Ed. S.S. Epstein // Series: Microbiology Monographs (Series Ed. Alexander Steinbuchel). -Heidelberg, 2009. - Vol. 10. - P. 131-150.
9. Fitzsimmons, S. Clonal diversity of Streptococcus mitis bio-var 1 isolates from the oral cavity of human neonates / S. Fitzsimmons [et al] // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 1996. - Vol. 3. - № 5. -P. 517-522.
10. Kaplan, J. B. Biofilm dispersal of Neisseria subflava and other phylogenetically diverse oral bacteria / J. B. Kaplan, D. H. Fine // Appl. Environ. Microbiol. - 2002. - Vol. 68. - № 10. -p. 4943-4950.
11. Kloos, W. E. Isolation and Characterization of Staphylococci from Human Skin. II. Description of four new species: Staphylococcus warneri, S.capitis, S.hominis, S.simulans / W. E. Kloos, K. H. Schleifer // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1975. - Vol. 25. - P. 62-79.
12. Lewis, K. Persisters, biofilms, and the problem of uncultivability / K. Lewis// Discovery. - 2009. - Vol. 2. - P. 181-194.
13. Loberto, J. C. Staphylococcus spp. in the oral cavity and periodontal pockets of chronic periodontitis patients / J. C. Loberto [et al] // Braz. J. Microbiol. - 2004. - Vol. 35. - P. 64-68.
Рис. 3. Характер роста бактерий, похожих на M. Luteus, на кровяном агаре (а); морфология клеток M. Luteus (окраска по Граму)
14. Münard, A. First Report of Septic Arthritis Caused by Klebsiella oxytoca / F. Menard [et al] // J. Clin. Microbiol. - 2010. -Vol. 48. - № 8. - P. 3021-3023.
15. Otto, M. Staphylococcus epidermidis — the «accidental« pathogen / V. Otto // Nat. Rev. Microbiol. - 2009. - Vol. 7. -P. 555-567.
16. Popescu, G. A. An Unusual Bacterium, Aerococcus viridans, and Four Cases of Infective Endocarditis / G. A. Popescu [et al] // J. Heart Valve Dis. -2005. - Vol. 14. - № 3. -P. 317-199.
17. Smith, A. J. The ecology of Staphylococcus species in the oral cavity / A. G. Smith, M. S. Jackson, J. Bagg // J. Med. Microbiol. -2001. - Vol. 50. - P. 940-946.
18. Tetz, V. V. Colony-like communities of bacteria / V. V. Tetz // Microbios. - 1994. - № 80. - P. 63-65.
19. Tetz, V. V. Formation and structure of mixed bacterial communities / V. V. Tetz // APMIS. - 1999. - № 107. - P. 645-654.
20. Tetz, V. V. Molecular biology of bacteria / V. V. Tetz. - N.Y.: Nova Sci. Publ., 1998.
РЕЗЮМЕ
В. В. Тец, М. Ф. Вечерковская, А. А. Доморад, Д. С. Викина, Д В. Михайлова, Е. И. Онищенко, Г. В. Тец, Ю. А. Трофимова, В. В. Харламова
Микробы, не известные как представители нормальной микрофлоры ротовой полости человека
Работа посвящена выделению и идентификации малоизученных и не известных ранее микроорганизмов нормальной микрофлоры ротовой полости. Объектом исследования были смешанные биопленки, образованные аэробными бактериями. Выделены бактерии, которые не идентифицировались и не могли быть отнесены к известным видам, обитающим в ротовой полости. Результаты культивирования смешанных микробных биопленок позволяют изолировать малоизвестные и не известные ранее бактерии микробиоты человека.
Ключевые слова: малоизученные микроорганизмы, нормальная микрофлора, биопленки.
SUMMARY
V. V. Tetz, M. F. Vecherkovskaya, A. A. Domorad,
D. S. Vikina, D. V. Mikhailova, E. I. Оnischenko,
G. V. Tetz, J. A. ^ofimova, V. V. Kharlamova
Unknown bacteria - representatives of the human oral cavity microbiota
The paper presents our study on isolation and identification of unknown and insufficiently explored bacteria of the human oral cavity microbiota. Mixed biofilms formed by aerobic bacteria were investigated. Bacteria that could not be identified as known inhabitants of the oral cavity were isolated. The results of mixed microbial biofilms cultivation let us isolate unknown and insufficiently explored bacteria of the human microbiota.
Key words: insufficiently explored bacteria, normal microbiota, biofilms.
© В. В. Гришин, 2012 г. УДК 616.314-08
В. В. Гришин
МЕТОД ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПОВЕРХНОСТЬЮ ЭМАЛИ ЗУБА
Лаборатория стоматологического материаловедения, научно-практический центр стоматологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова
Основным структурным образованием эмали зуба являются эмалевые призмы диаметром 4-6 мкм. Длина призмы соответствует толщине слоя эмали и даже превышает ее благодаря извилистому направлению. Основу призмы составляют кристаллы гидроксиаппа-тита. В ее состав входят органические вещества в виде субмикроскопической фибриллярной сети (филамен-тов промежуточного типа), углеводы, минеральные вещества. Эмалевые призмы объединяются с помощью менее обызвествленного межпризменного вещества и покрывают коронку зуба в виде эмали. С химической точки зрения, гидроксиапатит имеет одно из самых низких произведений растворимости солей, которое проявляется в щелочной среде.
Структура кристалла гидроксиапатита гексого-нальная и узлы ОН- расположены выше или ниже зеркальной плоскости кристалла. Это смещение превращает зеркальную плоскость в плоскость скольжения, и они становятся доступными для образования гидрат-ных оболочек, оставаясь при этом в составе кристалла. Таким поведением групп можно объяснить гидрофильные свойства очень мало растворимой соли. Каждый кристалл эмали имеет слой гидротированных связанных ионов (ОН~), образующихся на поверхнос-
ти раздела «кристалл - раствор». Благодаря гидрат-ному слою осуществляется ионный обмен, который может протекать по гетероионному механизму обмена, когда ион кристалла замещается другим ионом среды, и по изоионному, когда ион кристалла замещается таким же ионом раствора.
Деминерализация - вымывание из эмали зуба минеральных веществ: апатитов кальция, фосфора, магния, калия, натрия, фтора, хлора и др. Этот процесс заложен природой. Эмаль не «застывшая форма». Как и все участки организма, эмаль имеет способность к обновлению. Поэтому деминерализация в ней происходит постоянно. Но в противовес ей существует ре-минерализация - восстановление минеральных структур зуба. В норме эти процессы сбалансированы, но нередко в таком равновесии происходят сбои и потери берут верх над восстановлением. Для характеристики поверхности эмали зуба можно использовать явление смачивания.
Смачивание - поверхностное явление, наблюдаемое при контакте жидкости с твердым телом в присутствии третьей фазы - газа (пара) или другой жидкости, которая не смешивается с первой (так называемое избирательное смачивание). Характер смачивания определяется, прежде всего, физико-химическими взаимодействиями на поверхности раздела фаз, которые участвуют в смачивании [5].
Основные термодинамические характеристики смачивания - равновесный краевой угол смачивания Q0, работа адгезии Wa, теплота смачивания qW. Равновесный краевой угол смачивания определяется наклоном поверхности жидкости (например, капли) к смоченной ею поверхности твердого тела; вершина угла находится на линии смачивания.
Уравнение Юнга: cos Q 0 = (ss-ssl)/ ssl, где ss и ssl -соответственно поверхностные натяжения твердого тела на границе с газом и в контакте со смачивающей
