Микробные сообщества карстовых пещер как потенциальный источник продуцентов низкотемпературных амилаз Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

resulted the highest yield increase of 11%. Selenium concentration levels were more than 5 mg/kg DW in case of 12-15 kg Se/ha, that may be dangerous for domestic animals. The greatest Se accumulation by wheat grain was demonstrated for soil application of 15 kg Se/ha. The highest gluten content in grain was shown for soil application of 12 kg Se/ha. No clear relationship was found between selenium dose and other quality parameter of grain: hyaline and nature. Optimal dose of selenium application to meadow chernozem soil under spring wheat is proved to be energetically efficient.

Keywords: spring wheat, biofortification, selenium.

Aleksandrovskaya Elena Yuryevna, Postgraduate, Omsk SAU, ph. (3812) 65-46-27; Sindireva Anna Vladimirovna, Dr. Biol. Sci., Assoc. Prof., Omsk SAU, ph. (3812) 65-46-27, e-mail: sindireva72@mail.ru; Golubkina Nadezhda Aleksandrovna, Dr. Agr. Sci., Senior Research Scientist, Agrochemical research centre of VNIISSOK, e-mail: segolubkina@rambler.ru; Chuyanova Galina Ignatyevna, Cand. Agr. Sci., Assoc. Prof., Omsk SAU, ph. (3812) 65-46-27, e-mail: chujanova_omgau@mail.ru; Serebrennikova Alena Aleksandrovna, Undergraduate, Omsk SAU, e-mail: alena_200992@mail.ru.

УДК 663.11:579.6

С.В. Хижняк, В. Т. Пампуха

МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА КАРСТОВЫХ ПЕЩЕР КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ ИСТОЧНИК ПРОДУЦЕНТОВ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНЫХ АМИЛАЗ

Шесть штаммов адаптированных к низкой температуре амилолитических грибов рода Geomyces, выделенных из низкотемпературной карстовой пещеры, были исследованы на скорости роста при различных температурах, а для двух из них было также изучено влияние температуры на амилолитическую активность культу-ральной жидкости (КЖ). Было установлено, что влияние температуры на скорости роста штаммов хорошо описывается уравнением Ratkowsky et al. (1983) с коэффициентами детерминации R2 0,987-0,999, а влияние температуры на амилолитическую активность КЖ в диапазоне 31-50°С хорошо описывается логистической функцией (R2 = 0,994 и 0,997). Все штаммы не способны расти при температуре 30°С и выше. Пять штаммов являются психротолерантными с оптимальными температурами роста в диапазоне от 21,50 до 25,25°С, один штамм является психрофильным с оптимальной температурой роста 18,50°C. Сравнение влияния температуры на амилоли-тическую активность КЖ показало, что температура, соответствующая середине сигмоиды, для психрофильно-го штамма лежит на 7°С ниже, чем для психротолерантного, что практически равно разности оптимальных температур роста у данных штаммов (6°С). Наклон логарифмической прямой на экспоненциальном участке температурной кривой амилолитической активности КЖ у психрофильного штамма в 2 раза выше, чем у псих-ротолерантного. Полученные результаты показывают, что снижение оптимальной температуры роста в процессе адаптации к условиям пещеры приводит к соответствующему уменьшению температурного оптимума ами-лолитических ферментов и демонстрирует перспективность поисков продуцентов низкотемпературных амилаз в пещерных сообществах.

Ключевые слова: низкотемпературная амилаза, продуценты, карстовые пещеры, мицелиальные грибы, психрофилы.

Введение

Амилазы микробного происхождения являются одними из наиболее востребованных ферментов, применяемых в сельском хозяйстве, пищевой и перерабатывающей промышленности, и в настоящее время занимают примерно 25% мирового рынка ферментов. Амилазы используют для конверсии крахмала в олигосахариды и глюкозу в крахмало-паточном и бродильном производствах, для отбеливания растительного сырья в текстильном и бумажном производствах, в качестве биодобавок к моющим средствам [1]. Кроме этого, микробные амилазы все шире применяются для повышения усвояемости крахмалсодержащих растительных кормов в животноводстве и птицеводстве [2; 3]. До недавнего времени в промышленности и сельском хозяйстве применялись почти исключительно термофильные амилазы c температурными оптимумами 70-90°C, однако в последние годы в мире наблюдается стремительно растущий интерес к средне- и низкотемпературным амилазам с оптимумом от 50-60°C и ниже [4; 5]. Поиск продуцентов подобных амилаз ведется среди психрофильных и психротолерантных микроорганизмов, адаптированных к низкотемпературным местообита-

© Хижняк С.В., Пампуха В.Т., 2016

ниям, таким как Арктика, Антарктика и высокогорье. Однако на нашей планете существует еще один природный источник подобных микроорганизмов - карстовые пещеры умеренной климатической зоны, характеризующиеся стабильной низкой температурой (около 4°C вне зависимости от сезона). В подобных пещерах присутствует достаточно богатая в таксономическом плане гетеротрофная микрофлора, представленная бактериями и грибами, находящимися на разных стадиях эволюционной адаптации к пониженной температуре подземных местообитаний [6; 7]. При этом пещеры в силу своей высокой распространенности являются существенно более доступными объектами для поиска психрофильных и психротолерантных штаммов, чем районы Арктики, Антарктики и высокогорья. Данная работа посвящена оценке перспектив поиска продуцентов низкотемпературных амилаз в микробных сообществах карстовых пещер умеренной зоны.

Объекты и методы

Объектом исследования служили образцы грунта, собранные в известняковой карстовой пещере «Караульная-2» (Красноярский край, Емельяновский район). Протяженность пещеры 540 м, глубина 34 м, температура грунта от 2,8 до 4,0°С в зависимости от удаленности от входа, относительная влажность воздуха около 95%.

Выделение амилолитических изолятов проводили методом рассева из суспензий грунта на среде следующего состава (г/л): крахмал - 10,0; NH4NO3 - 2,0; KH2PO4 - 1,0; MgSO4 • 7H2O - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4 - следовые количества; агар микробиологический -20,0; рН = 6,5-7,0. Температура инкубации составляла 8°C. Для дальнейшей работы отбирали изоляты с максимальной зоной гидролиза крахмала, определяемой после окраски раствором Люголя (рис. 1).

Рис. 1. Выделение амилолитических изолятов на среде Чапека с крахмалом (окраска раствором Люголя)

Для проверки влияния температуры на активность продуцируемых изолятами амилаз изоляты выращивали на жидкой среде того же состава поверхностным способом в течение 7 суток, температура культивирования составляла 15-17°С. Амилолитическую активность при разных температурах определяли в трехкратной повторности по времени полного обесцвечивания окрашенного йодом 0,1%-ного раствора крахмала после добавления культураль-ной жидкости в соотношении 1:1 при температуре в диапазоне 21-50°С. Стабильность температуры во время реакции обеспечивали с помощью водяной бани. Скорость гидролиза крахмала выражали величиной, обратной времени обесцвечивания, для описания зависимости скорости гидролиза от температуры в изучаемом диапазоне температур использовали логистическую функцию

r =

L

1 + е

-k (T-To)

где r - скорость гидролиза крахмала; T - температура; L, k и T0 - коэффициенты.

Влияние температуры на скорость роста штаммов изучали путем высева конидий на ПД-агар (пептон ферментативный - 9,0 г/л; гидролизат казеина ферментативный - 8,0 г/л; дрожжевой экстракт - 3,0 г/л; NaCl - 5,0 г/л; Na2HPO4 - 2,0 г/л; агар- 20,0 г/л; pH = 7,07,2) с последующим параллельным культивированием при температурах 9, 15, 21, 27, 30°C. Скорость роста при каждой температуре (мкм в час) определяли по изменению средней длины проростковой гифы за интервал времени. Первое измерение проводили после прорастания конидий, второе - через 12 ч для температуры 9°C и через 7-9 ч для остальных температур. Измерение проводили по микрофотографиям с использованием бесплатной программы ImageJ, в каждом случае измеряли по 15-30 гиф. Масштабный коэффициент для пересчета результатов измерений в микрометры определяли с помощью объект-микрометра проходящего света ОМП ГОСТ 7513-55 производства ОАО «ЛОМО». В качестве теоретической модели зависимости скорости роста от температуры использовали модель Ratkowsky et al. [8]:

И = ( b • (T - Tmin ) • (1 - e c (T -Tmax ) )) 2

?

где /л - скорость роста; T - температура; Tmax и Tmin - соответственно максимальная и минимальная температуры роста; b и c - коэффициенты.

Коэффициенты в моделях определяли по экспериментальным данным методом наименьших квадратов с использованием пакета Stat Soft STATISTICA 6.0, модуль «Нелинейная оценка/Пользовательская регрессия». Микроскопические исследования проводили с помощью микроскопа «Микмед 6», вар. 3, оснащенного цифровой камерой DCM-130E.

Результаты исследований В результате было выделено 6 изолятов микромицетов, сочетавших высокую скорость роста при низкой температуре с большой зоной гидролиза крахмала. Все изоляты относятся к р. Geomyces и имеют верхний температурный предел роста в районе 30°C (рис. 2).

Рис. 2. Влияние температуры на прорастание конидий выделенных изолятов. Слева - прорастание через 18 ч инкубации при 21°С, справа - отсутствие прорастания через 18 ч инкубации при 30°С

Анализ температурных кривых роста показал, что среди выделенных изолятов преобладают психротолерантные формы с температурным оптимумом в диапазоне 21-25°С, один изолят оказался психрофильным с температурным оптимумом 18,5°С. Экспериментальные данные хорошо согласуются с моделью Ratkowsky et а1. (рис. 3, таблица).

Штамм 3

Температура, °С

-теоретические значения о усреднённые экспериментальные значения

Штамм 2

Температура, °С

-теоретические значения о усреднённые экспериментальные значения

Рис. 3. Влияние температуры на скорость роста психрофильного (штамм 3) и психротолерантного (штамм 2)

амилолитических изолятов

Теоретические температурные оптимумы выделенных изолятов

Изолят Оптимальная температура согласно модели, °С Скорость роста при оптимальной температуре, мкм в час Соответствие модели Ratkowsky е! а1., R2

Штамм 1 +21,50 14,58 0,999

Штамм 2 +24,50 5,98 0,997

Штамм 3 +18,50 4,22 0,987

Штамм 4 +25,25 8,07 0,998

Штамм 6 +22,75 16,66 0,997

Штамм Г-1 +22,75 17,51 0,999

Для количественной оценки влияния температуры на активность продуцируемых пещерными изолятами амилаз были выбраны психрофильный (штамм 3) и психротолерантный (штамм 2) изоляты. Было установлено, что в диапазоне температур 31-50°С кривая «температура - скорость» имеет вид сигмоиды (рис. 4), что позволяет сравнить температурные характеристики амилаз психрофильного и психротолерантного изолятов по углу наклона логарифмической прямой на экспоненциальном участке графика.

го ц

го

X го

ГО

со ^

О ^

о

о ^

о

о

2 1,8 1,6 1,4 1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

□

30

R2 = 0,9974

35

40 45

Температура, °С

50

55

■ теоретические значения

□ экспериментальные значения

Рис. 4. Влияние температуры на скорость (мин 1) гидролиза крахмала культуральной жидкостью

на примере психрофильного штамма 3

Результаты сравнения представлены на рис. 5. Как видно, угол наклона логарифмической прямой для психрофильного изолята в области низких температур в 2 раза больше, чем для психротолерантного. При этом параметр Т0 (температура, при которой скорость ферментативной реакции равна половине максимальной) сигмоиды у психрофильного изолята на 7°С меньше, чем у психротолерантного (42,5 против 49,5), что почти точно соответствует разности температурных оптимумов этих изолятов (6°С).

Рис. 5. Влияние температуры на скорость гидролиза крахмала культуральной жидкостью психрофильного (штамм 3) и психротолерантного (штамм 2) изолятов на экспоненциальных участках температурной кривой (в логарифмических координатах)

Заключение

Несмотря на то, что по международной классификации характер температурных кривых амилолитической активности культуральной жидкости изученных штаммов соответствует скорее мезофильным (с полумаксимумом в районе 40-50°С), а не психрофильным ферментам, полученные результаты показывают, что снижение оптимальной температуры роста в процессе адаптации микроорганизмов к низкотемпературным условиям пещеры приводит к соответствующему уменьшению температурного оптимума их амилаз. При этом следует учитывать, что наиболее изученный на сегодняшний момент психротолерантный представитель р. Geomyces, G. раппогит, продуцирует как низкотемпературную амилазу с оптимумом в районе 40°С [9], так и высокотемпературную с оптимумом в районе 70°С [10]. Можно предположить, что наблюдаемые в исследовании температурные кривые амилолитической активности сдвинутся в существенно более низкотемпературную область после выделения «низкотемпературной фракции» амилаз. Тем не менее, даже неочищенная культуральная жидкость исследованных штаммов по своим характеристикам подпадает под определение «низкотемпературная амилаза», используемое русскоязычными производителями в отношении таких ферментных продуктов, как АмилоЛюкс-А (диапазон рабочих температур 50-65°С). Таким образом, можно констатировать, что микробные сообщества карстовых пещер могут рассматриваться как природный источник продуцентов низкотемпературных амилаз. Направления дальнейших исследований могут быть связаны как с изучением температурных характеристик очищенных ферментов, так и с вовлечением в исследования более широкого круга пещерных микроорганизмов. По данным исследований, только в пещерах Красноярского края присутствуют психрофильные и психротолерантные представители не менее чем 16 родов микромицетов и не менее чем 10 родов бактерий.

Список литературы

1. De Souza, P.M. Application of microbial a-amylase in industry - A review / P.M. De Souza, P. Oliveira Magalhäes // Brazilian Journal of Microbiology. - 2010. - № 4. - P. 850-861.

2. Смаглюк, М. Амилаза увеличит привесы поросят / М. Смаглюк, Х.И. Фернандез // Животноводство России. - 2013. - № 11. - С. 66-67.

3. Сванн, Д. Оптимальное решение для современных рационов птицы / Д. Сванн // Птицеводство. - 2015. -№ 6. - С. 33-37.

4. Kuddus, M. An overview of cold-active microbial a-amylase: Adaptation strategies and biotechnological potentials / M. Kuddus, J.M. Arif Roohi, P.W. Ramteke // Biotechnology. - 2011. - № 10. - P. 246-258.

5. Sarmiento, F. Cold and Hot Extremozymes: Industrial Relevance and Current Trends / F. Sarmiento, R. Peralta, J.M. Blamey // Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. - 2015. - № 3 (148). - P. 1-15.

6. Психрофильные и психротолерантные гетеротрофные микроорганизмы карстовых полостей Средней Сибири / С.В. Хижняк, И.В. Таушева, А.А. Березикова, Е.В. Нестеренко, Д.Ю. Рогозин // Экология. - 2003. -№ 4. - С. 261-266.

7. Хижняк, С.В. Микромицеты карстовых пещер Средней Сибири : монография / С.В. Хижняк, Е.В. Нестеренко, И.Р. Сафина ; Красноярский гос. аграр. ун-т. - Красноярск : Изд-во КрасГАУ, 2014. - 175 с.

8. Model for bacterial culture growth rate throughout the entire biokinetic temperature range / D.A. Ratkowsky, R.K. Lowry, T.A. McMeekin, A.N. Stokes, R.E. Chandler // J. Bacteriol. - 1983. - № 154. - P. 1222-1226.

9. Development of a novel Aspergillus uracil deficient expression system and its application in expressing a cold-adapted a-amylase gene from Antarctic fungi Geomyces pannorum / Y. Mao, Y.Yin, L. Zhang, S.A. Alias, B. Gao, D. Wei // Process Biochemistry. - 2015. - № 50 (10). - P. 1581-1590.

10. A novel saccharifying a-amylase of Antarctic psychrotolerant fungi Geomyces pannorum: Gene cloning, functional expression, and characterization / B. Gao, Y. Mao, L. Zhang, L. He, D. Wei // Starch - Stärke. - 2015. -№ 67. - P. 1-9.

Хижняк Сергей Витальевич, доктор биол. наук, профессор, Красноярский ГАУ, тел. (391) 227-36-09, е-mail: skhizhnyak@yandex.ru; Пампуха Владимир Тарасович, учащийся, Муниципальное автономное общеобразовательное учреждение «Лицей № 11», Красноярск.

SUMMARY

S. V. Khizhnyak, V. T. Pampuha

Microbial communities of karst caves as a potential source of low-temperature amylase producers

Six strains of cold-adapted amylolytic fungi of the genus Geomyces isolated from low-temperature karst cave were examined for their growth rates at different temperatures, and for two of them the effect of temperature on amylolytic activity of cultural liquid (CL) was studied. It was found that effect of temperature on growth rates is well described by Ratkowsky et al. (1983) equation with the coefficients of determination R2 0.987-0.999, and effect of temperature on amylolytic activity at 31-50°C is well described by the logistic function (R2 = 0.994 and 0.997). All the strains are unable to grow at temperature 30°C and higher. Five strains are psychrotolerant with the optimal growth temperatures in the range from 21.50 to 25.25°C and one strain is psychrophilic with the optimal growth temperature 18.50°C. Comparison of temperature effect on the amylolytic activity of CL showed that the temperature value of the sigmoid's midpoint for the psychrophilic strain is 7°C lower then that of the psychrotolerant strain, what is almost equal to the difference in the optimal growth temperatures of these strains (6°C). The slope of log-lin plot of amylolytic activity of CL of the psychrophilic strain in the exponential area of the temperature curve is 2 times higher than that of the psychrotolerant strain. These results shows that decrease of optimal growth temperature in the process of adaptation to cave environment leads to the corresponding decrease of the temperature optimum of amylolytic enzymes and demonstrates perspectiveness of search for low-temperature amylase producers in cave communities.

Keywords: low-temperature amylase, producers, karst caves, filamentous fungi, psychrophiles.

Khizhnyak Sergey Vitalevich, Dr. Biol. Sci., Prof., Krasnoyarsk SAU, ph. (391) 227-36-09, e-mail: skhizhnyak@yandex.ru; Pampuha Vladimir Tarasovich, Schoolboy, Municipal Autonomous Educational Institution "Lyceum № 11" Krasnoyarsk.