CC BY
110
УДК 632.95+543.544.2
Г.А. Козлова, Е.В. Пименова, А.В. Кожева*
Пермский государственный технический университет,
*Пермская государственная сельскохозяйственная академия
МИКРОБНАЯ ДЕГРАДАЦИЯ ГЕРБИЦИДА «ТРЕЗОР» НА ОСНОВЕ 2,4-ДИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ
Исследована способность ряда штаммов бактерий к биодеструкции гербицида на основе 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. Проведена оценка возможности обнаружения остаточных количеств пестицида в культуральной жидкости методом высокоэффективной жидкостной храмотографии.
В настоящее время существует реальная проблема накопления остаточных количеств пестицидов в окружающей среде. Они могут накапливаться в воде, донных отложениях, почве, мигрировать по цепям питания, концентрируясь в живых организмах.
Один из самых известных и широко используемых в последние 50 лет антиауксинов (гербицидов) - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) [1]. 2,4-Д обладает свойством регулировать рост растений, используется как гербицид для борьбы с сорняками некоторых зерновых культур, относится ко второму классу опасности. Персистентность вещества в почве и донных отложениях зависит от сложного комплекса условий и колеблется от нескольких дней до нескольких лет. 2,4-Д - среднетоксичное соединение, однако токсичность промышленных препаратов значительно повышается за счет возможного присутствия в их составе примесей диоксинов. В настоящее время применяются технологии, исключающие образование этих суперэкотоксикантов.
Микроорганизмы играют основную роль в разложении 2,4-Д при условии, что вещество гомогенно распределено в жидкой фазе почвы, не связано с ее органо-минеральными коллоидами и не оказывает влияния на активную почвенную микрофлору [2].
Деградация 2,4-Д может осуществляться многими микроорганизмами: бактериями рода Rhizobium, Corinebacterium, Agrobacterium, Arthobacter, Achromobacter, Flavobacterium, Pseudomonas, а также акти-
номицетами и грибами: Nocardia, Penicillium, Aspergillus. Кроме того, обнаружены некоторые штаммы бактерий, содержащих специфические по 2,4-Д плазмиды, передающиеся от одной клетки к другой и тем самым переносящие генетическую способность бактерий разлагать 2,4-Д [3, 4].
Процесс разложения 2,4-Д микроорганизмами происходит различными путями. Из продуктов разложения, сохранивших бензольное кольцо, выделены 2,4-дихлорфенол, 3,5-дихлорпирокатехин, 3-хлорпи-рокатехин, 4-хлорпирокатехин.
По оценке различных авторов, на 50-70 % процессы деградации осуществляются под действием микроорганизмов. В то же время частота встречаемости отдельных штаммов-деструкторов в почве невелика. Замечено, что многократное применение пестицидов приводит к изменению микробного ценоза почвы в сторону возрастания в ней относительной доли микроорганизмов, способных разлагать эти ксенобиотики.
При обнаружении значительного загрязнения почвы 2,4-Д необходимо вмешательство человека в процессы естественного самоочищения почв. Детоксикацию почв, загрязненных гербицидами, проводят с помощью адсорбционных и микробиологических способов очистки. Микробиологический способ предусматривает применение микробных препаратов для детоксикации повышенных концентраций гербицидов на ограниченной площади: на очистных сооружениях, в пунктах хранения и т. п.
Для определения 2,4-Д в воде органами Ростехнадзора используется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Данный метод является очень производительным, не требует экстракции пестицидов органическими растворителями при анализе воды и других водосодержащих объектов. Метод избирателен в присутствии глобальных загрязнителей окружающей среды - производных циклопарафинов (ГХЦГ и его изомеры), соединений дифенилметанового ряда (ДДТ и его производные), а также галакона, глифосата и других гербицидов, применяемых на зерновых культурах [5].
Целью наших исследований было изучение способности некоторых штаммов микроорганизмов утилизировать остаточные количества ряда комплексных гербицидов на основе 2,4-Д и оценка возможности определения действующего вещества (д. в.) гербицида в культуральной жидкости методом ВЭЖХ для контроля за протекающими процессами.
Был проведен скрининг 12 штаммов почвенных микроорганизмов из лабораторной коллекции после их длительного хранения под слоем вазелинового масла. Штаммы были выделены из почвенных образцов, отобранных с полей учхоза «Липовая гора», подвергавшихся обработке гербицидами на основе 2,4-Д [6].
Способность различных культур бактерий к росту на среде с исследуемым субстратом изучали на синтетической минеральной среде следующего состава (г/л): (КН4)2804 - 1,0; №С1 - 1,0; М§Б04 - 0,2; Ка2С03 - 0,2; Ш2НР04 - 0,16; КН2Р04- 0,04, раствор микроэлементов по Хогланду - 1 мл, рН 7,2-7,4, следовые количества дрожжевого экстракта.
В среду в качестве единственного источника углерода добавляли исследуемый пестицид «Трезор» (использовали коммерческий препарат Тгсбог 60 WP) с концентрацией 0,1 % по д. в.
Инокулят выращивали на аналогичной среде при температуре 30 °С, без аэрации. Засев проводили в пробирки в соотношении иноку -лята и среды 1:20. Культивирование осуществляли в термостате в аналогичных условиях.
О росте культуры судили по косвенному показателю численности бактерий - оптической плотности культуральной жидкости. Жизнеспособность клеток определяли методом посева петлей на плотную синтетическую среду с гербицидом. Учет численности бактерий проводили методом 10-кратных разведений с последующим высевом на мясопептонный агар. Все методы, используемые в экспериментальных исследованиях, описаны в работе [7]. Результаты первичного отбора штаммов представлены в табл. 1.
Таблица 1
Оптическая плотность (ОП) культуральной жидкости через сутки роста различных культур
Культура ОП Культура ОП
1 0,051 7 0,180
2 0,120 8 0,140
3 0,200 9 0,300
4 0,030 10 0,100
5 0,020 11 0,160
6 0,010 12 0,150
Можо видеть, что наиболее активный рост суточных культур через сутки роста отмечен у штаммов № 3, 7, 9, 11.
Параллельно проводили проверку жизнеспособности клеток высевом петлей на чашки Петри и культивировали при тех же условиях на среде с «Трезором» (табл. 2).
Таблица 2
Рост бактерий на плотной синтетической среде с пестицидом «Трезор»
Культура Время культивирования, ч Культура Время культивирования, ч
18 42 66 90 18 42 66 90
1 - ++ ++ ++ 7 ++ ++ ++ ++
2 - - - - 8 - + + +
3 ++ ++ ++ ++ 9 + ++ ++ ++
4 ++ ++ ++ ++ 10 - - - -
5 + + + + 11 + + + +
6 + + + + 12 - - - -
Примечание: ++ хороший рост, + слабый рост, - нет роста.
Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что большинство штаммов сохранило жизнеспособность после длительного хранения, в то же время штаммы № 2, 10 и 12 не проявили способность к росту.
После суммирования данных по величине оптической плотности и способности к росту для дальнейших исследований были выбраны 3 штамма почвенных микроорганизмов: № 3, 7 и 8.
Для оценки способности микроорганизмов использовать 2,4-Д был проведен анализ культуральной жидкости. Культивирование осуществляли в при тех же условиях в термостате при 30 °С и атмосферном давлении в течение 7 сут. Пробы культуральной жидкости отбирали через определенное время, фильтровали через мембранный фильтр, центрифугировали в течение 15 мин при 5000 об/мин.
Анализ проводили на жидкостном хроматографе «Милихром 5». Первоначально была показана возможность применения для проведения анализа пестицида в водных растворах колонки «Диасорб-130 С16» вместо предложенной в стандартной методике колонки с неподвижной фазой «Силасорб С18», для чего провели определение 2,4-Д в стандартном растворе с концентрацией 0,1 мг/мл (чистота кислоты 99,8 %). Ус-
ловия хроматографирования: подвижная фаза вода:метанол (7:3), скорость элюирующего потока 200 мкл/мин, объем удерживания 235 мкл. Детектирование проводилось при длине волны 280 нм. Количественное определение в анализируемых пробах проводили методом внешнего стандарта и методом абсолютной калибровки. Время удерживания пика 2,4-Д составило 1,503 мин.
Анализ культуральной жидкости проводили по описанной выше методике, объем пробы 10 мкл.
Динамика биодеструкции пестицида по остаточному количеству действующего вещества различными штаммами приведена в табл. 3.
Через 6 ч роста культур во всех пробах наблюдалось присутствие узкого пика 2,4-Д, причем площади всех пиков уменьшились. Наиболее интенсивный рост наблюдался у штамма № 3.
Таблица 3
Остаточные количества 2,4-Д в культуральной жидкости, мкг/10 мкл
Время, ч Номер штамма
3 8 7
0 4,75 4,87 4,84
6 4,39 4,78 4,82
Начиная с анализов проб, отобранных через 12 ч, площади данных пиков начали увеличиваться. При детальном рассмотрении хроматограмм было отмечено, что на пик 2,4-Д накладывается пик-наездник, соответствующий другому веществу. В исследуемых условиях разделение данных пиков полностью не было достигнуто из-за близкого времени удерживания, поэтому они считаются программой за один широкий пик с большим основанием, поэтому площадь пика возрастает и даже превышает исходную. Изменение соответствующих параметров обработки пиков при расчетах параметров хроматограммы позволяет доказать наличие пиков двух веществ.
Время выхода у нового вещества (1,584 мин) больше, чем у 2,4-Д (1,503 мин), что позволяет предположить наличие в нем большего количества полярных групп. Исходя из литературных данных о составе продуктов деструкции 2,4-Д это вещество может относиться к классу фенолов.
Таким образом, данная методика может применяться для определения остаточных количеств гербицида в культуральной жидкости
микроорганизмов при тщательном подборе элюента, с использованием которого можно добиться разделения пика 2,4-Д и продукта ее разложения.
Анализ хроматограмм показал, что все исследуемые штаммы микроорганизмов в течение 7 сут используют 2,4-Д в качестве источника углерода, причем в течение первых 6 ч роста они только поглощают 2,4-Д. Образовавшиеся метаболиты затем выделяются в культуральную жидкость. Для штамма № 7 через 168 ч в культуральной жидкости не было обнаружено пиков 2,4-Д и ее метаболитов. Это свидетельствует о том, что из трех исследованных штаммов штамм №7 лучше всего разрушает 2,4-Д.
Список литературы
1. Сафаров М.Г. Гербициды: 2,4-Д // Сорос. образ. журн. 2001. № 9. С. 5-62.
2. Галиулин Р.В. Методологические особенности оценки персистентности пестицидов в почве // Химизация сельского хозяйства. 1992. № 2. С. 88-93.
3. 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота: Программа ООН по окружающей среде, международной организации труда и ВОЗ. М.: Медицина, 1987. 132 с.
4. Чкаников Д.И. Поведение 2,4-Д и других хлорфеноксикислот в почве // Агрохимия. 1983. № 12. С. 111-121.
5. Методические указания по определению 2,4-Д в воде методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии // Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде / ЦНТИПР. М., 1994. Сб. № 21. Ч. 1. С. 253-258.
6. Изоляция и характеристика почвенных бактерий утилизирующих гербициды / О.В. Пустовалова, Г.А. Козлова, Н.С. Чурилова, Ю.Г. Максимова // Проблемы загрязнения окружающей среды: материалы V Междунар. конф., Волгоград-Пермь, 18-25 сен. 2001 г. / ИЭГМ УрО РАН. Пермь, 2001. С. 41.
7. Егоров Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: практ. пособие. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1983. 215 с.
Получено 17.06.2009
