CC BY
47
Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика коагулазонегативных стафилококков, выделенных у новорождённых отделения реанимации и интенсивной терапии
Л. А. ЛЮБАСОВСКАЯ', М. А. КОРНИЕНКО2, Т. В. ПРИПУТНЕВИЧ', Е. Н. ИЛЬИНА2, А. И. ЩЕГОЛЕВ'
1 ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В. И. Кулакова Минздрава РФ, Москва
2 ФГБУНИИ физико-химической медицины ФМБА, Москва
Microbiological and Molecular Genetic Characteristics of Coagulase-Negative Staphylococcal Isolates from Neonates in Intensive Care Unit
L. A. LUBASOVSKAYA, M. A. KORNIENKO, T. V. PRIPUTNEVICH, E. N. ILYINA, A. I. SHCHEGOLEV
V. I. Kulakov Scientific Centre of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Moscow Research Institute of Physico-Chemical Medicine, Moscow
В отделениях реанимации новорождённых всего мира проблема госпитальных инфекций, вызываемых коагулазонегатив-ными стафилококками (CoNS), стоит на первом месте в течении последних 20 лет. Новорождённые с очень низкой и экстремально низкой массой тела при рождении являются особой группой риска по CoNS-инфекциям. Однако в России CoNS до сих пор часто воспринимают как контаминанты, а не как главные этиологические агенты пневмонии и сепсиса у глубоконедоношенных новорождённых. В данной работе показано, что в ОРИТ постоянно циркулируют госпитальные штаммы CoNS, способные вызывать фатальные инфекции у глубоконедоношенных новорождённых.
Ключевые слова: ОРИТ новорождённых, инфекции, коагулазонегативные стафилококки, факторы патогенности, кло-нальность.
The problem of hospital-acquired infections due to coagulase-negative staphylococci (CoNS) in neonatal intensive care units is crucial over the last 20 years in the world. Neonates with very low or extremely low body weight belong to a special group of risks by the CoNS infection. However, in Russia CoNS up to now are frequently considered as contaminants and not as the main etio-logic factors of pneumonia and sepsis in extremely premature infants. It was shown that hospital strains of CoNS causing fatal infections in extremely premature infants are always present in intensive care units.
Key words: neonatal intensive care units, infections, coagulase-nagative staphylococci, pathogenicity factors, clonality.
С середины 80-х годов, коагулазонегативные стафилококки (Со№) стали рассматриваться как группа этиологических агентов госпитальных инфекций в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) новорождённых. Однако их видовой состав, антибиотикорезистентность, генетические и фенотипические характеристики до сих пор недостаточно изучены.
Поскольку глубоконедоношенные дети чаще подвергаются воздействию инвазивных процедур (интубация трахеи, катетеризация центральных вен, инфузия липидных растворов), вероятность заразиться внутрибольничной инфекцией у них
© Коллектив авторов, 2013
Адрес для корреспонденции: 117513 Москва, ул. Академика Опарина, 4. МЦ АГ и П им. В. И. Кулакова
больше, чем у доношенных детей [1, 2]. Основными нозологическими формами СоЖ9-инфекций, как правило, являются пневмония и катетер-ас-социированный сепсис [1, 2], а по данным некоторых исследователей, менингит, причем иногда без клеточных или химических изменений в спинно-мозговой жидкости [3]. В единичных публикациях описаны случаи некротизирующего энтероколита [4], остеомиелита [29] и септического артрита, вызванного СоЫБ у новорождённых с очень низкой и экстремально низкой массой тела (ОНМТ и ЭНМТ) при отсутствии центрального венозного катетера (ЦВК) [5].
Абсолютное большинство госпитальных СоЫБ представлены метициллинорезистентными штаммами (ЫКСоЫБ), обладающими дополнительным пенициллинсвязывающим белком, ко-
даруемым геном mecA, поэтому при лечении инфекций, вызванных MRCoNS, препаратом выбора чаще всего служит ванкомицин. Этот препарат являлся основным в терапии CoNS-инфекций в ОРИТ новорождённых, хотя в публикациях последних лет имеется много сообщений о том, что использование ванкомицина у пациентов с инфекциями, вызванными штаммами стафилококков с МПК между 1 и 2 мг/мл следует проводить с осторожностью, поскольку отсутствует его клиническая эффективность [6].
Патогенность как коагулазоположительных, так и коагулазоотрицательных стафилококков во многом обусловлена наличием широкого спектра различных факторов вирулентности, в том числе и продукция различных токсинов [7]. Основными токсинами стафилококков являются различные гемолизины, лейкоцидины, большой спектр энтеротоксинов, относящихся к нескольким серологическим типам A-E, G, H, I, J, K-R, токсин синдрома токсического шока, эксфолиативные токсины A и B и др. [8]. CoNS по сравнению с S.aureus обладают значительно меньшим разнообразием токсинов [9] и из наиболее часто встречаемых у них являются некоторые энтеротокси-ны и токсин токсического шока [10, 11].
Способность к образованию биоплёнок является фактором, способствующим колонизации CoNS на поверхности синтетических имплантов — центральных венозных катетеров, интубационных трубок и т. д. Их формирование связано с поверхностными белками и межклеточными полисаха-ридными адгезинами (PIA). Помимо PIA, к факторам адгезии стафилококка относят клампинг фактор, кодируемый генами clfA и clfB, коллаген-связывающий белок (ген cna), а также фибронек-тинсвязывающий белок (гены fnbA; fnbB) [12—16].
Синтез PIA регулируется ica опероном, в который входят следующие гены icaA, icaB, icaC, icaD. Функция белка, кодируемого геном icaB, заключается в деацетилировании поли-М-ацетилг-люкозамина. Деацетилирование PIA требуется для его прикрепления к поверхности клетки и формирования биоплёнок [17]. Присутствие этих генов является прогностическим признаком образования биоплёнок у CoNS, что и может объяснить причину катетер-ассоциированных CoNS-сепсисов.
Способность к образованию биоплёнок и ме-тициллинорезистентность, дают CoNS преимущество в борьбе за право населять особую экологическую нишу — госпитальную среду, вызывая инфекции у иммунокомпрометированного контингента больных, в частности у глубоконедоношенных новорождённых или новорождённых с тяжёлой неинфекционной патологией.
Таким образом, подробное изучение микробиологических и молекулярно-генетических
свойств коагулазонегативных стафилококков является важной и своевременной задачей. Определение частоты выделения отдельных видов CoNS у новорождённых, находящихся на выхаживании в ОРИТ, наличие или отсутствие у них основных факторов патогенности — маркёров антибиотикорезистентности (метициллинорези-стентность и чувствительность в ванкомицину), а также выявление их принадлежности к определённым клональным группам явилось целью данного исследования.
Материал и методы
Бактериальные изоляты. При микробиологическом посеве клинического материала, полученного от новорождённых (кал, соскоб из зева, отделяемое трахеи, пупочной ранки, конъюнктивы, повреждения кожи, кровь, моча, ликвор, асци-тическая и плевральная жидкость, аутопсийный материал) выделяли чистые культуры коагулазонегативных стафилококков, путём пересева их на питательную среду — 5% кровяной агар. Видовую идентификацию выделенных изолятов CoNS осуществляли через 24 часа по биохимическим свойствам с помощью автоматического бактериологического анализатора Vitek2Compact (BioMerieux, США) и методом масс-спектро-метрического анализа с помощью масс-спектрометра AutoflexIII MALDI-TOF-MS (Bruker Daltonics, Германия) с программным обеспечением Biotyper (Bruker Daltonics, www.bdal.com).
Фенотипическая характеристика. Чувствительность к антибиотикам, (ампициллину, оксациллину, ванкомицину, линезо-лиду, гентамицину, линкомицину (клиндамицину), эритромицину, ципрофлоксацину, хлорамфениколу, тетрациклину) выделенных изолятов CoNS, определяли диско-диффузионным методом на агаре Мюллера-Хинтон (HiMedia) с использования стандартизованных дисков (BioRad Inc.) или путём определением минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотика на автоматическом анализаторе Vitek2Compact (BioMerieux, США). При интерпретации результатов тестирования руководствовались критериями CLSI [18].
Генетическая характеристика. Расширенная генетическая характеристика 70 клинических изолятов CoNS, выделенных от 28 новорождённых, включала:
— определение наличия гена mecA для подтверждения устойчивости к метициллину (оксациллину);
— тестирование геномной ДНК на наличие известных генов вирулентности и патогенности;
— типирование 41 штамма S.haemolyticus и 28 штаммов S.epidermidis на основании существующих схем мультилокус-ного секвенирования (MLST).
Выделение ДНК. Для выделения геномной ДНК стафилококков использовался набор «ДНК-экспресс» (ООО НПФ Литех, Россия) в соответствии с прилагаемыми инструкциями (ТУ-9398-450-17253567-03). Пробы ДНК хранились при температуре 20°C.
Проведение ПЦР. С помощью олигонуклеотидных прай-меров, перечисленных в табл. 1, были амплифицированы фрагменты гена mecA, генов токсинов hlgA, hlgA, hlgB, hlgC, sea, seb, sed, see, seg, seh, sei, sej, tsst, факторов адгезии и колонизации clfA, clfB, cna, fnbA, fnbB, icaA, icaB, icaC, icaD. Реакция амплификации проводилась по стандартному протоколу: в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 66 мМ Tris-HCl (рН 9,0), 16,6 мM (NH4)2SO4, 2,5 мМ MgCl2, 250 мкМ каждого dNTP, 1 ед. Taq DNA полимеразы (ООО НПФ Литех, Россия) и по 10 пмоль праймеров для амплификации тестируемого гена. Реакцию ставили на TETRAD DNA ENGINE (MJ Research, Inc.) при температуре 94°C 2 минут, далее 35 циклов 94°C 30 секунд, THO^ 30 секунд и 72°C 30 секунд. Продукты
Таблица 1. ПЦР праймеры, используемые в данном исследовании для генетической характеристики CoNS
Ген Название 5'-3' последовательность Температура реакции, °C Размер ампликона, bp
mecA MecA-P4 tccagattacaacttcaccagg 56 160
MecA-P7 ccacttcatatcttgtaacg
hlA hlA1 atagagatacttggaacccg 58 294
hlA2 tactgaagaacgatctgtcc
sea SEA-1 ggttatcaatgtgcgggtgg 60 195
SEA-2 aagatcctactcctgaacag
seb SEB-1 aaacttgtatgtatggtggtg 58 178
SEB-2 ttttcagcaaatagtgacgag
sed SED-1 ggtgaaatagataggactgc 58 193
SED-2 aaatagcgacttgcttgtgc
see SEE-1 gaaatcaatgtgctggaggc 60 313
SEE-2 tcataacttaccgtggaccc
sej SEJ-1 tactgattttctccctgacg 60 397
SEJ-2 tcatccagtgttactccacc
sei SEI-1 agattgaaaaggcgtcacag 62 513
SEI-2 cttacaggcagtccatctcc
seg SEG-1 atctttatatgtctccacctg 58 411
SEG-2 ttagtgagccagtgtcttgc
seh SEH-1 gctaatgtttgggtagatgg 58 195
SEH-2 cgaatgagtaatctctaggag
tsst TSST-1 taagacctttgttgcttgcg 62 247
TSST-2 gggctataatcaggactcgg
hlgA hlgA1 tcaatcggagtcagtggctc 62 206
hlgA2 tagtctcttgctgctggacc
hlgB hlgB1 gctatacatttggtggtgac 58 262
hlgB2 tatacactgctttgtctgcc
hlgC hlgc1 cttacttgcccctcttgcc 60 437
hlgc2 tgatccattaccaccgagtg
icaA icaA1 gaggtaaagccaacgcactc 62 485
icaA2 tcgtgtcccccttgagccc
icaB icab1 gattaactttgatgatatgg 52 516
icab2 ttttcatggaatccgtccc
icaC icac1 tattaggtcaatggtatggc 60 246
icac2 ctaagaagaaataaaaaatccatcc
icaD icad1 cagaggcaatatccaacgg 56 217
icad2 caaacaaactcatccatcc
cfA clfa1 aagtgtgcctagaatgagagc 60 995
clfa2 cgataccgtcaccagaacc
clfB clfb1 accactacaacagagccagc 62 300
clfb2 gtacctttagcatcagcagc
fnbA fnba1 atcgttgttgggatgggac 56 334
fnba2 acttgtctttgatctccgc
fnbB fnbb1 aagaagatacaaacccagg 54 410
fnbb2 taactacgatattgccacc
cna cna1 gaacaggtgggtcaagcag 58 245
cna2 tgtcgtatcttctggcagc
амплификации анализировали в 2% агарозном геле с визуализацией бромистым этидием.
Мультилокусное типирование штаммов S.haemolyticus проводили в соответствии с методикой Ворониной О. Л. [19], мультилокусное типирование штаммов S.epidermidis проводили в соответствии со схемой, представленной на сайте http://sepidermidis.mlst.net/, используя рекомендованные праймеры и условия амплификации.
Секвенирование ДНК. Перед постановкой реакции секвенирования ампликоны, полученные в ходе стандартной ПЦР, обрабатывали щелочной фосфатазой арктических креветок и экзонуклеазой I E.coli (ExoI, производства Fermentas, Литва) для инактивации неизрасходованных нуклеотидов и деградации олигонуклеотидных праймеров. Для этого к полученным ампликонам добавляли по 5 мкл смеси, содержащей 66 мМ Tris-HCl pH 9,0; 16,6 мМ (NH4)2SO4; 2,5 мМ MgCl2; 5 ед. ExoI и 0,5 ед. щелочной фосфатазы арктических креветок. Инкубировали в течение 20 минут при температуре 37°С с последующей инак-
тивацией ферментов и прогреванием в течение 10 минут при 85°С.
Определение нуклеотидных последовательностей амп-лифицированных фрагментов ДНК проводили модифицированным методом Сенгера с использованием ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit и прибора ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) в соответствии с прилагаемыми инструкциями.
Анализ данных секвенирования. Анализ последовательностей и выравнивание выполняли с помощью программного обеспечения VECTOR NTI v. 9.0. Для филогенетического анализа использовали программу MEGA v. 4.0 (http://www.mega-software.net).
Результаты и обсуждение
В период с 2010 по 2012 годы из клинического материала от новорождённых детей, выделено
Рис. 2. Частота выделения различных видов CoNS.
Рис. 1. Частота выделения различных групп микроорганизмов из клинического материала у новорождённых ОРИТ.
2867 изолятов микроорганизмов (рис. 1), из которых 1259 (43,9%) быши отнесены к СаЫБ, и 672 из них идентифицированы до вида.
Видовой состав коагулазонегативных стафилококков был представлен в основном тремя видами: 8.гр1йетт1й15 (69,5%), 8.Наето1у^сш (22%) и 8.НотМ8 (8%). Значительно реже, выделялись другие виды — Б.шгпеп, 8.ра51гип, 8жргоркуйсш, в общей сложности составившие 0,5% от всех идентифицированных СоN8. При сравнении видового состава изолятов ^N8, выделяемых при колонизации слизистых ЖКТ (кал и зев) и из очагов инфекций, было обнаружено, что в обоих случаях преобладает 8.ер1йетт1й15, причём при инфекциях высеваемость 8.ер1йетт1й1$ была выше (74%), чем при колонизации (65%). Вторым по частоте выделения был 8.Наето1у^еш — 29% изолятов из кала и зева и 15% из очагов инфекций, 8.ЪотЫ8 — 5,6 и 9,5 % соответственно (рис. 2).
Поскольку в ОРИТ новорождённых в качестве стартовой терапии чаще всего применяют комбинацию защищённого пенициллина (амокси-циллина/клавуланата) с аминогликозидом (нетилмицин), а для этиотропной терапии инфекций, вызванных метициллинорезистентными стафилококками используют ванкомицин или линезолид, все выделенные в данном исследовании изоляты ^N8 (п=1259) были протестированы на чувствительность к оксациллину, пенициллину, гентамицину, ванкомицину и линезолиду. Для группы изолятов, отобранных для углубленного генетического типирования (п=70), были получены расширенные антибиотикограммы, включающие линкомицин (клиндамицин), эритромицин, фузидин, ципрофлоксацин, хлорамфе-никол, тетрациклин.
Абсолютное большинство выделенных изолятов ^N8 были устойчивыми к метициллину 93% (1171/1259), метициллинорезистентность которых подтвердилась наличием гена тесА у 96% геноти-пированных изолятов. Вырабатывали пеницилли-
назу 98% (1234/1259) и были устойчивы к гентами-цину 91% (1145/1259) изолятов, а устойчивых к ванкомицину и линезолиду обнаружено не было.
Среди изолятов, для которых была сделана расширенная антибиотикограмма (n=70), устойчивы к тетрациклину были 18% (13/70), к хлорам-фениколу — 41% (29/70), к линкомицину — 40% (28/70), к эритромицину — 77% (54/70), к фузи-диевой кислоте — 34% (24/70), к ципрофлоксаци-ну — 66% (46/70).
При анализе чувствительности 114 изолятов MRCoNS к ванкомицину с определением минимальной подавляющей концентрации у 6% МПК составила 0,5 мкг/мл; у 93% МПК 1—2 мкг/мл; МПК более 2 мкг/мл (4 мкг/мл) у 1% изолятов. Исходя из современных представлений о чувствительности стафилококков к ванкомицину, можно говорить лишь о 6% изолятов CoNS, в отношении которых этот антибактериальный препарат будет клинически эффективен.
Отдельно стоит сказать, что в ходе настоящего исследования проведён анализ клинического материала от 16 погибших глубоконедоношенных новорождённых, для которых был подтвержден инфекционный диагноз. В 9 из 16 случаев (56%) в аутопсийном материале были обнаружены госпитальные микроорганизмы: в 7 случаях MRCoNS (77%), в 1 случае полирезистентный штамм Enterobacter cloacae, в 1 случае — Candida famata. Сроки пребывания этих новорождённых в ОРИТ превышали 72 часа. Вызывает особый интерес, что из 7 новорождённых, в аутопсийном материале которых обнаружены MRCoNS, 3 ребенка получали ванкомицин, но элиминации возбудителя при этом не произошло.
В рамках генетической характеристики ограниченной группы клинических изолятов CoNS (n=70) было проверено наличие следующих токсинов: гемолизинов а и у, энтеротоксинов А, В, D, Е, G, H, I, J и токсина токсического шока. Гены, ответственные за синтез токсинов, указанны
Таблица 2. Наличие генов токсинов у 70 клинических изолятов CoNS
Вид
Гемоли- Энтеро- Энтеро- Энтеро- Энтеро- Энтеро- Энтеро- Энтеро- Энтеро- Токсиче- Гемолизин а токсин А токсин В токсин D токсин E токсин G токсин H токсин I токсин J ского зин а hla sea seb sed see seg seh sei sej шока tst hlgA, hlgB,
-UgC-
s.haemolyticus (п=38) 3 (8%) 0 0 0 2 (5,3%) 0 0 0 0 2 (5,3%) 0
s.epidermidis (п=25) 16 (64%) 0 7 (28%) 10 (40%) 1 (4%) 0 4 (16%) 0 0 4 (16%) 0
s.hominis (п=4) 000000000 1 (25%) 0
s.wameri (п=3) 0 0 0 0 0 0 1 (33,3%) 0 0 0 0
Таблица 3. Наличие генов основных факторов адгезии и колонизации у 70 клинических изолятов ^^
Вид
Межклеточный полисахаридный адгезин
Клампинг Коллаген- Фибронектин-фактор связывающий связывающий белок белок
icaA
icaB
icaC
icaD
clfA
clfB
cna
fnbA
fnbB
S.haemolyticus (n=38) 0 8 (21%) 3 (8%)
S.epidermidis (n=25) 7 (28%) 10 (40%) 6(24%)
S.hominis (n=4) 0 1 (25%) 1 (25%)
S.warneri (n=3) 0 0 0
4 (10,5%) 3 (8%) 0 0 2 (5,3%) 0
16 (64%) 0 0 0 0 1 (4%)
0 0 0 0 0 1 (25%)
1 (33.3%) 0 0 0 0 0
Таблица 4. Сиквенс-типы S.haemolyticus и профиль антибиотикорезистентности
Сиквенс-тип Аллельный профиль Число Резистентность к антибиотикам, %
mvaK-rphE-tphK-gtr-arcC-tpi-aroE штаммов OXA GEN TET CL LIN ER FA CIP LZ VAN
1 1-1-2-1-1-1-1 1 100 100 0 100 100 100 0 100 0 0
5 3-1-1-1-1-3-1 20 100 100 5 5 95 100 5 100 0 0
7 3-2-2-1-2-2-1 1 100 100 0 0 100 100 0 0 0 0
19 3-1-1-1-1-1-1 18 100 100 39 17 17 100 0 100 0 0
20 3-1-1-3-1-1-1 1 100 100 0 0 0 100 0 0 0 0
в табл. 2. В табл. 3 представлены данные о наличии генов основных факторов адгезии и колонизации среди проанализированных 70 клинических изолятов. Всего гены гемолизина а были обнаружены у 19 изолятов Со^ (19/70; 27,1%), а ген токсического шока — у 7 изолятов (7/70; 10,0%). Наиболее часто из генов энтеротоксинов встречался ген энтеротоксина Б (10/70; 14,3%), гены энтеротоксинов В, Е и Н найдены у 7 (7/70; 10,0%), 3 (3/70; 4,3%) и 5 (5/70; 7,1%) изолятов Со^ соответственно.
Наибольшее разнообразие генов токсинов было выявлено среди клинических изолятов S.epidermidis (п=25). Различные изоляты S.epider-имели гены гемолизина а (16/25; 64%), энтеротоксинов В (7/25; 28%), Б (10/25; 40%), Е (1/25; 4%), Н (4/25; 16%), токсина токсического шока (4/25; 16%). У клинических изолятов S.hаemolyticus (п=38) были обнаружены гены гемолизина а (3/38; 8%), энтеротоксина Е (2/38; 5,3%), токсина токсического шока (2/38; 5,3%). Наличие генов токсинов у S.hominis и S.warneri было показано только для 2 клинических изолятов: клинический изолят S.hominis обладал токсином токсического шока, а изолят S.warneri — эн-теротоксином Н.
Для определения способности к образованию биоплёнок были детектированы гены основных факторов адгезии и колонизации clfA, Ы/В, cna,
/пЬА,,/пЬВ, каА, каВ, каС, каВ. Генами ка оперо-на обладали S.haemolyticus, S.epidermidisи S.homin-is. Ген каА встречался у 7 (7/70; 10,0%) изолятов СоШ, каВ — у 19 (19/70; 27,1%) изолятов, каС — у 10 (10/70; 14,3%) изолятов, каВ — у 21 (21/70; 30,0%) изолятов. Гены фибронектинсвязываю-щего белка/пЬА, /пЬВ были найдены у клинических изолятов S.haemolyticus и S.epider^midis (/пЬА — у 2 (2/70; 2,8%) и /пЬВ — у 2 (2/70; 2,8%) соответственно. Гена коллагенсвязывающего белка та не было найдено ни у одного клинического изо-лята CoNS.
На основании результатов МЬ8Т типирова-ния 41 изолят S.haemolyticus, выделенный от 26 новорождённых, был отнесён к 5 различным сик-венс-типам (табл. 4). Из 26 новорождённых, двое были доношенными, остальные — недоношенными (92%). Среди недоношенных очень низкую и экстремально низкую массу тела имели 16 (66%) новорождённых. Наиболее представлены сиквенс-типы 5 и 19, в состав которых входят соответственно 20 и 18 изолятов.
У доношенных новорождённых был обнаружен 8Т19, но клинические признаки госпитальной инфекции отсутствовали. В то же время три глубоконедоношенных ребенка имели клинические признаки инфекции, которая была ассоциирована с S.haemolyticus (Со^-сепсис — 2 ребёнка и конъюнктивит — 1 ребёнок). При конъюнкти-
«те
%
Рис. 3. Филогенетическое дерево штаммов 5.ЬаетоуИ-сш, построенное на основании нуклеотидных последовательностей локусов mvaK, rphE, tphK, gtr, arcC, tpi, aroE, входящих в состав схемы MLST.
вите были обнаружены БТ19, при CoN8-сепсисе — БТ5.
Филогенетическое дерево штаммов Б.Ъаето-\yticus, построенное на основании нуклеотидных последовательностей семи локусов, входящих в состав схемы МЬБТ представлено на рис. 3, где видно, что наиболее представленный кластер (95%) образован близкородственными изолята-ми, входящими в сиквенс-типы 5, 19, 20.
Таким образом, все выделенные и проанализированные нами изоляты были близкородственными, что подтверждает их госпитальное происхождение. Несмотря на то, что одинаковые CoN8 выделяли у всех новорождённых, проявления инфекций (пневмония и сепсис) отмечались только у глубоконедоношенных детей.
Помимо этого было проведено МЬБТ типиро-вание 28 изолятов S.epidermidis, выделенных от 19 новорождённых, из которых двое были доношенными, остальные — недоношенными (89,5%). Среди недоношенных очень низкую и экстремально низкую массу тела имели 11 (65%) новорождённых.
Изоляты на основании МЬБТ схемы были отнесены к 7 различным сиквенс-типам (табл. 5). Наиболее представлены сиквенс-типы: БТ2 (4 штамма), БТ22 (12 штаммов), БТ59 (6 штаммов).
От доношенных новорождённых был выделен БТ22 без клинических признаков госпитальной инфекции. Клинические признаки инфекции, ассоциированной с S.epidermidis, имели три недоношенных ребёнка. Инфекции были представле-
Рис. 4. Филогенетическое дерево штаммов Б.вр'^ег-построенное на основании нуклеотидных последовательностей локусов arcC-aroE-gtr-mutS-pyr-tpi-yqiL, входящих в состав схемы MLST (в скобках указан номер соответствующего сиквенс-типа).
ны следующими нозологическими формами: конъюнктивит, пневмония и сепсис. При конъюнктивите S.epidermidis был отнесен к БТ59; из ткани лёгких при вскрытии выделен БТ2; в третьем случае при вскрытии в крови из полости сердца обнаружен БТ22.
Филогенетическое дерево штаммов S.epider-midis, построенное по данным МЬБТ анализа, изображено на рис. 4. Наиболее представленный кластер, образован близкородственными штаммами, входящими в сиквенс-типы 2 и 22 (57%). Обращает на себя внимание, что конъюнктивит, вызванный S.epidermidis, был у ребёнка с массой тела более 2000 г, в то время как пневмония и сепсис были у глубоконедоношенных детей с массой тела при рождении менее 1500 г.
Изучая способность к длительной персистен-ции в условиях стационара, было отмечено, что изоляты с наиболее часто обнаруживаемыми сик-венс-типами встречались с постоянной частотой на протяжении 6 месяцев наблюдений.
Обсуждение
В этой работе было показано, что основную роль в патологии новорождённых, находящихся на выхаживании в ОРИТ, играют МЯСоШ, что подтверждается данными зарубежных исследователей [1, 2, 19, 20, 29]. Поздний неонатальный сепсис (более 72 часов после рождения) с первичным очагом в лёгких или катетер-ассоциирован-ный, встречается у 50% новорождённых с весом
В ПОМОЩЬ ПРАКТИКУЮЩЕМУВРАЧУ Таблица 5. Сиквенс-типы S.epidermidis и профиль антибиотикорезистентности
Сиквенс-тип Аллельный профиль Число _Резистентность к антибиотикам, %_
arcC-aroE-gtr-mutS- штаммов OXA GEN TET C LIN ER FA CIP LZ VAN pyr-tpi-yqiL
2 У-1-2-2-4-1-1 4 100 100 0 25 0 100 100 100 0 0
22 У-1-2-2-4-У-1 12 100 100 25 100 0 1У У5 1У 0 0
59 2-1-1-1-2-1-1 6 100 100 0 6У 1У 83 6У 1У 0 0
69 1-18-6-2-2-1-1 1 100 100 100 100 100 100 0 100 0 0
81 2-1У-1-1-2-1-1 2 100 100 100 50 0 100 50 0 0 0
89 1-1-2-1-2-1-1 2 100 100 0 50 50 0 50 0 0 0
269 1-1-2-2-28-16-1 1 100 100 0 0 0 0 0 0 0 0
при рождении менее 1500 г. [2]. Наиболее часто выделяемые из крови микроорганизмы — коагу-лазонегативные стафилококки (СоN5). Частота возникновения Со^-сепсиса у новорождённых по различным данным от 30 до 40% [2].
В нашем исследовании было подтверждено, что у глубоконедоношенных новорождённых наиболее частыми нозологическими формами Со^-инфекций являются сепсис и пневмония, реже встречаются локальные поражения (например, конъюнктивит).
Все изоляты, выделенные из очагов инфекций, были метициллинорезистентными и обладали множественной лекарственной устойчивостью. Во всех случаях препаратом выбора в терапии новорождённых служил ванкомицин, но не всегда происходила элиминация возбудителя при назначении терапевтических доз этого антибиотика, что возможно, связано с абсолютным преобладанием изолятов ^N3 с МПК более 1 мкг/мл.
Количество видов CoNS, циркулирующих в ОРИТ ограничено: самым часто встречаемым является S.epidermidis, вторым по частоте выделения — S.haemolyticus, третьим — S.hominis. В связи с этим часто возникает проблема разделения контаминации от инфекции, ведь эти виды являются наиболее частыми комменсалами кожи и слизистых оболочек.
Патогенность стафилококков связана с большим количеством разнообразных факторов вирулентности и патогенности: образование биоплёнок, продукция токсинов, различных факторов, позволяющих избежать иммунного ответа, устойчивость к различным антибиотикам. Как известно, у CoNS значительно меньше факторов вирулентности, чем Б.аигет. Однако среди клинических изолятов CoNS есть весьма патогенные изоляты, вызванные ими инфекции могут быть причиной смерти [21]. Патогенные штаммы CoNS могут содержать некоторые факторы вирулентности и патогенности Б.аигеш, так как многие из этих генов находятся в составе остовов патогенности и подвижных элементов [22]. В нашей работе были детектированы некоторые гены токсинов, основные факторы адгезии и колонизации у клиническических изоля-тов CoNS. Представители S.epidermidis чаще
других видов несут гены энтеротоксинов, токсина токсического шока, плёнкообразования, что, по-видимому, и определяет их ведущую роль в патологии новорождённых.
На основании полученных данных видно, что выделенные нами изоляты CoNS обладают значительно меньшим разнообразием токсинов, чем S.aureus, что подтверждается литературными данными [9]. При этом клинические изоляты S.epidermidis имеют наибольшее количество различных токсинов (гемолизин а, энтеротоксины В, D, E, H, токсин токсического шока).
Необходимо отметить, что наиболее часто в составе генома CoNS встречается ген гемолизина а. Для клинических изолятов S.epidermidis данный ген встречается у 64% изолятов, для изолятов S.haemolyticus — 8%. Возможно, это связано с тем, что гемолизин а обладает не только цитолитичес-кими свойствами в отношении моноцитов, лимфоцитов, эритроцитов и тромбоцитов, но и необходим для образования биоплёнок и адгезии бактериальных клеток на поверхности клеток хозяина [7, 23]. В то время как образование биоплёнок является одним из основных факторов вирулентности и патогенности CoNS.
Одним их необходимых факторов для образования биоплёнок стафилококками является PIA. По полученным нами данным гены ica оперона присутствуют у многих клинических изолятов CoNS, но при этом гены ica оперона представлены не полностью. Возможно, нуклеотидные последовательности этих генов в CoNS сильно отличаются от аналогичных последовательностей S.aureus, что приводит к снижению эффективности используемых праймерных систем.
По данным MLST анализа, было установлено, что для ОРИТ нашего госпиталя характерны два основных сиквенс-типа S.haemolyticus: ST5 и ST19, выраженная клональность подтверждает их госпитальное происхождение. Основные сик-венс-типы являются генетически родственными, поскольку принадлежат к единому клональному комплексу. Ранее было показано, что генетическое родство штаммов S.haemolyticus характерно не только для штаммов одного стационара, но и для штаммов, выделенных в стационарах разных городов [24].
Кроме того, для ОРИТ нашего госпиталя наиболее характерны сиквенс-типы ST2, ST22, ST59 S.epidermidis. Несмотря на то, что сиквенс-типы ST2, ST22 и ST59, ST69, ST81 образуют два разных кластера на филогенетическом дереве, они принадлежат к одному клональному комплексу [25]. В данный комплекс входят госпитальные штаммы, выделенные в различных странах мира, а сиквенс-тип ST2 является комплексообразую-щим сиквенс-типом [25—27].
Таким образом, для каждого отделения и стационара эндемичными являются определённые родственные молекулярные типы CoNS [28]. В нашем исследовании не было выявлено определённой связи между принадлежностью к определённому сиквенс-типу и способностью вызывать инфекции у недоношенных новорождённых, этот вопрос требует проведения дальнейших клинико-микробиологических исследований. Вероятнее всего первостепенную роль в развитии госпитальных CoNS-ассоциирован-
ЛИТЕРАТУРА
1. Craft A., Finer N. Nosocomial coagulase negative staphylococcal (CoNS) catheter-related sepsis in preterm infants: definition, diagnosis, prophylaxis, and prevention. J Perinatol 2001; 26: 186—192.
2. Mohan P. V., Placencia F, Leonard E. W.. Coagulase-negative staphy-lococcal infections in the neonate and child: an update. Semin Pediatr Infect Dis 2006; 17: 120—127.
3. Gruskay J., Harris M. C, Costarino A. T. et al. Neonatal Staphylococcus epidermidis meningitis with unremarkable CSF examination results. Am J Dis Child 1989; 143: 580—582.
4. Scheifele D. W, Gordean L. Bjornson Delta-like toxin produced by CoNS is associated with neonatal necrotizing enterocolitis. Infect Immun 1987; 2268—2273.
5. Eggink B. H, Rowen J. L. Primary osteomyelitis and suppurative arthritis caused by coagulase-negative staphylococci in a preterm neonate. Pediatr Infect Dis J 2003; 22: 572—573.
6. Haque N. Z, Zuniga L. C. et al. Relationship of vancomycin minimum inhibitory concentration to mortality in patients with methicillin-resis-tant Staphylococcus aureus hospital-acquired, ventilator-associated, or health-care-associated pneumonia. Chest 2010; 138: 6: 1356—1362.
7. Plata K, Rosato A., Wegrzyn G. Staphylococcus aureus as an infectious agent: overview of biochemistry and molecular genetics of its patho-genicity. Acta Biochim Pol 2009; 56: 4: 594—612.
8. Dinges M, Orwin P. Schlievert exotoxins of Staphylococcus aureus. PClin Microbiol Rev 2000; 13: 1: 13—34.
9. Otto M.Molecular basis of Staphylococcus epidermidis infections. Semin Immunopathol 2012; 34: 2: 201—214.
10. Marin M, de la Rose M, Cornejo /.Enterotoxigenicity of Staphylococcus strains isolated from Spanish dry-cured hams. Appl Environ Microbiol 1992; 58: 3: 1067—1069.
11. Madhusoodanan J, Seo K, Remortel B, Park J, Hwang S, Fox L, Park Y, Deobald C. An Enterotoxin-bearing pathogenicity island in Staphylococcus epidermidis. J Bacteriol 2011; 193: 8: 1854—1862.
12. Biofilms, infection, and antimicrobial therapy / Ed by J. L. Pace, M. Rupp, and R. G. Finch. Published by CRC Press Taylor & Francis Group, USA, 2006.
13. Menzies B. E. The role of fibronectin binding proteins in the pathogenesis of Staphylococcus aureus infections. Curr Opin Infect Dis 2003; 16: 3: 225—229.
14. McDevitt D, Nanavaty T., House-Pompeo K, Bell E, Turner N, Mclntire L, Foster T, Hook M. Characterization of the interaction between the Staphylococcus aureus clumping factor (ClfA) and fibrino-gen. Eur J Biochem 1997; 247: 1: 416—424.
15. Ni Eidhin D, Perkins S, Francois P., Vaudaux P., Hook M, Foster T.J. Clumping factor B (ClfB), a new surface-located fibrinogen-
ных инфекций играют факторы риска, связанные с иммунодефицитным состоянием недоношенных новорождённых и инвазивностью методов лечения в ОРИТ. Повторное выделение основных сиквенс-типов CoNS на протяжении шести месяцев говорит о длительной персис-тенции определённых клонов в отделении, что также подтверждает их госпитальное происхождение [28].
Заключение
В заключении хотелось бы отметить, что незрелость органов и систем, следствием которой является иммунокомпромиссность глубоконедоношенных новорождённых и новорождённых с тяжёлой врождённой патологией позволяет микроорганизмам с низким патогенным потенциалом, в частности CoNS, преодолевать естественные барьеры и запускать патологические процессы, приводящие к полиорганной недостаточности.
binding adhesin of Staphylococcus aureus. Mol Microbiol 1998; 30: 2: 245—257.
16. Patti J.M., Jonsson H, Guss B, Switalski L.M., Wiberg K, Lindberg M, Hook M. Molecular characterization and expression of a gene encoding a Staphylococcus aureus collagen adhesin. J Biol Chem 1992; 267: 7: 4766—4772.
17. Vuong C, Kocianova S, Voyich J., Yao Y, Fischer E, DeLeo F, Otto M. A crucial role for exopolysaccharide modification in bacterial biofilm formation, immune evasion, and virulence. J Biol Chem 2004; 279: 52: 54881—54886.
18. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Eighteenth Informational Supplement. CLSI Document M100-S18. 2008.
19. Isaacs D. A ten-year multicentre study of coagulase negative staphylococcal infections in Australasian neonatal units. Arch Dis Child 2003; 88: F89—93.
20. Bansal S, Jain A., Agarwal J., Malik G. K. Significance of coagulase negative staphylococci in neonates with late onset septicemia. Indian J Pathol Microbiol 2004; 47: 586—588.
21. Piette A., Verschraegen G. Role of coagulase-negative staphylococci in human disease. Vet Microbiol 2009; 134: 45—54.
22. Malachowa N., DeLeo F. R. Mobile genetic elements of Staphylococcus aureus. Cell Mol Life Sci 2010; 67: 18: 3057—3071.
23. Caiazza N. C, O'Toole G. Alpha-toxin is required for biofilm formation by Staphylococcus aureus. J Bacteriol 2003; 185:10: 3214—3217.
24. Воронина О. Л, Кунда М. С, Дмитриенко О. А, Лунин В. Г., ГинцбургА Л. Разработка схемы мультилокусного секвенирования Staphylococcus haemolyticus и ее применение для молекулярно-эпидемиологического анализа штаммов, выделенных в стационарах Российской Федерации в 2009—2010 гг. Журн микробиол 2011; 5: 62—67.
25. Miragaia M, Thomas J. C., Couto I., Enright M. C., de Lencastre H.Inferring a population structure for Staphylococcus epidermidis from multilocus sequence typing data. J Bacteriology 2007; 189: 6: 2540—2552.
26. Li M., Wang X., Gao Q., Lu Y. Molecular characterization of Staphylococcus epidermidis strains isolated from a teaching hospital in Shanghai, China. J Med Microbiol 2009; 58: 4: 456—461.
27. Mendes R. E., Deshpande L. M., Costello A. J., Farrell D. J. Molecular epidemiology of Staphylococcus epidermidis clinical isolates from U.S. hospitals. Antimicrob Agents Chemother 2012; 56: 9: 4656—4661.
28. Krediet T. G., Mascini E. M., van Rooij E., Vlooswijk J., Paauw A., Gerards L. J., Fleer A. Molecular epidemiology of coagulase-negative staphylococci causing sepsis in a neonatal intensive care unit over an 11-year period. J Clin Microbiol 2004; 42: 3: 992—995.
29. Guilbert J., Meau-Petit V., de Labriolle-Vaylet C., Vu-Thien H., Renolleau S. Coagulase-negative staphylococcal osteomyelitis in preterm infants: a proposal for a diagnostic procedure. Arch Pediatr 2010; 17: 10: 1473—1476.
