CC BY
42
УДК 579.88:632.035.258
В.М.Катола
МИКОПЛАЗМОПОДОБНЫЕ БАКТЕРИИ - КОНТАМИНАНТЫ МИКРОМИЦЕТОВ
Институт геологии и природопользования ДВО РАН, Благовещенск
РЕЗЮМЕ
Прямыми электрономикроскопическими исследованиями показано, что гифы микромицетов и их конидии являются носителями микоплазмо-подобных бактерий сферической формы, которые по электронной плотности и величине соответствуют элементарным тельцам и более взрослым клеткам молликут. Но механизм их проникновения в мицелий, выход из конидий в окружающую среду и роль в эпидемиологии респираторных заболеваний остаются пока неизвестными.
Ключевые слова: микоплазмы,
микроскопические грибы, инфицирование грибов.
SUMMARY
V.M.Katola
MYCOPLASMALIKE BACTERIA ARE MICROMYCETS CONTAMINANTS
The direct electronomicroscopic study showed that micromycets hyphae and their conidia were the carriers of mycoplasmalike bacteria of the spherical shape, which by their electronic density and value corresponded to elementary particles and more mature cells of mollicuts. But the mechanism of their penetration into mycelium, their going out of conidia into environment and the role in epidemiology of respiratory diseases are still unknown.
Key words: mycoplasma, microscopic fungi, fungal contamination.
Сапрофитные и патогенные микроорганизмы класса Mollicutes - микоплазмы - широко распространены в организмах человека, животных и растений. В природной среде циркулируют в свободном состоянии или в виде антигенных комплексов [4, 8]. Представляют собою одноклеточные сферические организмы диаметром от 0,1-0,25 (мини-клетки или элементарные тельца) до 0,3-1,40 мкм и более (зрелые формы) либо нитевидные структуры длиною 100-150 мкм. Окрашиваются по Романовскому-Гимзе, лишены клеточной стенки, спор не образуют. Эти прокариоты имеют трехслойную цитоплазматическую мембрану, небольшую массу генома, рибосомы 708-типа, которые диспергированы по всей цитоплазме, и включения (вакуоли). Время одной их генерации исчисляется часами (у остальных бактерий -минутами). Микоплазмы содержат плазмиды и различной формы вирусы, принадлежащие к разным группам, чувствительны к тетрациклинам, макроли-дам, хлорамфениколу, ультрафиолетовым лучам, ультразвуку, дезсредствам, но толерантны к пени-циллинам, низким температурам и др. Проникая в организм аэрозольным либо контактным путем, они
локализуются внутри клеток или экстрацеллюлярно, выделяют экзо- и эндотоксины, ферменты и другие факторы патогенности, нарушающие метаболизм инфицированных клеток. Микоплазмы способны длительно персистировать в организме, не подвергаясь, например, воздействию лизосомальных ферментов, хотя мононуклеары периферической крови и лимфы их активно фагоцитируют [8]. Моликуты были выделены при лейкозах и опухолях человека, заболеваниях суставов, нервной системы и пр. Самые распространенные микоплазмозы - заболевания дыхательных путей (ринит, фарингит, бронхит и пневмонии), обусловленные M. pneumoniae. Этого возбудителя характеризуют высокая ферментативная активность, способность гемолизировать эритроциты человека, лошади и морской свинки, расти в бронхиальном эпителии куриного эмбриона, чувствительность к препаратам золота и пр. Нередко встречаются смешанные вирусно-микоплазменные и бактерио-микоплазменные инфекции. Несмотря на множество оригинальных работ, посвященных представителям класса Mollicutes, не все их переносчики (за исключением насекомых) известны. В частности, практически нет сведений об инфицировании ими микромице-тов (микроскопических грибов), следовательно, и переносе конидиями.
Учитывая выше изложенное, целью настоящей работы явилась визуализация контаминантов микро-мицетов и их конидий с помощью прямой электронной микроскопии.
Материал и методы
С помощью устройства [5] и сеточек с формваро-вой подложкой с различных объектов (производственная, угольная и комнатная пыли, скальные породы, твердые отходы золотодобычи и пр.) и выросших на плотной питательной среде Чапека колоний Peni-cillium aanescens получали препараты-отпечатки. Одновременно P. canescens культивировали в глубине жидкой среды Чапека при температуре +37°С в присутствии отходов золотодобычи, после чего традиционным способом [7] готовили вегетативный мицелий для электронномикроскопического исследования. Для обнаружения микоплазм инкубационную жидкость освобождали от мицелия, центрифугировали при 3000 об/мин и центрифугат высевали на приготовленную среду Г.Я. Кагана (рН 7,0) [4]. Все препараты-отпечатки просушивали, затем препараты-отпечатки, взятые при помощи устройства [5], напыляли углеродом в вакуумной установке ВУП-4 и просматривали в сканирующем электронном микроскопе JEOL jsm-35C (Япония). Препараты-отпечатки на сеточках с формваровой подложкой и ультратонкие срезы исследовали в просвечивающем электронном микроскопе TESLA В8 500.
Ж8Я
а б в
Рис. 1. Просвечивающая электронная микроскопия микоплазмоподобных бактерий:
а - стрелкой отмечен очаг деструкции в оболочке конидии PeniciШum сanescens, в котором находится сферическое тело (х9000); б - стрелками отмечены элементарные тельца внутри конидии P. сanescens с очагами деструкции в оболочке (х22000); в - стрелками отмечены сферические тела разных размеров в гифе P. сanescens (ультратонкий срез, х 16000).
Результаты и обсуждение
Сразу же отметим, что некоторые микромицеты (Penicillium, Aspergillus и др.) являются переносчиками сферических вирусов [1, 2, 3], чьи размеры варьируют от 0,025 до 0,054 мкм, но не более 0,060 мкм. Колонии грибов, инфицированные вирусами, медленно растут, отличаются зеленоватой окраской, секторным некрозом, не образуют воздушного мицелия и пр. Численность вирусных частиц в грибной клетке может доходить до 105, однако поражаются не все гифы. Оптимальная температура развития вирусов +22-26°С, при температурах +28-32°С они уже не обнаруживаются. Вирусы отсутствуют при выращивании грибов в глубине питательной среды или на обедненной среде. Таким образом, существуют достаточно простые тесты, позволяющие дифференцировать молликуты от вирусов.
По внешнему виду и размерам колоний констатировать инфицирование микромицетов микоплазмами невозможно. Наиболее удобный способ их выявления, предложенный нами, является метод отпечатков, эффективный, в первую очередь, для изучения конидий, представляющих толстостенные клетки, которые защищают вид от действия многочисленных стрессоров [6]. В просвечивающем электронном микроскопе конидии микромицетов, будучи непрозрачными для электронов, выглядят плотными тенями диаметром от 2-3 до 4-5 мкм с неровными контурами, округлой, овальной, грушевидной или другой формы (рис. 1 а). Считается, что они разрушаются в процессе старения. Однако проведенный нами анализ препаратов-отпечатков, полученных с поверхности 5-суточных колоний P. canescens, показал, что среди цепочек ювенильных конидий одной генерации уже находятся экземпляры с очагами деструкции в оболочке. У таких конидий мы впервые обнаружили единичные или небольшие группы гомогенных электронноплотных сферических субмикроструктур (сферулы) с ровными контурами и диаметром 0,20-
0,25 мкм, которые довольно четко просматривались на фоне деструкции (рис. 1 а, б). Подобные образования размером 0,18-0,31 мкм были зарегистрированы на ультратонком срезе гифы P. сanescens, выросшей в присутствии отходов золотодобычи. В ней они рас-
полагались в цитоплазме и ее пустотах под плазмол-лемой, а некоторые даже выходили за ее пределы (рис.1 в). Несмотря на визуализацию этих анонимов, посевы центрифугата из инкубационного раствора на среду Г.Я. Кагана не привели к положительным результатам, что могло быть обусловлено: а - их внутриклеточным расположением; б - некультивируемо-стью вследствие низкой множественности (дозы) инфекции; в - потерей жизнеспособности сразу же после выхода из гифов в среду, насыщенную токсичными элементами.
При просмотре в сканирующем электронном микроскопе препаратов-отпечатков, взятых из различных природных объектов, на поверхности конидий не-идентифицированных микромицетов также постоянно обнаруживались сферулы диаметром 0,20-1,5 мкм, иногда больше (рис. 2). Согласно материалам исследований, образований другой формы, кроме сферической, ни внутри гифы, ни на поверхности конидий нами не выявлено. Очевидно, сферическая форма является ведущей и в процессе роста эти тела меняют лишь свои размеры. Одновременно обнаружена еще одна важная особенность: все сферические анонимы выходили на поверхность конидии через деструкцию в оболочке, представляющую собою отверстие, которое возникает, по-видимому, под воздействием ферментов сферул. Деструкции-отверстия отличались между собою разными размерами и ровными краями, причем, размер отверстия коррелировал с диаметром выходящего наружу сферического тела (рис. 2 а, в). Из одного крупного отверстия первыми выходят крупные тела, следом за ними - мелкие, из маленького отверстия - только мелкие сферулы (рис. 2 в, г). В результате наблюдений мы пришли к выводу, что по количеству очагов деструкции и их размеру можно судить не только о величине сферул, но и о их возрасте. С другой стороны, возникающая морфологическая неполноценность конидий, а именно, их разрушение уже не может объясняться одним лишь старением - на первый план выступает совершенно иная причина, обладающая собственной деструктивной активностью. В связи с этим возникает вопрос: кем же она является? Динамика укрупнения сферических структур, незначительная их численность внутри клеток гифы или на поверхности конидии позво-
ляют исключить вирусную инфекцию микромицетов. В то же время форма, величина и структура анонимных образований соответствует морфологии элементарных телец и более зрелых клеток микоплазм. Кстати, большинством авторов элементарные тельца рассматриваются в качестве основной репродуктивной стадии в клеточном цикле молликутов. И эта колониеобразующая единица не может быть меньше
0,12 мкм. Размножения элементарных телец начинается с их прорастания нитями, хотя не исключено, что доминирующим способом репродукции микоплазм все же является бинарное деление, почкование и разделение нитчатых форм на более мелкие клетки. Почкование сферических клеток на конидиях мы зафиксировали только однажды. И это неудивительно, поскольку «...еще никому не удалось.. .показать развитие и репродукцию элементарных телец в условиях эксперимента» [8].
Учитывая, что обнаруженные нами образования в гифах и на поверхности конидий микромицетов не
были выделены в культуру и не идентифицированы, мы воздерживаемся от наименования «микоплазмы». До уточнения их биологических и таксономических характеристик более правомочно использовать названия: «микоплазмоподобные организмы», «мико-плазмоподобные бактерии», «микоплазмоподобные микробы». Тем не менее, уже сейчас можно утверждать, что микоплазмоподобные бактерии инфицируют микромицеты, персистируют в гифах и размножаться в них. Завершив внутриклеточный цикл развития в цитоплазме, они перемещаются по гифам до конидий, депонируются в последних, в том числе для «дозревания» и переносятся ими. Разрушая конидии, они выходят на их поверхность, чтобы вновь внедриться в интактные гифы и повторить очередной цикл развития. Параллельно микоплазмоподобные микробы рассеиваются в окружающей среде и среди населения. Проникая с аэрозолями в дыхательные пути, инфицированные конидии разрушаются под влиянием защитных факторов организма и освобож-
Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия микоплазмоподобных бактерий: а - выход сферических тел на поверхность конидии неидентифицированных микромицетов (препарат-отпечаток с рудной породы, х4000); б - сферические тела на поверхности конидии с очагами деструкции в оболочке (препарат-отпечаток с отходов золотодобычи, х6000); в - выход сферических тел на поверхность конидии неидентифицированных микромицетов (препарат-отпечаток с домашней пыли, х 10000); г - множественные сферические тела разной величины на конидии неидентифицированных микро-мицетов (препарат-отпечаток с поверхности скалы, х3600); Мелкими стрелками отмечены сферические тела, крупными стрелками - очаги деструкции в оболочке конидии.
даются от своих контаминантов. В итоге может быть или бессимптомное носительство микоплазмоподоб-ных бактерий, или, наоборот, развитие респираторной патологии, которую можно дифференцировать с помощью серологических тестов. Таким образом, микромицеты обладают необычным аутомикробио-зом, состоящим, по крайней мере, из вирусов или микоплазмоподобных микроорганизмов.
Выводы
1. Гифы микромицетов и их конидии являются носителями микоплазмоподобных бактерий в основном сферической формы, которые по электронной плотности и величине соответствуют элементарным тельцам и более взрослым клеткам молликут.
2. Механизм проникновения микоплазмоподоб-ных контаминантов в гифу микромицетов, их выход из конидий в окружающую среду и роль в эпидемиологии респираторных заболеваний остаются неизвестными.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вирусы грибов, их ингибирующие и индуцирующие свойства [Текст]/А.Д.Бобырь,
Ю.П.Садовский.-Киев: Наукова Думка, 1978.-125 с.
2. Вирусы в культуре гриба FUSICOCCUM
AMIGDALI DEL [Текст]/Г.С.Муромцев,
Р.А.Максимова, И.М.Дадашева//Микробиология.-
1994.-Т.63, вып.2.-С.224-270.
3. Вирусы растений [Текст]/Р.Мэтьюз.-М.: Мир, 1973.-116 с.
4. Медицинская микоплазмология [Текст]/
С.В.Прозоровский, И.В.Раковская, Ю.В.Вульфович.-М.: Медицина, 1995.-286 с.
5. Устройство для топического электронномикроскопического обнаружения Ь-форм бактерий на полипах носа [Текст]:пат. № 2269938 Яи: МПК А 61 В 10/00 в 01 N 33/48/авторы и заявители В.М.Катола,
Э.В.Хмелькова; патентообладатель ГУ ДНЦ ФПД СО РАМН.-№2001125117; заявл. 16.08.04; опубл. 20.02.06, Бюл. №5.
6. Царство грибов: гетерогенность физиолого-
биохимических свойств и близость к растениям, животным и прокариотам (обзор)
[Текст]/Е.П.Феофилова//Прикладная биохимия и микробиология. -2001.-Т.37, №2. -С. 141-155.
7. Электронная микроскопия для начинающих [Текст]/Б.Уикли.-М.: Мир, 1975.-С.301-307.
8. Ь-формы бактерий и семейство Мусор1а8та1а-сеае в патологии [Текст]/В.Д.Тимаков, Г.Я.Каган.-М.: Медицина, 1973.-Часть 11.-С. 142-345.
Поступила 26.03.2008
УДК 612.014.462.9:616-078-099:546.26 К.В.Самсонов
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ СОРБЦИИ БАКТЕРИЙ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ТОКСИНОВ УГЛЕРОДНЫМИ И УГЛЕРОДМИНЕРАЛЬНЫМИ СОРБЕНТАМИ
ГУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН
РЕЗЮМЕ
В 50 стендовых опытах установлены высокие сорбционные способности к бактериям и бактериальным токсинам углеродминерального сорбента СУМС-1, по отношению к углеродным сорбентам.
Ключевые слова: бактерии, бактериальный токсин, сорбенты.
SUMMARY
K.V.Samsonov
THE COMPARATIVE EFFECTIVENESS OF BACTERIA AND BACTERIAL TOXINS SORPTION WITH CARBONIC AND CARBONMINERAL SORBENTS
In 50 development tests, the high sorption of bacteria and bacterial toxins of carbonmineral sorbent SUMS-1 to carbonic sorbents was established.
Key words: bacteria, bacterial toxin, sorbents.
Для эфферентной терапии в России широко применяют различные сорбенты [1, 2]. Углеродмине-ральные сорбенты типа СУМС-1, созданные на основе минерального носителя - А1203, покрытого слоем активированного угля также активно внедряются в клиническую практику [3].
Цель исследования - сравнить сорбционные способности углеродных и углеминеральных сорбентов в отношении бактерий и бактериальных токсинов.
Материал и методы исследования
Подсчет количества микроорганизмов, адсорбированных на поверхности сорбента, проводили по следующей методике.
Сорбенты различных марок углей (углеродные СКН-1к, СКН-4м, углеродминеральные - СУМС-1) помещались в колонки высотой 12 см и диаметром 1 см, которые стерилизовались сухим жаром при температуре 1800С в течение 1 часа. В день проведения стендового опыта готовилась взвесь суточной куль-
