CC BY
20ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ . 1
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
О.В.Бухарин, Н.Б.Перунова, Е.В.Иванова, С.В.Андрющенко
МЕЖМИКРОБНОЕ РАСПОЗНАВАНИЕ «СВОЙ-ЧУЖОЙ» В ПАРЕ «ДОМИНАНТ-АССОЦИАНТ» ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI М-17 И ESCHERICHIA COLI ЛЭГМ-18
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург
Цель. Разработанный ранее метод межмикробного распознавания «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» использовать для оценки чужеродности пробиотических культур Escherichia coli М-17 (с островом патогенности) и Е. coli ЛЭГМ-18 (без острова патогенности). Материалы и методы. В качестве доминантов в работе использованы эталонные и клинические штаммы бифидобактерий, в качестве ассоциантов взяты культуры Е. coli М-17 и ЛЭГМ-18, различающиеся по наличию генов, кодирующих колибактин. Определение феномена микробного распознавания проводили по разработанному алгоритму (Бухарин О.В., Перунова Н.Б., 2011), основанному на принципе индукции метаболитов в результате предварительного соинкубирования доминантов (бифидобактерий) с супернатантом ассоциантов и формирования обратной связи впаре «доминант-ассоциант». В качестве биологических характеристик исследуемых кишечных палочек были определенные ростовые свойства, биопленкообразование и антилизоцимная активность. Результаты. Тестирование культуры Е. coli М-17 выявило угнетение изучаемых биологических признаков, и она оценивалась как «чужая», вероятно, за счет наличия острова патогенности, тогда как Е. coli ЛЭГМ-18 (без этого фрагмента) резко усиливала свои биологические характеристики и подлежала оценке как «своя». Заключение. Использование межмикробного распознавания «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» перспективно в качестве базового метода при отборе пробиотических штаммов и культур микроорганизмов для создания новых синбиотических композиций и пригодно для контроля за качеством пробиотической продукции.
Журн. микробиол., 2016, № 3, С. 3—9
Ключевые слова: межмикробное распознавание «свой-чужой», метаболиты микроорганизмов, индукция, доминанты, ассоцианты, бифидобактерии, Escherichia coli М-17, Escherichia coli ЛЭГМ-18, колибактин, пробиотики
O.V.Bukharin, N.B.Perunova, E.V.Ivanova, S.V.Andryuschenko
INTERMICROBIAL «SELF-NON-SELF» DISCRIMINATION IN «DOMIN ANT-ASSO-CIANT» PAIR OF PROBIOTIC STRAINS OF ESCHERICHIA COLI M-17 AND E.COLI LEGM-18
Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia
Aim. To use earlier developed method of intermicrobial «self-non-self» discrimination in «dominant-associant» pair for the assessment of foreignness of probiotic cultures of Escherichia coli M-17 (with pathogenicity island) and E. coli LEGM-18 (without pathogenicity island). Materials and methods. As dominants reference and clinical strains of bifidobacteria were used in the work, cultures of E. coli M-17 and E. coli LEGM-18 were taken as associants, differing in the presence of genes which code colibactin. Detection of the phenomenon of microbial discrimination was conducted according to the developed algorithm (Bukharin O.V., Perunova N.B., 2011) based on the principle of metabolite induction as a result of preliminary coincubation of dominants
(bifidobacteria) with supernatant of associants and the formation of feed back in «dominant-as-sociant» pair. Special growth properties, biofilm formation, and antilysozyme activity served as biological characteristics of investigated coliform bacteria. Results. Testing of E. coli M-17 culture revealed depression of biological properties under investigation and it was estimated as «non-self» possibly due to the presence of pathogenicity island whereas E. coli LEGM-18 (without this fragment) sharply strengthened its biological characteristics and was subjected to assessment as «self». Conclusion. Use of intermicrobial «self-non-self» discrimination in «dominant-associant» pair is promising as basic method when selecting probiotic strains and cultures for creation of new symbiotic compositions and is suitable for quality control of probiotic products.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2016, No. 3, P. 3-9
Keywords: intermicrobial «self-non-self» discrimination, metabolites of microorganisms, induction, dominants, associants, bifidobacteria, Escherichia coli M-17, Escherichia coli LEGM-18, colibactin, probiotics
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что живые организмы, не зависимо от уровня сложности (от прокариот до высших эукариот), имеют системы защиты от чужеродной информации [5,10]. Механизмы самоидентификации и микробного распознавания в настоящее время активно изучаются на модели роста различных культур бактерий на поверхности агаровых сред [7,15]. Однако при этом не известно, как будут складываться взаимоотношения микроорганизмов в бульонной культуре, а также с учетом микробных метаболитов в этом процессе, тогда как на значение метаболитов микроорганизмов при формировании межмикробных взаимоотношений, указывали в своей работе Shank А.Е. и Kolter R. [14], связывая регуляторные взаимодействия микроорганизмов с наличием в супернатанте «сигнальных» молекул. Это не исключает, что фенотипические изменения микробных популяций при их взаимодействии осуществляются с помощью молекул, которые используются в качестве индукторов новых метаболитов-посредников, оказывающих влияние на формирование антагонистических/синергидных связей микроорганизмов в ассоциации [3].
Использование приема индукции микробными метаболитами в условиях пары «доминант-ассоциант» с последующим определением антагонистических/синергидных типов связей между микросимбионтами способствовало созданию алгоритма микробного распознавания «свой-чужой» на модели микросимбионтов дистального отдела толстого кишечника человека. Разработка метода определения «чужеродности» штаммов микроорганизмов позволила дифференцировать «свои» и «чужие» культуры микросимбионтов среди клинических изолятов бактерий и грибов [2].
Очевидно, что присутствие в супернатанте микроорганизмов факторов, связанных с патогенностью и персйстентными свойствами микроорганизмов, значимо для микробного «распознавания», что было выявлено фенотипически в ряде экспериментов. Показано, что наличие токсинов (гемолизины, энтероток-сины) и факторов, обеспечивающих антилизоцимный признак энтеробактерий, позволяет доминантной микрофлоре (бифидобактериям) «распознавать» штаммы в качестве «чужеродных» в условиях стабильного подавления параметров репродукции и адаптации микроорганизмов [3]. Однако вопрос о химической природе этих факторов остается открытым. Кроме того, выяснение механизмов феномена микробного распознавания требует создания моделей in vitro, основанных на оппозитных штаммах одного и того же вида микроорганизмов, различающихся по своим биологическим характеристикам, метаболическому и генетическому профилю.
В продолжение исследований микробного распознавания «свой-чужой» были
выбраны культуры Escherichia coli М-17 и Е. coli ЛЭГМ-18. Целью данного исследования явилось определение различий в распознавании бифидобактериями «чужеродности» среди штаммов кишечных палочек, различающихся по наличию острова патогенности, кодирующего колибактин.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Определение феномена микробного распознавания проводили по разработанному алгоритму [2], основанному на принципе индукции метаболитов в результате предварительного соинкубирования доминантов (бифидобактерий) с супер-натантом ассоциантов и формировании обратной связи в паре «доминант-ассо-циант». При этом соинкубирование микробных культур с метаболитами проводили в несколько этапов, оценивая результат по изменению базовых параметров физиологических характеристик микросимбионтов: ростовые свойства (рост/размножение, PC), биопленкообразование (БПО) и антилизоцимная активность (АЛА).
В качестве доминантов использовали эталонные штаммы бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 791 (№ депонента АС-1247 Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИ «Генетика»), Bifidobacterium adoles-centis МС-42 (ГИСК им. Л.А.Тарасевича), являющиеся производственными про-биотическими культурами. Также были использованы клинические культуры Bifidobacterium longum 505, Bifidobacterium bifidum 349, Bifidobacterium catenulatum 504, изолированные от пациентов при обследовании на дисбиоз кишечника. Выделение и идентификацию бифидобактерий осуществляли в соответствии с методическими рекомендациями [9].
В качестве культур ассоциантов, в отношении которых изучалась способность бифидобактерий дифференцировать «свои» и «чужие» штаммы, использовали эталонные культуры бактерий Е. coli М-17 и Е. coli ЛЭГМ-18 (№ депонента В-6240 Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ «Генетака»). Ранее было установлено, что штамм Е. coli М-17 содержит введенную неконъюгативную, немобилизуемую плазмиду pColap, несущую гены продукции колицина Е1 и детерминант устойчивое™ к ампициллину в дозах до 150 мг/л, а также гены clbB, clbN, clbA и clbQ, ассоциированные С образованием генотокси-ческого колибактана [1,8]. Культура Е. coli ЛЭГМ-18 была получена от здорового человека, предложена в качестве нового штамма для производства колибакте-рина (патент РФ № 2065875) и.не содержит острова патогенности, кодирующего четырехгенную систему нерибосомального синтеза гибридного пептидо-поликетидного генотоксина и индуцирующего двухцепочечные разрывы ДНК в эукариотических клетках [12].
При реализации алгоритма «свой-чужой» на 1 этапе исследований штаммы бифидобактерий индуцировали метаболитами Е. coli М-17 и Е. coli ЛЭГМ-18 методом предварительного соинкубирования. Для этого были получены суперна-танты (СН) Е. coli М-17 и Е. coli ЛЭГМ-18 из «ночных» бульонных культур микроорганизмов. Далее бульонные культуры кишечных палочек центрифугировали (3200 об/мин 15 минут) и пропускали внеклеточную жидкость через мембранные фильтры «Millipore» с диаметром пор 0,2 мкм. Метаболиты кишечной палочки соинкубировали со взвесями бифидобактерий (9x108 КОЕ/мл, 3 McF) в соотношении 1:2 в течение 1 часа в СОг-инкубаторе (Binder, Германия). В качестве контрольных проб служили штаммы бифидобактерий, к которым вместо супернатан-тов Е. coli добавляли питательный бульон в эквивалентном соотношении. После соинкубирования смеси культуры бифидобактерий с* метаболитами кишечных палочек ее трижды отмывали физраствором (0,9% NaCl), ресуспендировали в питательном Schaedler-бульоне (BBL, США) и культивировали в течение 48 часов в СОг-инкубаторе (Binder, Германия).
На 2 этапе изучали влияние метаболитов индуцированных и контрольных проб
бифидобактерий на биологические свойства (ростовые свойства, биопленкообра-зование и антилизоцимную активность) изучаемых культур Е. coli М-17 и Е. coli ЛЭГМ-18. Для этого из бульонных культур бифидобактерий получали супернатант и добавляли его в соотношении 1:9 в питательный бульон со взвесью кишечных палочек (3 McF). Культивировали штаммы в течение 24 часов при 37°С.
На 3 этапе определяли изменение биомассы культуры (ростовые свойства), способность к образованию биопленок и антилизоцимную активность изучаемых культур кишечных палочек в опытных и контрольных пробах фотометрическим методом на 8-канальном планшетном фотометре ELx808 (BioTek, США). В качестве контроля на каждом этапе исследований вместо СН микроорганизмов использовали эквивалентное количество питательного бульона.
Оценку полученных данных проводили по изменению PC, АЛА и БПО кишечных палочек в сравнении с исходными биологическими характеристиками изучаемых культур, и по снижению изучаемых параметров штаммы относили к «чужим» видам. А при увеличении PC, АЛА и БПО ассоциантов культуры микроорганизмов относили к «своим» видам [2].
Статистическую обработку данных осуществляли методом вариационной статистики из пакета прикладных программ Microsoft Office Excel и программы Биостат путем подсчета Миш; данные по определению регулирующего влияния бифидобактерий на биологические свойства кишечных палочек — непараметрическими методами с применением критерия Манна-Уитни. Во всех процедурах статистического анализа уровень значимости р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При оценке полученных результатов следует обратить внимание на то, что в начале опыта был поставлен контроль изучаемых биологических характеристик Е. coli М-17 и Е. coli ЛЭГМ-18. В табл. суммированы эти данные на основании 9 дублей опытов, и оказалось, что различия между изучаемыми культурами были отмечены только в отношении пролиферативной активности бактерий, которая значительно выше была у Е. coli М-17, где PC составили 0,93±0,06 едхОП45о, тогда как для Е. coli ЛЭГМ-18 этот показатель был ниже — 0,57±0,1 едхОЩзо (р<0,05). Характеристики БПО и АЛА у сравниваемых кишечных палочек существенно не различались; У Е. coli М-17 эти показатели составили для БПО — 0,3±0,03 едхОПбзо, АЛА — 0,52±0,1 мкг/млхОП45о, а для штамма Е. coli ЛЭГМ-18
Динамика биологических свойств пробиотических культур Е. coli М-17 и Е. coli ЛЭГМ-18 под воздействием мегаболитов бифидобактерий при межмикробном распознавании «свой-чужой»
Исследуемые ассоиианты Е. coli М-17 Е.соИЛЭГМ-18
PC. ел. ОП,м БПО, сд. оп4Я0 АЛА.МКГ/ ' млхОПл» t РС.ея.ОП.50 БПО, ед. ОП«о АЛА, м кг/ млхОП«»
димппан 1 ные кулыуры контроль 0,9310,06 контроль , 0,3±0,03 контроль. 0,52±0,| контроль 0,57±0,1 контроль 0,25±0,09 контроль 0,4±0,08
О - Я z В. bifidum №79U 0,94±0,2 0,33±0,04 0,87±0,03* , 0,56±0,07 0,57±0,004* 0,48 ±0,005*
s s g В. bifidum № 791 HHa. 0,76±0,03** 0,24±0,02** 0,15±0,03** 0,75±0,02* 0,96±0,03* 0,39±0,04
о 5 S В. adolescents М-42к 0,77±0,003** 0,28±0,04 0,53±0,07 0,55±0,07 0,37±0,09* 0,65±0,1*
1 В. adolescents М-42„нд 0,65±0,04** 0,2±0,02** 0,14±0,03** 0,7±0,09* 0,61 ±0,05* 1,01 ±0,3*
В. longum 505* 0,9±0,05 0,27±0,01 0,48 ±0,03 0,63±0,02 0,23±0,02 0,42±0,03
1 з В. longum 505нш1 0,81 ±0,03" 0,18±0,03** 0,22±0,03** 0,83±0,04* 0,51±0,01* 0,87±0,04*
и и '¡Г s X 1 g. В. bifidum 349к 0,91 ±0,03 0,22±0,04** 0,33±0,04** 0,61±0,02 0,35±0,04* 0,42±0,02
В. bifidum 349инд 0,89±0,01 0,2±0,1** 0,24±0,01** 0,74±0,1* 0,32±0,02* 0,6510,06*
s ¡5 й- В. catenulatum 504к 0,94±0,1 0,31 ±0,05 0,6±0,05 0,94±0,05* 0,75±0,03* 0,38±0,01
В. catenulatum 504инд 0,78±0,02** 0,12±0,06** 0,37±0,01** 0,71±0,03* 0,54±0,07* 0,45±0,07
Примечание. Отсутствие индекса — нейтрал., * синергизм, ** антагонизм (р<0,05).
— 0,25±0,09 едхОПбзо и 0,4±0,08 мкг/млхОП45о соответственно. Таковы были исходные биологические характеристики изучаемых культур.
На следующем этапе опытов было оценено влияния метаболитов интактной бифидофлоры на биологические характеристики изучаемых штаммов (еще один контроль), а в последующем было определено воздействие индуцированной бифидофлоры метаболитами ассоциантов на изучаемые характеристики Е. coli М-17 и ЛЭГМ-18. Результаты представлены в табл.
Оценивая культуру Е. coli М-17, следует отметить негативное отношение к ней (подавление изучаемых признаков) со стороны индуцированной нормофлоры эталонных культур — В. bifidum № 791ИНдИ В. adolescentis МС-42ИНД. Интересно, что в целом сходно повели себя и наши клинические штаммы В. longum 505ИНа, В. bifidum 349инд и В. catenulatum 504ивд, что позволяет отнести Е. coli М-17 к «чужим» видам, хотя она использовалась в коммерческом препарате колибакгерин в прошлом. Что касается результатов оценки культур с использованием интактных метаболитов бифидофлоры в.отношении ассоциантов (промежуточный контроль), то изучение Е. coli ЛЭГМ-18 (без острова патогенности) не вызывало нареканий, что эта культура — «своя» и не имеет признаков «чужеродности», что демонстрирует В. bifidum № 791к, не проявляя выраженного антагонизма. То же можно сказать и о другой эталонной культуре — В. adolescentis МС-42К, проявляющей четко выраженный синергизм в отношении Е. coli ЛЭГМ-18. Не проявляли выраженного антагонизма в отношении кишечной палочки ЛЭГМ-18 и клинические культуры (даже на промежуточном контрольном этапе) В. longum 505к, не говоря уже о В. longum 505ИНд То же следует сказать о В. bifidum 349к и В. catenulatum 504к.
Полученные материалы позволяют заключить, что использование метода межмикробного определения «свой-чужой» позволяет отнести Е. coli М-17 к штаммам, имеющим признаки «чужеродности», тогда как Е. coli ЛЭГМ-18 лишена их.
ОБСУЖДЕНИЕ
Концепция «своего» тесно связана с процессами самоидентификации и саморегуляции биологической системы любого уровня организации. В настоящее время актуальным направлением исследований межмикробных взаимодействий является определение индукции метаболитов микроорганизмов в их ассоциации. Наличие систем, осуществляющих телесенсинг состояния окружающей среды (наличие питательных веществ, хемоатграктэнтов и др.) предполагает, что микроорганизмы координируют свое «поведение» в контексте сложившихся условий. Изменение химических или физических параметров индуцирует продукцию специфических молекул, что позволяет бактериям адаптироваться к внешним условиям [13].
Проведенные ранее эксперименты по взаимодействию микроорганизмов в ассоциации наводят на мысль, что в регуляции межмикробных взаимоотношений при функционировании микросимбиоценоза важную роль играют метаболиты, оказывающие регуляторное действие на биологические свойства микросимбионтов [3].
В данной работе были выявлены особенности регуляторного влияния в отношении модельных штаммов Е. coli М-17 и Е. coli ЛЭГМ-18 как у бифидобак-терий из контрольных проб, так и у индуцированных метаболитами тест-культур, заключающиеся в преимущественном усилении исследуемых биологических характеристик у Е. coli ЛЭГМ-18 и подавлении у Е. coli М-17, которые усиливались или появлялись у индуцированных культур бифидобактерий. По-видимому, наблюдаемые различия при действии штаммов Е. coli, различающихся по наличию генотоксин-кодирующего острова патогенности, могут быть связаны с много-
функциональной ролью низкомолекулярных пептид-поликетидных соединений, тесно связанных с системами сидерофоров [11]. Известно, что эти молекулы имеют широкое адаптивное значение для множества микроорганизмов в условиях конкуренции за ионы многовалентных металлов [4, 6], детекция которых, таким образом, может играть важную роль в межвидовой коммуникации бактерий в системе распознавания «свой-чужой». Полученные результаты свидетельствуют, что данные низкомолекулярные пептид-поликетидные соединения могут являться одними из кандидатов на роль маркеров «чужеродности» микросимбионтов, значимых при микробном распознавании, что требует дальнейших исследований в этом направлении.
Кроме того, учитывая тот факт, что в экспериментах in vitro нами были использованы эталонные штаммы бифидобактерий, являющиеся производственными культурами пробиотиков, полученные данные открывают перспективу использования микробного распознавания «свой-чужой» в качестве базового метода при отборе пробиотических препаратов и штаммов микроорганизмов для создания новых синбиотических композиций.
Работа выполнена при грантовой поддержке фундаментальных исследований УрО РАН — проект № 15-5-4- 7«Роль бифидофлоры в формировании гомеостаза человека» и проект № 15-3-4-36 «Механизмы микробной регуляции ассоциативного симбиоза при инфекции»; фонда РГНФ — проект №16-16-56004«Клинико-микробиологическое обоснование новых подходов к профилактике развития патологии опорно-двигательного аппарата на основе изучения их факторов риска у детей Оренбуржья».
ЛИТЕРАТУРА
1. Бондаренко В.М., Фиалкина C.B. Наличие генов генотоксина, ассоциированных с pks островом патогенности, у пробиотического штамма Escherichia coli M -17. Журн. микро-биол. 2012, 5:25-27.
2. Бухарин О.В., Перунова Н.Б. Микробное распознование «свой-чужой» в условиях кишечного микросимбиоценоза человека. Журн. микробиол. 2011,6:46-51.
3. Бухарин О.В., Перунова Н.Б. Микросимбиоценоз. Екатеринбург: УрО РАН, 2014.
4. Бухарин О.В., Сгибнев A.B. Влияние метаболитов коринебактерий на антагонистиче-скую активность НгОг-продуцирующих лактобацилл. Журн. микробиол. 2012, 4: 48-51. - .
5. Марков A.B., Куликов А.М. Гипотеза «иммунологического тестирования» партнеров — системы распознавания «своих» и «чужих» в исторической перспективе. Известия РАН. Серия биологическая. 2006,4: 389-403.
6. Сгибнев A.B. Механизмы выживания бактерий в условиях окислительного стресса и дефицита ионов железа. Журн. микробиол. 2006,4:20-22.
7. Gibbs К. A., UrbanowskiM.L., GreenbergE.P. Genetic determinants of self identity and social recognition in bacteria. Science. 2008,321 (5886): 256-259.
8. Johnson J.R., Johnston В., Kuskowski M.A et al. Molecular epidemiology and phylogenetic distribution of the Escherichia coli pks genomic island. J. Clin. Microbiol. 2008,46 (12): 3906-3911.
9. Jousime-Somers H., Summanen P. et al. Anaerobic Bacteriology Manual. Star Publishing; 2002.
10. Lypez-Larrea С. (ed.). Seifand nonself. Landes Bioscience and Springer Science+Business Media. Adv. Experiment. Med. Biology. 2012, 738.
11. Martin P., Marcq I., Magistro G. et al. Interplay between siderophores and colibactin genoto-xinbiosynthetiepathways in Escherichia coli. PLoSPathog. 2013,9(7):el003437.doi:10.1371/ joumal.ppat. 1003437.
12.Nougayrède J.P., Homburg S., Taieb F. et al. Escherichia coli induces DNA double-strand breaks in eukaryotic cells. Science. 2006,313 (5788): 848-851.'
13. RouxA., PayneS.M., Gilmore M.S. Microbial telesensing: probing the environmentforfriends, foes, and food. Cell Host Microbe. 2009,6 (2): 115-124.
14. Shank A. E., Kolter R. New developments in microbial interspecies signaling. Curr. Opin. Microbiol. 2009, 12 ( 2): 205-214.
15. Wenren L. M., Sullivan N .L., Cardarelli L. et al. Two independent pathways for self-recognition in proteus mirabilis are linked by type Vl-dependent export. mBio. 2013, 4 (4): e00374-13. doi: 10.1128/mBio.00374-13.
Поступила 12.03.16
Контактная информация: Бухарин Олег Валерьевич, д.м.н., проф., 460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532)77-54-17
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016
С.Б.Чекнёв, Е.И.Вострова, МЛ.Сарычева, A.B.Вострое
ТОРМОЖЕНИЕ РОСТА БАКТЕРИЙ В КУЛЬТУРАХ STAPHYLOCOCCUS AUREUS И PSEUDOMONAS AERUGINOSA КАТИОНАМИ МВДИ И ЦИНКА, ПРИМЕНЕННЫМИ В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ
Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, Москва
Цель. Оценка антибактериального действия связанных белками у-глобулиновой фракции и свободных катионов меди и цинка, примененных в культурах S.aureus и Р. aeruginosa в физиологических (микромолярных) концентрациях. Материалы и методы. Суточную культуру бактерий S.aureus или P.aeruginosa переводили с агара в физиологический раствор и готовили суспензию клеток, содержавшую ориентировочно 103 — 104 КОЕ/мл. В суспензию вносили образцы металлокомплексов у-глобулина с катионами меди или цинка (белка 30 или 45 мкг/мл), контрольные у-глобулины (30 или 45 мкг/мл) и солевые растворы меди или цинка, содержание катионов в которых соответствовало количеству металла, связавшегося с белком на этапе получения металлокомплексов (75 нг/мл). Суспензии инкубировали при 37°С в течение 6 час, через каждые 2 час производя отбор проб и подсчет КОЕ в соответствии с принятым микрометодом. По окончании инкубации (6 ч наблюдения) суспензии переводили в питательный бульон, термостати-ровали в течение суток при 37°С, после чего оценивали прозрачность питательного бульона в сравнении с контрольным (стерильным). Результаты. Начиная с 3 часа наблюдения в культуре S.aureus обнаруживается токсическое действие катионов цинка и меди. Жизнеспособные бактерии отсутствуют в культуре с цинком спустя 6 час, с медью — спустя 4 час инкубации. Связавший катионы меди у-глобулин на сроках 4 и 6 час инкубации на 11,9 — 33,0% (р<0,05 — 0,1) снижает количество жизнеспособных клеток в сравнении с контрольным белком. В культуре P.aeruginosa токсическое действие катионов меди проявляется сразу же после инициации культуры и приводит к реализации полного бактерицидного эффекта спустя 4 час наблюдения. Катионы цинка подобными свойствами не обладают. Связавший катионы меди у-глобулин на сроках 4 и 6 час инкубации на 19,3 — 25,8% (р<0,001) снижает количество жизнеспособных клеток в сравнении с контрольным белком. Заключение. Поддерживаемые в физиологическом растворе бактерии S.aureus подвержены токсическому действию физиологических (микромолярных) концентраций свободных катионов меди и цинка, а также катионов меди, связанных человеческим сывороточным у-глобулином. В тех же условиях бактерии P.aeruginosa испытывают токсическое воздействие катионов меди (но не цинка) как свободных, так и связанных человеческим сывороточным у-глобулином. При этом в присутствии свободных катионов меди в культурах S.aureus и P.aeruginosa реализуется полный бактерицидный эффект.
Журн. микробиол., 2016, № 3, С. 9—18
Ключевые слова: антибактериальное действие, медь, цинк, S.aureus, P.aeruginosa
