CC BY
25ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
_' • • -_■__■ • ч
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
О.В.Бухарин, Е.В.Иванова, Н.Б.Перунова, И.А.Никифоров
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ГРУППЫ БИФИДОФЛОРЫ КИШЕЧНОЙ МИКРО-БИОТЫ В АССОЦИАТИВНОМ СИМБИОЗЕ ЧЕЛОВЕКА
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург
Цель. Определение функциональных групп бифидофлоры толстого кишечника человека на основе анализа особенностей спектра метаболитов, протеома, биопрофиля, им-мунорегуляторных свойств и способности проводить дифференцировку «свой-чужой» среди ассоциантов. Материалы и методы. Материалом служили 260 штаммов бифидобак-терий, выделенных из 122 кишечных микросимбиоценозов. Экспериментальные исследования проводились с использованием бактериологических, хроматографического и иммунологических методов. Статистическая обработка материала выполнена средствами пакета Statistica 10.0 с использованием к-кластерного анализа и дискриминантного метода. Результаты. В результате работы определены 3 кластера, содержащих штаммы различных видов бифидобактерий. Первый кластер был представлен В. bifidum и характеризовался наличием антипептидной активности штаммов в отношении FNO-a и INF-y, IL-10. Во втором кластере преобладали культуры В. longum, где значимыми были параметры системообразующего фактора микросимбиоценоза, способность к микробному распознаванию, антагонистическая активность и продукция уксусной кислоты. В третьем кластере видовой состав бифидобактерий был разнообразен, а информативными тестами явились — продукция штаммами масляной, капроновой кислот и их изоформ. Заключение. Ключевая функция бифидофлоры в регуляции гомеостаза кишечного биотопа реализуется за счет образования функциональных кластеров, среди которых первая группа участвует в формировании цитокинового баланса, вторая — ответственна за дискриминацию ассоциативной микробиоты и прямую защиту биотопа от патогенов, а третья необходима для поддержания барьерной метаболической функции энтероцитов в толстом кишечнике человека.
Журн. микробиол., 2018, № 1, С. 3-9
Ключевые слова: бифидобакгерии, метаболический профиль, персистенция, цитокины, микробное распознавание «свой-чужой», штаммоспецифичность, ассоциативный симбиоз, гомеостаз
O.V.Bukharin, E.V.Ivanova, N.B.Perunova, LA.Nikiforov
FUNCTIONAL GROUPS OF BIFIDOFLORA OF INTESTINAL MICROBIOTA IN ASSOCIATIVE SYMBIOSIS OF HUMAN
Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia
Aim. Aim of the research is the identification of functional groups of human gut bifidoflora based on analysis of the spectrum of metabolites features, proteome, bioprofile, immunoregula-tory properties and the ability to differentiate «self/non-self» among the associative microbiota. Materials and methods. The materials are 260 strains of bifidobacteria isolated from 122 intestinal microsymbiocenoses. Experimental studies were carried out using bacteriological, chromatographic and immunological methods. Statistical processing of material is carried out by means of the package Statistica 10.0 using of k-cluster analysis and discriminant method. Results. As a result of the work, 3 clusters containing strains of various types of bifidobacteria were identified. The first
cluster was represented by B. bifidum and was characterized by the antipeptide activity of the strains with respect to FNO-a and INF-y, IL-10. In the second cluster of the B. longum culture predominated, where the parameters of the backbone factor of microsymbiocenosis, the ability to microbial recognition, antagonistic activity and production of acetic acid were significant. In the third cluster the species composition of bifidobacteria was diverse and products of butyric, cap-roic acids and their isoforms were the informative tests. Conclusion. The key function of bifido-flora in the regulation of the homeostasis of the intestinal biotope is realized by the formation of functional clusters, among which the first group participates in the formation of the cytokine balance, the second group is responsible for the discrimination of associative microbiota and direct protection of the biotope from pathogens, and the third is necessary to maintain the barrier metabolic function of enterocytes in the human large intestine.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2018, No. 1, P. 3-9
Key words: bifidobacteria, metabolic profile, persistence, cytokines, microbial «self/non-self» discrimination, strain specifity, associative symbiosis, homeostasis
ВВЕДЕНИЕ
Вопрос о значении бифидобактерий для организма человека был поднят основоположником русской бактериологии И.И.Мечниковым и его школой на рубеже прошлого столетия. Дальнейшие исследования по изучению биологии бифидобактерий позволили установить у микроорганизмов данной группы широкий спектр антимикробных соединений, определяющих их участие в защите биотопа толстого кишечника от патогенов [8, 11]. Показано значение метаболических функций бифидофлоры, восполняющих недостающие звенья метаболизма макропартнера (хозяина) [6, 9]. В последнее время активно разрабатывается иммунотропная активность бифидобактерий, их способности формировать колонизационную резистентность организма, регулируя гомеостаз кишечной микробиоты за счет подавления воспалительных реакций и апоптоза [10, 15].
Вместе с тем, вопрос о понимании физиологической роли, особенностей функционирования бифидофлоры в условиях кишечного микросимбиоцено-за, направленных на поддержание гомеостаза микробиоты и макропартнера, остается открытым. К настоящему времени накоплены убедительные материалы штаммовой специфичности бифидофлоры, определяющей различия функциональной активности культур в условиях межмикробного общения. Так, в ряде работ различные эффекты пробиотических бифидобактерий связывают со штаммоспецифическими особенностями иммуномодулирующего действия [5, 7] и метаболической активностью бактерий [12]. Материал, полученный нами [2], позволил при изучении белкового профилирования бифидофлоры, ее антагонистической активности и способности влиять на ассоциативную микробиоту, выявить, наряду с общностью штаммов, и различия между ними внутри вида. Не исключено, что оценивать физиологический потенциал бифидобактерий необходимо не только по их видовой принадлежности, но и, возможно, по выявлению функциональных признаков микроорганизмов, подсказать природу которых может кластерная группировка бактерий.
В связи с этим, целью работы было определение функциональных групп бифидофлоры толстого кишечника человека на основе анализа особенностей спектра метаболитов, протеома, биопрофиля, иммунорегуляторных свойств и способности проводить дифференцировку «свой-чужой» среди ассоциантов,
позволяющих выявлять особенности формирования функциональных кластеров доминантов при регуляции гомеостаза толстого кишечника человека.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования послужили 260 штаммов бифидобактерий, выделенных из 122 кишечных микросимбиоценозов при обследовании лиц в возрасте от 1 года до 45 лет на дисбиоз толстого кишечника. Основным методологическим принципом работы явился комплексный симбиотический подход для изучения роли бифидофлоры в ассоциативном симбиозе человека [1]. Авторами проведены эксперименты in vitro с использованием бактериологического, масс-спектрометрического, хроматографического, иммунологического методов, что позволило представить комплексную характеристику исследуемых штаммов бифидобактерий. В работе были оценены параметры системообразующего фактора (СОФ) микросимбиоценоза (ростовые свойства
— lg ПМО, антилизоцимная активность — AJIA и биопленкообразование — БПО доминанта); персистентные свойства (антииммуноглобулиновая — АИГА и антилактоферриновая — АЛфА активность); метаболический профиль (спектр и уровень уксусной — УК, пропионовой — ПК, масляной — МК, изо-масляной — иМК, валериановой — ВК, капроновой — КК и изокапроновой
— иКК) кислот и масс-спектр белков бифидобактерий.
Материалы по взаимодействию бифидобактерий с ассоциативным звеном микросимбиоценоза включили исследования: антагонистической активности (АА) бифидофлоры, ее способности к микробному распознаванию «свой-чужой», где в качестве параметров были использованы значения дискрими-нантных функций Д1 (распознавание «своего» микросимбионта) и Д2 (распознавание «чужого» микросимбионта) [3]. Раздел работы по изучению особенностей взаимодействий бифидобактерий с системой врожденного и адаптивного иммунитета макропартнера включал результаты изучения способности метаболитов доминантов изменять продукцию (ПЦ) про- (IFN-y, TNF-a, IL-17, IL-8, IL-6) и антивоспалительных (IL-10, IL-IRa) цитокинов. Данные исследования были проведены с помощью иммуноферментного анализа на модели перитонеальных макрофагов мышей-гибридов (СВАхС57В16) F1 и мононуклеаров периферической крови здоровых людей (доноров). Антипептидная активность (АПА) бифидобактерий оценивалась при соинку-бировании супернатантов микроорганизмов с рекомбинантными цитокинами (FNO-a, INF-y, IL-6, IL-10, IL-17, IL-IRa).
Выявление трех кластеров было осуществлено при помощи k-метода кластерного анализа с последующим использованием дискриминантного анализа для определения значимых параметров биологических свойств исследуемых штаммов бифидобактерий. Статистическая обработка материала выполнена средствами пакета Statistica 10.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На первом этапе при поиске оптимального уровня кластеризации анализировали число и состав кластеров при разных значениях метрики расстояний, отложенных вдоль вертикальной оси полученной дендрограммы. Оптимальной считалась такая межкластерная дистанция, при которой частотное распределение штаммов в соответствующих кластерах было бы максимально ассимметричным. В результате этой работы определились 3 кластера, содержащих штаммы различных видов бифидобактерий.
Д2 19™°УК
„„ ЬдПМО Д2 УК
АПАШИа
АПА11_10
Г АПАРМОа АПА1ибАП1МРТ
АПАИ6 АП1МР?
АЛФА АИГА АПАР1МОа
В
Д2 ЬдПМО
ИЗОМК
ПЦИ17 ПЦ11-Жа ПЦ11.10 ПЦИ6 ПЦРЫОа ПЦ1ЫРу
АПАИ17 АЛА1ЬШа
АПА1И0
ИЗОКК
АЛА
АПА!1_6 АП1ЫРу
АЛФА АИГА АПАРЫОа
Рис. 1. Диаграмма биологических характеристик кластерной группы 1 (А), группы 2 (Б) и группы 3(В).
ПМО — показатель микробной обсеменен-ности в АЛА — антилизоцимная активность, БГХО — биопленкообразование, Д1 — значения дискриминантных функций микробного распознавания «своих» ассоциантов, Д2 — значения дискриминантных функций микробного распознавания «чужих» ассоциантов, АА — антагонистическая активность, УК—уровень уксусной кислоты, ПК — пропионовой, МК — масляной, иМК — изомасляной, ВК — валериановой, КК — капроновой, иМК — изокапроновой кислот, АИГА — антииммуноглобулиновая, АЛфА — антилактоферриновая, АПА — антипептидная активность в отношении РЫО-а, ЮТ-у, И.-6, 1Ь-10, И-17,II,-Ша, ПЦ — способность влиять на продукцию ПЮ-а, ЮТ-у, П.-6,1Ь-10,11-17, П.-1 К а мононуклеарами перефирической крови здоровых людей (доноров).
Однако природа такой группировки и причины наблюдаемой кластеризации и формирование групп штаммов для каждой из них не были очевидными. Уточнение этих вопросов легло в основу второго этапа анализа, состоящего в изучении физиологической специализации рассматриваемых кластерных групп с помощью к-метода кластерного анализа, который вычислял средние значения признаков по каждой из трех групп. Соответствующие спайдер-диаграммы признаков для каждой группы приведены на рис. 1, где значения каждого признака вычислялись как средние для каждого из к-кластеров и сравнивались для интерпретации процессов, определяющих физиологическую специализацию каждого кластера.
В результате анализа физиологической специализации рассматриваемых кластерных групп были установлены виды-лидеры и информативные критерии, значимые при их формировании. Так, первый кластер был представлен на 52±1,2% от выборки штаммами, принадлежащими к виду В. ЫЯс1ит. Наиболее значимыми тестами для первой группы (рис. 1 А) явились свойства, характеризующие способность метаболитов бифидобактерий проявлять антипептидную активность в отношении маркерных провоспалительных цитоки-нов ТЫ (ШИ-у) и ТИ2 (ТОТ-а), а также регуляторного цитокина Тг1(1Ь-10), включая и стимуляцию его продукции через иммуноциты (ПЦ 1Ь-10).
Выявление признаков, характеризующих способность бифидобактерий регулировать баланс про- и противовоспалительного цитокинов, как информативных показателей штаммов из 1 кластера, позволила определить роль В. bifídum в формировании иммунного гомеостаза через цитокиновый профиль хозяина. Известно, что бифидобактерии посредством изменения концентрации цитокинов в микроокружении клеток способны поддерживать цитокиновый гомеостаз и формировать необходимые условия, в которых реализуется созревание и поляризация дендритных клеток с дальнейшей направленной активацией эффекторов адаптивного иммунитета [4].
Во втором кластере было установлено преобладание вида бифидобактерий В. longum (в 64± 1,5% случаев). Существенная роль среди всех анализируемых свойств бифидобактерий принадлежала семи параметрам (рис. 1Б), характеризующим участие доминантов в формировании вектора ассоциативного симбиоза человека — микросимбиоценоза. Значимыми были такие базовые характеристики микросимбионтов как репродуктивная функция (размножение, lg ПМО) и адаптационный потенциал (антилизоцимный тест и образование биопленок) бактерий. Кроме того, важными явились способность бифидобактерий осуществлять микробное распознавание «свой-чужой» (Д1 /Д2) и проявлять антимикробный эффект в отношении патогенов (антагонистическая активность и способность доминантов синтезировать уксусную кислоту). Известно, что в антимикробном эффекте бифидофлоры, помимо бакте-риоцинов, имеют значение карбоновые кислоты. Так, ацетат проявляет токсическое действие в отношении ряда патогенов (сальмонеллы, энтероге-моррагическая кишечная палочка, листерии, клостридии) за счет диффузии короткоцепочечных жирных кислот внутрь клеток, подавления их роста и процессов деления бактериальной клетки [13, 14].
Физиологическая специализация штаммов В. longum второго кластера, направленная на защиту биотопа и дискриминацию патогенов, оказалась значима в формировании кишечного гомеостаза человека. Первичная дискриминация «чужеродного материала» бифидобактериями — инициальный этап последующего «сигналинга» в регуляции иммунного гомеостаза хозяина, где первичный отбор микросимбионтов осуществляют преимущественно представители В. longum [3].
В третьем кластере видовой состав бифидофлоры был более разнообразный (В. bifídum, В. longum, В. adolescentis, В. catenulatum, В. pseudocatenulatum, В. breve, В. infantis), а частотное распределение видов варьировало от 4 % до 28%. При оценке информативных параметров, определяющих вклад штаммов бифидобактерий в формирование третьего кластера (рис. 1В), обращает на себя внимание участие свойств, характеризующих способность доминантных бактерий к синтезу масляной, изомасляной, валериановой, капроновой и изо-капроновой кислот. По литературным данным выявленные короткоцепо-чечные жирные кислоты имеют значение в энергетическом обмене и поддержании барьерной функции энтероцитов за счет увеличения синтеза соединительных белков (клаудин и окклюдин) [13].
ОБСУЖДЕНИЕ
Рассмотрение бифидобактерий с позиции ассоциативного симбиоза человека позволило приблизить нас к пониманию физиологической роли бифидофлоры, направленной на поддержание гомеостаза человека. Проведенный анализ комплекса биологических свойств, отражающих био-
Рис. 2. Физиологическая роль бифидофлоры в защите кишечного биотопа.
коммуникативную активность бифидофлоры при формировании симбио-тических отношений с организмом человека, позволил выявить функциональные кластеры бифидобактерий, характеризующие их способность участвовать в регуляции векторов «доминант-ассоциант», «доминант-макропартнер» при формировании гомеостаза биотопа толстого кишечника человека.
Полученные материалы позволили определить, что ключевая функция бифидофлоры в регуляции гомеостаза кишечного биотопа реализуется за счет образования функциональных кластеров, среди которых первая группа участвует в формировании цитокинового баланса, вторая — ответственна за микробное «распознавание» ассоциативных микросимбионтов и прямую защиту биотопа от патогенов, а третья необходима для поддержания барьерной метаболической функции энтероцитов в толстом кишечнике человека (рис. 2).
Выделение физиологических групп бифидофлоры может пояснить особенности структурной организации и функционирования консорциумов, представленных в кишечном микросимбиоценозе различными видами бифидобактерий, где лидирующие позиции занимают два вида: В. 1оп§иш и В. ЫПс1ит. Как показали исследования для представителей В. ЫАёит, превалирующих в первом кластере, характерна физиологическая специализация, направленная на поддержании гомеостаза кишечной микробиоты через ци-токиновый профиль хозяина. Тем самым формируется цитокиновое микроокружение дендритной клетки, которая, в свою очередь, направляет диффе-ренцировку и созревание наивных СЕ)4+ Т-лимфоцитов по пути образования регуляторных Т-клеток, контролирующих формирование иммунного гомеостаза биотопа толстого кишечника человека [2, 4].
Поддерживаемый цитокиновый баланс обеспечивает условия оптимального функционирования кишечного биотопа в условиях высокой антигенной нагрузки. И здесь приобретают значение представители В. 1оп§ит, лидирующие во втором кластере, реализующие защитную функцию и способность бифидобактерий распознавать «свои» и «чужие» штаммы ассоциантов, регулируя формирование и функционирование микросимбиоценоза толстого кишечника человека. Учитывая, что первичная дискриминация «чужеродного материала» бифидобакгериями — инициальный этап последующего «сиг-налинга» в регуляции иммунного гомеостаза хозяина.
Формирование гистологического барьера, реализуемое штаммами бифидобактерий третьего кластера, является важной физиологической функцией
нормофлоры, сохраняющей гомеостаз биотопа толстого кишечника, в условиях которого осуществляется дискриминация патогенов и поддержание баланса про- и противовоспалительных цитокинов. Таким образом, способность бифидофлоры объединяться в функциональные кластеры может способствовать выяснению механизмов интеграции доминантной микрофлоры (бифи-добактерий) с организмом человека при ассоциативном симбиозе.
Наряду с этим, использование инфектологического подхода в изучении функциональных групп доминантов позволяет расширить круг возможностей клинического использования бифидобактерий: диагностика микроэкологических нарушений биотопа (дисбиоз), разработка критериев для отбора биосовместимых композиций пробиотиков, а также конструирование новых биопрепаратов (про- и синбиотиков) для коррекции дисбиотических нарушений кишечной микробиоты с учетом физиологической «специализации» бифидобактерий.
Работа выполнена при грантовой поддержке фундаментальных исследований по Программе УрО РАН «Фундаментальные науки — медицине», проект № 18-7-8-34 «Биосовместимость микроорганизмов в формировании микросимбиоценоза и создании новых композиций пробиотических препаратов».
ЛИТЕРАТУРА
1. Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Перунова Н.Б., Усвяцов Б.Я., Черкасов С.В. Симбиоз и его роль в инфекции. Екатеринбург, УрО РАН, 2011.
2. Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Иванова Е.В. Бифидофлора при ассоциативном симбиозе человека. Екатеринбург, УрО РАН, 2014.
3. Бухарин О.В., Перунова Н.Б. Микросимбиоценоз. Екатеринбург, УрО РАН, 2014.
4. Бухарин О.В., Иванова Е.В., Перунова Н.Б., Чайникова И.Н. Роль бифидобактерий в формировании иммунного гомеостаза человека. Журн. микробиол. 2015, 6: 98-104.
5. Aires J., Anglade P., Baraige F. et al. Proteomic comparison of the cytosolic proteins of three Bifidobacterium longum human isolates and B. longum NCC2705. BMC Microbiology. 2010, 10: 29.
6. Besten G., van Eunen K., Groen A. et al. The role of short-chain fatty acids in the interplay between diet, gut microbiota, and host energy metabolism. J. Lipid Res. 2013, 54 (9): 23252340.
7. Campana R., van Hemert S., Baffone W. Strain-specific probiotic properties of lactic acid bacteria and their interference with human intestinal pathogens invasion. Gut Pathog. 2017, 9:12.
8. Cheikhyoussef A., Pogori N., Chen H. Antimicrobial activity and partial characterization of bacteriocin-like inhibitory substances (BLIS) produced by Bifidobacterium infantis BCRC 14602. Food Control. 2009,20: 553-559.
9. Ferrario C., Duranti S., Milani C. et al. Exploring amino acid auxotrophy in Bifidobacterium bifidum PRL2010. Front. Microbiol. 2015,6: 1331.
10. Kamada N., Niinez G. Role of the gut microbiota in the development and function of lymphoid cells. J. Immunol. 2013, 190 (4): 1389-1395.
11. Martinez F.A., Balciunas E.M., Converti A. et al. Bacteriocin production by Bifidobacterium spp. A review. Biotechnol. Adv. 2013, 31 (4): 482-488.
12. Milani C., Lugli G.A., Duranti S. et al. Genomic encyclopedia of type strains of the genus bifidobacterium. Appl. Environ. Microbiol. 2014, 80: 6290-6302.
13. Sampson T.R., Mazmanian S.K. Control of brain development, function, and behavior by the microbiome. Cell Host Microbe. 2015, 17 (5): 565-576.
14. Sun Y., O'Riordan M.X.D. Regulation of bacterial pathogenesis by intestinal short-chain fatty acids. Adv. Appl. Microbiol. 2013, 85:93-118.
15. Turroni F., Taverniti V., Ruas-Madiedo P. et al. Bifidobacterium bifidum PRL2010 modulates the host innate immune response. Appl. Environ. Microbiol. 2014, 80 (2): 730-740.
Поступила 27.11.17
Контактная информация: Бухарин Олег Валерьевич, д.м.н., проф., 460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532)77-54-17
