CC BY-ND
30
МАЙ № (242)
33
ц
МЕТОДЫ ПРЕДСКАЗАНИЯ САЙТОВ ПОСТТРАНСЛЯЦИОННОИ МОДИФИКАЦИИ ПРИ ОБРАЗОВАНИИ ЛИПОПРОТЕИНОВ
Е.С. Маракасова1, Е.И. Ярыгина1, А.В.Шибаева2, М.В. Баловнева2, А.Б. Шевелев2*
BIOINFORMATIC TOOLS FOR SEEARCH OF LIPID POSTTRANSLATIONAL
MODIFICATIONS SITES
E.S. Marakasova, E.I. Yarigina, A.V. Shibaeva, M.V. Balovneva, A.B. Shevelev
'ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии», г. Москва 2ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» РАМН, г. Москва
Посттрансляционные модификации (ПТМ) существенным образом сказываются на функционировании, локализации, скорости и способе деградации новосинтезированных белков. Присоединение липидного компонента: миристоила (к N-концу), гликозилфосфатидилинозитола (к C-концу), пренилирование пальмитоилирование по остаткам цистеина приводит к прочному заякориванию липопротеинов в мембранах. Предсказание таких модификаций на основании известной последовательности гена и его продукта является необходимым этапом анализа любого генома, облегчает работу по исследованию функции, локализации и метаболизма конкретных белков. Дана общая характеристика разработанных алгоритмов и программ для идентификации сайтов присоединения липидных компонентов к белкам.
Ключевые слова: липид, посттрансляционная модификация, биоинформатика.
Posttranslational modifications (PTM) are crucial for de novo synthesized proteins because PTMs change proteins and define their future function, localization and degradation. Main lipid modifications such as myristoylation, C-terminal glycosyl phosphatidylinositol anchoring, S-prenylation, S-palmitoylation, lead to increasing of protein affinity to plasmatic membranes. Forecasting of these modifications on the basis of the gene or protein product sequence is prerequisite for exhaustive annotation of recently determined genomic sequences. It facilitates investigation of function, localization and metabolism of certain proteins. In this mini review, commonly available bioinformatics tools for lipid PTMs analysis are surveyed.
Keywords: lipid, posttranslational modification, bioinformatics.
Сокращения
ПТМ — посттрансляционная модификация ЭПР — эндоплазматический ретикулум GPI — гликозилфосфатидилинозитол
Посттрансляционные модификации ново-синтезированных белков играют ключевую роль в регуляции биологии клетки. ПТМ представляют собой энзиматические превращения белков сразу после трансляции мРНК. ПТМ так же способны влиять на физические, химические свойства белков, их активность, локализацию и стабильность [1]. В связи с огромным количеством данных, полученных в результате секвенирова-ния геномов, возникает проблема анализа этих данных, предсказания на их основе структуры и функций белков.
Экспериментальное исследование модификаций тотального протеома клетки остается достаточно сложной, плохо стандартизуемой задачей [2]. Она осложняется высокими требованиями к чувствительности (~5—10 фмоль пептида), плохой растворимостью модифицированных белков и отсутствием рутинных алгоритомов в составе пакетов, используемых для анализа первичных данных MALDI-TOF. Требованию высокой чувствительности хорошо удовлетворяет использование радиоизотопных меток, однако он недостаточно совместим с современными модификациями масс-спектроскопического анализа [3]. Существуют альтернативные методы для изучения ПТМ на основе биохимических методов, основанные на введении меченных активными группами предшественников липид-ных компонентов: изопреноиды, миристоил группы и др. В качестве меток служат флюоро-форы, биотин, фото-кросслинкеры или азид/ алкиновые группировки [4]. Для повышения эффективности введения этих меток в белки
исследуемых клеток необходимо культивировать в присутствии ингибиторов синтеза эндогенных предшественников [5]. Описанные методы позволили создать базы данных достаточного размера, на основании которых разработаны методы предсказания ПТМ [4].
Липопротеины являются важным компонентом плазматической мембраны и мембранных органелл: ЭПР, аппарата Гольджи, митохондрий. Присоединение липидного компонента к белку может происходить на Оконце ^-концевое миристоилирование), С-конце (С-концевая GPI, пренилирование) или независимо от расположения сайта липидирования (Б-миристоилирова-ние, Б-пальмитоилирование). Белок может быть модифицирован одним или несколькими способами одновременно.Модификация типа GPI ориентирует белки ^концом в просвет ЭПР, откуда они направляются Гольджи и далее на внешнюю поверхность клетки. После экспорта белка в ЭПР, часто с помощью сигнального пептида, С-концевой пропептид удаляется и синтезированный ранее GPI липид присоединяется к новому С-концу (так называемый '-сайт). Эта реакция катализируется трансамидазой, находящейся в просвете ЭПР.
Что же касается пренилирования, пальми-тоилирования и миристоилирования, то эти типы модификаций происходят сразу после синтеза вне зависимости от секреции. Примером могут служить Н-, К-ЯаБ белки сразу после синтеза фарнезилируются в цитозоле, после чего они связываются с ЭПР. В ЭПР происходит дальнейший процессинг СААХ региона (отщепле-
34
ЗНиСО
май №5 (242)
Таблица. Программы для предсказания сайтов ковалентного присоединения к белкам гидрофобных групп
ПТМ Биологический объект Название программы Веб сайт (онлайн доступ) Публикация
Миристоилирование Эукариоты, вирусы NMT http://mendel.imp.ac.at/myristate/ [8]
Эукариоты, вирусы, бактерии MYRbase http://mendel.imp.ac.at/myristate/myrbase/ [9]
Нейроны NN predictor http://web.expasy.org/myristoylator/ [10]
Растения Plant-Specific Myristoylation Predictor http://plantsp.sdsc.edu/myrist.html [6]
GPI Эукариоты big-PI Predictor GPI Modification Site Prediction http://mendel.imp.ac.at/sat/gpi/gpi_server.html [11]
Грибы Occurence of potentially GPI modified proteins in fungi http://mendel.imp.ac.at/gpi/fungi/gpi_fungi.html [12]
Растения Occurence of potentially GPI modified proteins in plants http://mendel.imp.ac.at/gpi/plants/gpi_plants.html [13]
Эукариоты KohGPI http://gpi.unibe.ch/ [14]
Пальми-тоилиро-вание Н/А CSS-Palm http://csspalm.biocuckoo.org/ [15]
Прени-лирова-ние Эукариоты PrePS http://mendel.imp.ac.at/sat/PrePS/index.html [16], [17]
ние AAX, метилирование цистеина). После чего K-Ras направляется непосредственно в плазматическую мембрану клетки (механизм не изучен). В аппарат Гольджи с транспортными везикулами передаются H- и N-Ras, где они подвергаются пальмитоилированию с помощью резидентных компонентов PAT и DHHC9. Далее модифицированные H- и N-Ras направляются в плазматическую мембрану по центральному пути секреции [5]^-миристоилирование происходит сразу после отщепления метионина метионинаминпеп-тидазой. N-миристоилирование известно для проапоптического белка BID, где расщепление каспазой 8 открывает скрытый сайт миристоили-рования. В настоящее время миристоилирование обнаружено у 150 различных белков человека [5]. N-концевое миристоилирование возможно при условии, что на N-конце белка располагается глицин. К глицину присоединяется 14-углеродная насыщенная жирная кислота (миристоил группа), эта модификация необратима и катализируется N-миристоилтрансферазой с образованием амидной связи [6]. Сайты миристоилирования консервативны для грибов, высших эукариот и их вирусов. Миристоилирование влияет на передачу сигналов в клетке, запуск апоптоза, воздействует на адресацию белков в процессе секреции [7]. Наиболее изученными примерами сигнальной роли миристоилирования служат белки семейства киназы Src, растительная GTPаза Rab, Са-зависимые протеинкиназы Arabidopsis thaliana и других растений [6].
Наиболее известным пакетом для предсказания сайтов миристоилирования является NMT. Название программы происходит от аббревиатуры «перенос остатка от миристоил-СоА с помощью N-миристоилтрансферазы» [8]. Ее можно использовать для анализа последовательностей аминокислот эукариотических и вирусных белков (табл.). Данная программа позволяет проводить анализ введенной последовательности аминокислот и предсказывать скорость модификации на основании сравнения с известными сайтами узнавания N-миристоилтрансферазы. Сайт узнавания N-миристоилтрансферазы представляет собой 17 а.о., примыкающих к N-концу белка. Этот 17-членный мотив функционально разделяют на три сегмента: первый (а.о. 1—6) представляет собой участок связывания с ферментом; второй (а.о. 7—10) — субстрат NMT, именно здесь происходит модификация; третий (а.о. 11—17) —гидрофильный линкер [7].
Программу тестировали на 22 белках грибов, 368 белках высших эукариот (данные на 2001 г.). Далее, в соответствии с данными SWISS-PORT, были проанализированы еще 234 случая и получены 92 положительных ответа. После чего полученные данные сравнивали с опубликованными данными, и такие данные были получены для 82 белков из тестируемого сета. Среди них 18 было показано с помощью масс-спектроскопического анализа, два — с помощью рентгеноструктурного анализа, 56 — с помощью радиоактивных меток
май № (242)
ЗНфО
35
(3Н)-миристат, два — методами химической моди-'— фикации [7].
Таким образом, точность предсказания сайтов распознавания NMT составила < 9S %. Результат -чт включает в себя адрес сайта присоединения аци-^ ла, аминокислотную последовательность сайта ^ распознавания NMT и вероятность ложнополо-жительного предсказания [Б].
Позднее для аккумуляции результатов предсказания сайтов NMT была создана база данных MYRbase [9], куда были внесены данные по анализу этим алгоритмом всех последовательностей, имеющихся в SWISS-PORT и Genbank [9]. Результаты предсказаний, накопленные в MYRbase, были подвергнуты массовой экспериментальной проверке.
Для предсказания GPI модификаций доступна программа «big-PI Predictor GPI Modification Site Prediction» [11]. Алгоритм основан на определении позиций и предпочтений GPI-трансамидазного комплекса, а также расчета общих физико-химических свойств белка и сайтов взаимодействий (табл. 1). S-пальмитоилирование (альтернативные названия тиоацилирование или S-ацилирование) это обратимая модификация, заключающаяся в присоединении к тиогруппе цистеина 1 б-углеродного насыщенного ацила с образованием тиоэфирной связи. Это превращение осуществляется пальмитоилтрансферазами семейства DHHC. Пальмитолирование характерно для белков нейронов: белки синаптических пузырьков, ионных каналов, гуанозинтрифосфат связывающих белков и многих других. Существует два основных алгоритма для предсказания сайтов S-пальмитоилирования: CSS (Clustering and Scoring Strategy) и NBA (Naïve Bayesian).
Пренилирование — это ПТМ, в которой к С-концевому цистеину ковалентно и необратимо присоединяется фарнезил (С^) или геранилгира-нил (С20) с помощью фарнезилтрансферазы или геранилгеранилтрансферазы I и II соответственно. Для пренилируемых белков характерно наличие СААХ мотива на С-конце, где С-цистеин, А — любая алифатическая аминокислота, Х-любая аминокислота. Пренилированию подвергаются белки Ras, Rab, Rho семейств, белок ядра ламин, CENPE, CENPF, гамма субъединица многих G белков и другие. Популярным инструментом для предсказания сайтов пренилирования зарекомендовал себя алгоритм PrePS (Prenylation Prediction Suite) [1б]. PrePS анализирует С-концевые а.о., сопоставляя их с ранее описанными консенсусами белков [17]. Эта программа использует так называемую PRENbase. PRENbase включает в себя S 410 белков, которые были предсказаны как субстраты узнавания фарнезилтрансферазы или геранилгеранилтрансферазы I и II.
Работа выполнена при финансовой поддержки Министерства образования и науки РФ в рамках Федеральных целевых программ Гос. Контракт № 14^12.11.0033 от 2013 г. и Соглашения № S492 от 07.09.2012.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Farley A. R., Link A. J. Identification and quantification of protein posttranslational modifications // Methods in enzymology. 2009. Vol.463. № P. 725—763.
2. Tate E. W. Recent advances in chemical proteomics: exploring the post-translational proteome // Journal of chemical biology. 2008. Vol. 1. № 1—4. P. 17—26.
3. Mann M., Jensen O. N. Proteomic analysis ofpost-translational modifications //Nature biotechnology. 2003. Vol. 21. № 3. P. 255—261.
4. Charron G., "Wilson J., Hang H. C. Chemical tools for understanding protein lipidation in eukaryotes //Current opinion in chemical biology. 2009. Vol. 13. № 4. P. 382—391.
5. Resh M. D. Targeting protein lipidation in disease //Trends in molecular medicine. 2012. Vol. 18. № 4. P. 206—214.
6. Podell S., Gribskov M. Predicting N-terminal myristoylation sites in plant proteins //BMC genomics. 2004. Vol. 5. № 1. P. 37.
7. Maurer-Stroh S., Eisenhaber B., Eisenhaber F. N-terminal N-myristoylation of proteins: refinement of the sequence motif and its taxon-specific differences //Journal of molecular biology. 2002. Vol. 317. № 4. P. 523-540.
8. Maurer-Stroh S., Eisenhaber B., Eisenhaber F. N-terminal N-myristoylation of proteins: prediction of substrate proteins from amino acid sequence //Journal of molecular biology. 2002. Vol. 317. № 4. P. 541—557.
9. Maurer-Stroh S., Gouda M., Novatchkova M., Schleiffer A., Schneider G., Sirota F. L., Wildpaner M., Hayashi N., Eisenhaber F. MYRbase: analysis of genome-wide glycine myristoylation enlarges the functional spectrum of eukaryotic myristoylated proteins //Genome biology. 2004. Vol. 5. № 3. P. 21.
10. Bologna G., Yvon C., Duvaud S., Veuthey A. L. N-Terminal myristoylation predictions by ensembles of neural networks // Proteomics. 2004. Vol. 4. № 6. P. 1626—1632.
11. Eisenhaber B., Bork P., Eisenhaber F. Prediction of potential GPI-modification sites in proprotein sequences //Journal of molecular biology. 1999. Vol. 292. № 3. P. 741—758.
12. Eisenhaber B., Schneider G., Wildpaner M., Eisenhaber F. A sensitive predictor for potential GPI lipid modification sites in fungal protein sequences and its application to genome-wide studies for Aspergillus nidulans, Candida albicans, Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe //Journal of molecular biology. 2004. Vol. 337. № 2. P. 243—253.
13. Eisenhaber B., Wildpaner M., Schultz C. J., Borner G. H., Dupree P., Eisenhaber F. Glycosylphosphatidylinositol lipid anchoring of plant proteins. Sensitive prediction from sequence- and genome-wide studies for Arabidopsis and rice // Plant physiology. 2003. Vol. 133. № 4. P. 1691 — 1701.
14. Fankhauser N., Maser P. Identification of GPI anchor attachment signals by a Kohonen self-organizing map // Bioinformatics (Oxford, England). 2005. Vol. 21. № 9 . P. 1846—1852.
15. Ren J., Wen L., Gao X., Jin C., Xue Y., Yao X. CSS-Palm 2.0: an updated software for palmitoylation sites prediction // Protein engineering, design & selection : PEDS.2008. Vol. 21. № 11. P. 639—644.
16. Maurer-Stroh S., Eisenhaber F. Refinement and prediction of protein prenylation motifs //Genome biology. 2005. Vol. 6. № 6. P. 55.
17. Maurer-Stroh S., Koranda M., Benetka W., Schneider G., Sirota F. L., Eisenhaber F. Towards complete sets offarnesylated and geranylgeranylated proteins //PLoS computational biology. 2007. Vol. 3. № 4. P. 66.
Контактная информация:
Шевелев Алексей Борисович, тел.: 8 (495) 841-90-50, е-mail: shevel_a@hotmail.com
Contact information: Shevelev Alexej phone: 8 (495) 841-90-50, е-mail: shevel_a@hotmail.com
