CC BY
78
ДИАГНОСТИКА
Проведен сравнительный анализ двух методов выявления сенсибилизации реципиентов к HLA -традиционного серологического метода, основанного на лимфоцитотоксическом тесте и метода мультиплексного анализа с детекцией результатов исследования на платформе Luminex.
Выявлены высокая чувствительность и информативность метода определения антител к HLA на платформе Luminex.
Ключевые слова: антитела к HLA, лимфоцитотоксический тест, мультиплексный анализ на платформе Luminex.
Methods to determine the sensitization to HLA in the recipients on the waiting list for organ transplantation
N.V. Borovkova, N.V. Doronina, N.A. Mushta
Sklifosovsky Research Institute for Emergency Medicine, Moscow
The comparative analysis of two methods of exposure of sensitization of recipients to HLA is conducted - traditional serum method, based on a limphocytotoxicity test, and the method of multiplexed analysis with the detection of results using the Luminex platform.
A high sensitiveness and informing of method of antibodies determination to HLA using the Luminex platform is demonstrated.
Key words: antibodies to HLA, limphocytotoxicity test, multiplexed analysis, the Luminex platform.
Методы определения сенсибилизации к HLA у реципиентов из «листа ожидания» на трансплантацию органов
Н.В. Боровкова, Н.В. Доронина, H.A. Мушта
НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, Москва Наталья Валерьевна Боровкова, e-mail: borovkovanv@yandex.ru
Введение
Антитела к HLA - это иммуноглобулины класса G. образование которых связано с предшествующей сенсибилизацией несовместимыми антигенами главного комплекса гистосовмсстимости в результате гемотрансфузий, прошлых трансплантаций. беременностей. Антитела к HLA обнаруживаются у 30-35 % пациентов из «листа ожидания» трансплантации органов [1, 2]. В последние годы в литературе появились сообщения об участии антител к MICA в развитии нарушений функции почечного аллотрансплантата. Гены MIC [3] (МНС class I-related chain A and В) располагаются в области HLA-B генов I класса на 6-й хромосоме. Реципиенты, сенсибилизированные к HLA, требуют более тщательного подбора донорских органов, а также применения активных методов десенсибилизации на этапах подготовки к трансплантации органа и в раннем послеоперационном периоде.
Исследователи отмечают, что донор-неспецифи-ческие антитела к НЬА являются одним из факторов риска криза отторжения, дисфункции трансплантата в раннем послеоперационном периоде и оказывают влияние на выживаемость трансплантата в более позднем периоде [3—5].
Определение антител к НЬА в сыворотке больного, которому планируется трансплантация органа, проводят при постановке в лист ожидания. В дальнейшем исследование пред-существующих антител к НЬА рекомендуется выполнять 1 раз в 3-6 мес.
Существуют разные методы выявления антител к НЬА. В основе традиционного серологического метода лежит комплементозави-симый лимфоцитотоксический тест. В последние годы широкое распространение получили методы мультиплексного анализа, с детекцией результатов с помощью ИФА или по технологии Ьиттех (х-МАР технология).
ТРАНСПЛАНТОЛОГИЯ 4'11
Целью настоящей работы является сравнительная оценка методов выявления сенсибилизации реципиентов к НЬА.
Материалы и методы
Обследовано 20 сывороток крови реципиентов (10 мужчин и 10 женщин в возрасте от 25 до 56 лет), ожидающих трансплантацию почки в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского.
Для определения антител к НЬА у пациентов серологическим методом, проводили лим-фоцитотоксический тест с 30 — 60 образцами лимфоцитов доноров крови [6]. К сывороткам крови реципиентов добавляли лимфоциты доноров. Лимфоциты выделяли из крови с консервантом (ЭДТА) центрифугированием на градиенте ЬушрЬо1у1е-Н. Количество выделенных лимфоцитов оценивали в камере Горяева. Лимфоцитотоксический тест (ЛЦТТ) проводили в плашках Терасаки. В плашку с образцами сыворотки реципиентов добавляли по 1 мкл лимфоцитов доноров. После 30 минутной инкубации при 37 °С в каждую лунку вносили 5 мкл комплемента кроличьего. Инкубировали при температуре 37 °С еще 60 мин. Затем лимфоциты окрашивали эозином и клетки фиксировали 20 % формалином. Через 30 мин в инвертированном микроскопе по окраске ядер (рис. 1) регистрировали количество погибших лимфоцитов. Результат исследования выражали в баллах в зависимости от относительного содержания погибших клеток (табл. 1).
Таблица 1. Оценка результатов лимфоцитотоксического теста
Число погибших Балл Результат
клеток, %
0-10 1 Отрицательный
11-20 2 Сомнительный
21 -50 4 Слабоположительный
51 -80 6 Положительный
81 - 100 8 Резко положительный
Наличие антител к НЬА оценивали по коэффициенту серопозитивности, который представляет собой отношение числа образцов лимфоцитов, вызывающих реакцию от 2 до 8 баллов, к общему числу образцов в панели, выраженное в процентах. Коэффициент серопозитивности 20 % и более определяет высокий риск острого криза отторжения. Время, затраченное на проведения анализа, составляло 3 - 3,5 ч.
Для скрининга антител к НЬА методом мультиплексного анализа с детекцией результатов исследования на платформе Luminex на территории РФ для клинического применения используются реактивы двух фирм One Lambda (США) и GenProbe (США). В исследовании использовались реактивы LABScreen (One Lambda). К 20 мкл сыворотки крови реципиентов добавляли 5 мкл микросфер. После инкубации в темноте в течение 30 мин и двукратной отмывки окрашивали частицы 100 мкл раствора фикоэритрина. Анализ полученных результатов проводили на проточном анализаторе Luminex 200 (рис. 2). Результаты исследования выражали в условных единицах (у.е. . По рекомендациям разработчиков содержание антител к HLA в норме не превышает 1,6 у.е. Время, затраченное на проведение анализа, составило 1,5 -2 ч.
Результаты и обсуждение
У реципиентов традиционным серологическим методом оценивали коэффициент серопозитивности, который отражает риск сверхострого отторжения трансплантата, взятого от случайного донора. Чем этот коэффициент выше, тем сложнее подобрать совместимого донора. У 7 (35 %) из 20 обследованных реципиентов выявлено наличие антител с коэффициентом серопозитивности от 5 до 50 ^с табл. 2).
Таблица 2. Коэффициент серопозитивности (PRA у реципиентов с антителами к HLA. выявленнымь серологическим методом
Коэффициент Количество
серопозитивности реципиентов
< 10 3
10-20 3
>20 1
Таблица 3. Скрининг антител к I и II классам HLA и MICA Варианты выявления Количество
антител реципиентов
Только к I классу HLA 2
К I и II классам HLA 5
К I, II классам HLA и к MICA 3
Параллельно с лимфоцитотоксическим тестом в крови реципиентов определяли антитела к HLA мультиплексным методом с детекцией результатов на платформе Luminex. Выявлено, что у 10 из 20 обследованных реципиентов (50 %)
ДИАГНОСТИКА
:
j
Таблица 4. Сравнительный анализ методов определения антител к HLA
Реципиенты Антитела к HLA (Luminex) Коэффициент серопозитивности (серологический метод)
I класс II класс MICA
R1 187,3 300,0 22,0 0
R2 163,0 0 0 0
R3 190,7 0 3,3 0
R4 118,0 282,7 31,0 15
R5 243,0 179,9 0 5
R6 235,2 0 0 0
R7 112,7 3,0 0 5
R8 132,6 108,2 1,9 20
R9 156,1 276,9 0 10
R10 52,5 72,3 0 50
R11 0 0 0 5
Рис. 1. Отрицательный (а) и положительный результат (б) лимфоцитотоксического теста
а - живые лимфоциты имеют хорошо выраженную округлую форму, слабо окрашенные раствором эозина; б - погибшие лимфоциты имеют неправильную форму, нечёткие очертания границы клетки, хорошо прокрашиваются раствором эозина
определяются антитела к антигенам главного комплекса гистосовместимости. Этот метод позволяют проводить скрининг антител к I, ко II классам HLA и к MICA (табл. 3).
Сравнительный анализ серологического и мультиплексного методов выявления антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости представлен в табл. 4. У 6 реципиентов ант;:тела к HLA определялись как серологичес-ктак и мультиплексным методами. Следует отметить, что только у двух пациентов серологическим методом выявлены антитела с коэффициентом серопозитивности 20 и 50 %. В остальных случаях коэффициент серопозитивности не превышал 10 %, что не оказывало существенного влияния на подбор пары донор-реципиент. В тоже время по данным мультиплексного метода антитела к HLA у этих пациентов многократно
превышали пороговые значения (от 52,0 до 300,0 у.е. при 1,6 у.е. в норме), что требует применения десенсибилизирующей терапии на этапах подготовки к трансплантации и влияет на функцию трансплантата в послеоперационном периоде.
Таким образом, более точным методом определения антител к антигенам главного комплекса гистосовместимости является мультиплексный анализ, основанный на использовании хМАР-технологии (Luminex). Метод основан на использовании панели микросфер, имеющих различные спектральные характеристики и покрытых очищенными HLA антигенами. Это позволяет с максимальной точностью выявить антитела к известным кросс-реактивным группам антигенов I и II классов системы HLA и к MICA антигенам.
Следует отметить, что метод требует оснащения лаборатории современным оборудова-
ТРАНСПЛАНТОЛОГИЯ 4*11
о a ^ ¡>. s a-¡s ¿.в
в
3SBSÏS8SS48BSB--'»»sas==s4îS«aêi5aaas-.s3aa2 «сяйэазвазвавачзчаачйвзеехйаааааеввзаззвзз
H LA
Рис. 2. Отрицательный (а) и положительный результат (б) мультиплексного метода скрининга антител к детекцией на платформе Luminex
а - свечение регистрируется в пределах контрольных значений (линия cutoff) - зелёные столбики; б - свечение регистри руется интенсивнее контрольных значений (выше линии cutoff) - красные столбики
нием. Скрининг антител к НЬА прежде всего дает ответ на вопрос: «есть ли сенсибилизация у реципиента к антигенам главного комплекса гистосовместимости?» Для клиницистов привычнее использовать коэффициент серопозитивнос-ти, отражающий риск сверхострого отторжения трансплантата, взятого от случайного донора.
Традиционный серологический метод имеет ряд существенных недостатков:
1. Ложноположительная реакция за счёт содержания в крови пациентов антител класса ^М (антилимфоцитарные антитела), не оказывающих влияния на приживление трансплантата в отличие от собственно антител класса 1§С.
2. Ложноотрицательная реакция обусловлена нормальным популяционным составом лимфоцитов периферической крови. В суспензии лимфоцитов доля Т-клеток, несущих НЬА I класса, составляет 60 - 80 %, доля В-лимфоцитов,
несущих HLA II класса —10 — 25 %. Содержани погибших B-лимфоцитов составляет 5 - 20 % что по данным лимфоцитотоксического теста (сь табл. 1) расценивается как отрицательный ил: сомнительный результат.
3. Для проведения этого теста требуются лим фоциты, выделенные от 30 - 60 доноров кров с установленными HLA. Жизнеспособност выделенных лимфоцитов должна составлять н менее 80 %.
Заключены
Таким образом, при постановке в «лист ож1< дания» на трансплантацию органа и в пост трансплантационном периоде при определени антител к HLA следует отдавать предпочтена мультиплексному методу с детекцией результг тов исследования на платформе Luminex.
1. HLA and MICA antibodies: further evidence of their impact on graft loss two years after their detection / L.E. Morales-Buenrostro, R. Rodriguez-Romo, de Leo [et al.] // Clin. Transpl. - 2006. -P. 207-218.
2. Clinical and anti-HLA antibody profile of nine renal transplant recipients with failed grafts: donor specific and non-donor-specific antibody development / L.M. Rebellato, M. Ozawa, K.M. Verbanac
Литература
[et al.] // Clin. Transpl. - 2006. -P. 24-253.
3. Detection of HLA and MICA antibodies before kidney graft failure / К. Mizutani, L. Shibata, M. Ozawa [et al.] // Clin. Transpl. - 2006. - P. 255-264.
4. Predicting kidney graft failure by HLA antibodies detection in kidney transplanted patients / R. Bardi, B. Boujemaa, Ch. Kallala [et al.[ // Tissue Antigens. - Vol. 77. - Is. 5. - 2011. -
P. 443-444.
5. HLA-антитела и их значение при трансплантации почки /М.Ш. Хубути* Н.В. Боровкова, Р.В. Сторожев [и др.] / Трансплантология. - 2010. - № 3-4. -С. 32-36.
6. Zachary, A. ASHI Laboratory Manua / A. Zachary // American Society for Histocompatibility and Immunogenetics - 2 nd. - NY, 1990. - P. 307-320.
