CC BY
10
симости свойств среды от уровней изучаемых факторов и ингредиентов.
Литература
1. Ашмарин И. П., Васильев Н. И., Амбросов В. А. Быстрые ^ методы статистической обработки и планирования экспериментов. — Л., 1975.— С. 27—61.
2. Дубовицкая JI. А., Кожин А. В. //Тканевые и клеточные культуры в селекции растений. — М., 1979. —
► С. 155—159.
3. Максимов В. Н., Федоров В. Д. Применение методов математического планирования эксперимента при отыскании оптимальных условий культивирования микроорганизмов.— М., 1969.
4. Малышев В. П. Математическое планирование металлургических и химических экспериментов. — Алма-Ата, 1977.
5. Применение магниевой среды для выделения сальмонелл из испражнений больных и носителей, пищевых продуктов, сточных жидкостей и воды открытых водоемов: Метод. рекомендации. — М., 1973.
6. Протодьяконов М. М., Тедер Г. И. Методика рациональ-
ного планирования экспериментов. — М., 1970.
7. Шамина 3. Б., Бутенко Р. Г. // Физиология растений. — 1976.— Т. 23, № 6, —С. 1264—1268.
8. Шустер Б. 10., Бирюков В. В.// Журн. микробиол. — 1968. — № 1, —С. 59—64.
9. Anden J.. Gruner J.. Kiicsch /.. Kniisel F.// Path. Microbiol. — 1967. — Vol. 30, № 6. — P. 858—866.
Поступила 23.10.87
УДК 614.7:579.861.!]-078
Г. П. Калина, F. М. Трухина
МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И ПЕРВИЧНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ РОДА MORAXELLA В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ
Московский НИИ гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана
1 Неферментирующие грамотрицательные микроорганизмы (НФГОМ) рода Moraxella разнообразны по биологии и экологии. Эти бактерии являются стойкими паразитами человеческого и животного организма и редко обнаруживаются в окружающей среде. Последнее объясняется не только их биологическими и экологическими особенностями, но и отсутствием чувствительных методов их идентификации [1—5].
Поиски моракселл в окружающей среде должны исходить из конкретных гигиенических и эпидемиологических задач. Следует уточнить:
Экология
1. Каковы экологические ниши разных видов моракселл?
2. В каких объектах окружающей среды могут быть успешными поиски того или иного вида моракселл?
3. Какие виды моракселл имеют эпидемиологическое и санитарное значение?
Из ответов на эти вопросы вытекают задачи, непосредственно относящиеся к разработке эффективных сред выделения моракселл из объектов окружающей среды. Следует определить: пищевые ресурсы, требуемые каждым видом мо-
Таблица 1
моракселл1
Пути Объекты неживой среды, в которых могут быть обнаружены мора-
« Вид моракселл Экологическая ниша эмиграции из живой сре- иммиграции из неживой
ды в неживую среды в живую кселлы
M lacunata, Вероятно, носоглотка, Отделяемое конъюнкти- Прямой контакт с Только предметы оби-
M lacunata реже конъюнктива вы, возможно, слю- больным, использо- хода (полотенца,
subsp. liquefa- глаз на, слизь носоглотки вание инфицирован- платки)
ciens ного белья
M nonliquefaciens Полость носа Органы дыхания, выделение капелек слизи при кашле, чиханье, разговоре Экстраназальная инфекция Воздух
M catarrhal is Полость носа То же Воздушная инфекция То же
M atlantae Не определены Не определены Не определены Не определены
M osloensis Носоглотка, реже по- При кашле, чиханье, Воздух, бытовые пред- Сточные жидкости,
лость носа. Моче- разговоре. Выделе- меты . почва, вода. Предметы туалета, гигиены
половой тракт ния женских гениталий Объекты, загрязненные мочой и выделениями женских гениталий
M. phenylpyruvica Вероятно, мочеполовой Моча, выделения гной- Предметы, загрязнен- То же
тракт ных ран ные мочой и гноем
M urethral is Мочеполовой тракт Моча, выделения гениталий Загрязненные мочой объекты, предметы туалета » »
Кроме М. bovis, не встречающейся у человека.
Глубина паразитизма и уровень патогенности моракселл1
Вид моракселл Глубина паразитизма Уровень патогенности Объекты выделения
М. lacunata subsp. liqu- Редкий, временный Раньше завершенный, ныне Конъюнктива глаз, носоглотум
efaciens потенциальный патоген ка, кровь
М. nonliquefaciens Стабильный Патогенность сомнительна Нос, носоглотка, среднее ухо
М. catarrhalis Стабильный Прогрессирующий потенциальный патоген То же
М. atlantae Не определена Не определен Кровь, цереброспинальная жидкость, мочеполовой
phenylpyruvica тракт
М. Временный, основной резервуар коровы, овцы, козы, свиньи Возможный потенциальный патоген То же
М. urethral is Временный Не определен Генитоуретральный тракт
М. osloensis Близкий к стабильности Может иметь значительную потенциальную патогенность Носоглотка, нос, женские гениталии, нагноения в суставах
1 Кроме М. bovis, не паразитирующей у человека и не патогенной для него.
стрептококками в верхних дыхательных путях, они в противоположность этим паразитам столько прочно привязаны к своей экологиче-^ ской нише, что утратили способность к длительному пребыванию в окружающей среде.
По своей экологии моракселлы делятся на 2 группы (табл. 1): паразиты верхних дыхательных путей, преимущественно или исключительно слизистой оболочки полости носа,—М. 1асипа1а, эиЬэр. ^иеГаа'епв, М. поп11^иеГас!еп5, М. са1аг-гИаПэ; паразиты мочеполового тракта, в основном женских гениталий, —М. рЬепу1ругиу1са, М. игеШгаПз.
Промежуточное место занимает М. ОБ^ег^в, обнаруживаемая в той и другой нише. Экологическая ниша М. аМагйае неизвестна, поскольку этот вид выделяли только из крови и спинномозговой жидкости. 4 Следовательно, эмиграция моракселл идет двумя путями: первым, характерным для воздушно-капельных инфекций, — с частицами ели- *
Таблица 3
Пищевые потребности моракселл
Группа Вид 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1а М. lacunata + 0 0 0 0 0 0 0 0
1а М. bovis + 0 0 0 0 0 0 0 0
I б М. nonliquefaciens + + 0 0 0 0 0 0 0
16 subsp. liquefaciens + + 0 0 0 0 0 0 0
16 М. catarrhalis + + + 0 0 0 0 0 0
IIa М. atlantae + + + + + 0 0 0 0
На М. phenylpyruvica + + -j- + + 0 0 0 0
116 М. urethrals + + + + + 0 +/0 +/0 +
116 М. osloensis + + + + + + + +/0 -1-/0
Примечание. 1 — нативные животные белки, 2 — витаминно-аминокислотный комплекс, 3 — сердечно-мозговой настой, 4— среда Мак-Конки, 5 — среда 0/Ф в агаровом варианте, 6 — ограниченная минеральная база (ОМБ) с пропио-катом, 7 — ОМБ с бутиратом, 8 — ОМБ с этанолом, 9 — ОМБ с ацеатом. + наличие роста, 0 — отсутствие роста.
ракселл; уровни устойчивости их к физическим, химическим, биологическим воздействиям в исследуемых биотопах; параметры биологических свойств отдельных видов, определяющие условия исследования и обеспечивающие оптимальную эффективность.
Род Moraxella семейства Neisseriaceae состоит из 8 таксонов: М. lacunala с подвидом liquefaci-ens, М. nonliquefaciens, М. bovis, М. phenylpyru-vica, М. atlantae, М. osloensis, а также М. catarrhalis, раньше входившая в род Branhamella, и М. urethrales, принадлежность которой к этому роду некоторыми исследователями оспаривается. Описанные позже таксоны были расшифрованы как М. allanlae (М-3), М. osloensis (М-4 и М-5), а группа М-6, возможно, является предшественником нозого вида моракселл.
Для моракселл характерен строгий паразитизм с локализацией на слизистых оболочках. Будучи сходными по законченности паразитизма с бактериями группы кишечных палочек и энтерококками в кишечнике, стафилококками и
зи при кашле, чиханье, разговоре; вторым — с мочой и выделениями женских гениталий.
Поиски М. lacunata (вообще бесперспективные) ограничены узким кругом бытовых предметов— полотенец, платков, белья, отработанной ваты, марли. Поиски subsp. liquefaciens, Ijtl. nonliquefaciens, M. catarrlialis, M. osloensis, помимо тех же объектов, можно вести также в воздухе закрытых помещений, особенно при больших скоплениях людей. М. phenylpyruvica, М. osloensis, М. urethrales следует искать в объектах, загрязняемых мочой, — почве, сточных жидкостях, на стульчаках, а также на объектах, загрязняемых отделяемым женских гениталий,— на белье, полотенцах, марле, вате, применяемых при гигиенических процедурах, и др.
Уровень патогенности моракселл и даже наличие у них этого свойства — проблема еще не решенная (табл. 2). Установлена этиологическая роль М. lacunata и подвида liquefaciens в развитии кератоконъюнктивита. По своей патогенности к этим «исчезающим» ныне видам близка М. bovis, вызывающая кератоконъюнктивит у .^крупного рогатого скота. М. catarrhalis является экстраназальным возбудителем отитов, бронхитов, пневмоний, септицемий [6, 7].
Моракселлы имеют санитарное значение, характеризуя уровень обсемененности воздуха и загрязнения мочой воды, почвы и бытовых объектов. Обнаружение моракселл в воде плавательных бассейнов, на стульчаках, в воде, используемой в вихревых ваннах, может указывать на опасность заражения гонореей. Учитывая двойственный характер экологических ниш М. osloensis и его потенциальную патогенность, обнаружение этого вида в воздухе и воде может иметь не только санитарное, но и относительное эпидемиологическое значение. Вода, кон-таминированная М. phenylpyruvica, может приводить к развитию нагноительных процессов.
По потребностям в пищевых ресурсах все виды моракселл делятся на 2 группы (табл. 3): I — виды, использующие для построения своих белков высокомолекулярные органические животные вещества; II — виды, строящие свои белки из неорганических соединений с использованием лишь единичных органических компонентов, а также довольствующиеся простыми органическими комплексами.
К I группе относятся виды, требующие для метаболизма нативные животные белки — кровь, сыворотку крови, асцитическую жидкость и т. д. (подгруппа Ia) —М. lacunata, М. bovis, а также виды, использующие такие пищевые компоненты, как сердечно-мозговой настой, витаминно-аминокислотный комплекс (подгруппа (16),— М- nonliquefaciens, subsp. liquefaciens, М. ca:ar-[ rhalis.
Во II группу входят виды, способные развиваться в полноценных мясопептонных средах — оксидации — ферментации (О/Ф), Мак-Конки с
желчью, но не в минеральных средах (подгруппа Па)—М. рИепу'.руптса, М. аНап^ае, и виды, развивающиеся в средах ограниченного минерального состава с органическими источниками углеродного питания и энергии (подгруппа Пб), — М. оз1оепз1'б, М. игеИтгаНэ. В группу I входят паразиты верхних дыхательных путей, а в группу II — в основном обитатели мочеполового тракта. Исключение составляет лишь М. оэ-1оепз1з, экология которой до конца не выяснена. Можно предположить, что экологический центр данного вида должен располагаться в генитоуре-тральном тракте.
Анализ экологических ниш моракселл, путей их эмиграции и иммиграции, потребностей в пищевых ресурсах позволяет уточнить требования, которым должны отвечать среды накопления, выделения и первичной идентификации. Разработку селективных сред нужно вести в двух направлениях. Для исследования объектов окружающей среды, в которые происходит эмиграция моракселл с отделяемым верхних дыхательных путей — воздуха и предметов окружающей обстановки в местах скопления людей в жилых и больничных помещениях, необходимы среды сложного и богатого питательного состава. При исследованиях воды и почвы, в которые со сточными жидкостями попадает моча, а также предметов, загрязняемых мочой и отделяемым женских гениталий, селективные среды могут быть более простыми по составу, однако они должны содержать органические компоненты, поскольку моракселлы, входящие во II группу, относятся к категории хемоорганотрофов.
С целью обнаружения моракселл — эмигрантов из верхних дыхательных путей — смывы с объектов окружающей среды предпочтительно делать малопитательными жидкостями (пептон-ная вода) с высевом на богатые нативными животными белками среды. В связи с наличием в выделениях верхних дыхательных путей и в воздухе грамположительной микрофлоры в состав сред необходимо вводить кристаллический фиолетовый. Поскольку большинство грамотри-цательных бактерий являются сахаролитами, введение в состав среды глюкозы позволит дифференцировать их от колоний моракселл. Замена цельной крови ее сывороткой, а также введение в состав среды 10—20% «лаковой» крови придает среде иежно-розовый цвет, не мешающий индикации колоний сахаролитов. Исключение из состава среды пептонов, содержащих токсичные для моракселл вещества, или снижение их количества также может повысить селективность среды, но при этом в составе среды должен быть сохранен мясной настой, который можно заменить дрожжевым экстрактом.
Моракселлы II группы способны развиваться на средах, базой которых служат мясопептон-ные среды (М. рИепу1руптса), или на средах ограниченного минерального состава с органи-
Ключевые признаки (блоки) моракселл и других несахаролитов
Род 11 вид i 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Moraxella spp. Acinetobacter hvoffi Pseudomonas spp. Alcaligenes spp. 0 0 + +/0 + 0 + + + 0 + + 4
Flavobacterium spp. + + 0 + 0 + 0
M. lacunata et subsp. liquefaciens M. bovis At. nonliquefaciens + + 0 0 + 0 ООО + + 0
Neisseria nonsaccharoliticae spp. M. urethralis At. catarrhalis +г +г + 0 0 + 0
At. osloensis M. atlantae M. phenylpyruvica 0 + + 0 0 + 0 + +
Примечание. 1 — оксидация глюкозы, 2 — цитохромоксидаза, 3 — подвижность, 4 — желатиназа на среде с 3% крови, 5 — гемолиз, 6 — желатиназа на среде без крови, 7 — разжижение свернутой сыворотки, 8 — нитратаза, 9 — утилизация пропиоаната в ограниченной минеральной среде (ОМС), 10 — утилизация бутирата в ОМС, 11 —фенилаланин-деаминаза, 12 — рост в присутствии 1% желчных солей. В прямоугольнике заключены блоки тестов, г — газообразование, + положительный ответ, 0 — отрицательный ответ.
ческими источниками углеродного питания (М. urethralis, М. osloensis). Бактерии хорошо развиваются на поверхности среды О/Ф, что, по-видимому, связано с низким содержанием в ней пептона. М. phenylpyruvica и М. atlantae хорошо развиваются на среде Мак-Конки с желчными солями. Комбинация двух сред — О/Ф с увеличенной концентрацией агара и Мак-Конки— создает благоприятные условия для выделения моракселл II группы. Введение в состав модифицированной среды О/Ф желчных солей и кристаллического фиолетового может быть использовано при разработке плотных сред. Селективность среды подобного или аналогичного состава относительна. Данная среда не тормозит развития колоний сахаролитов, которые могут за счет циногенной активности заглушить рост моракселл. На этой среде растут также несаха-ролиты родов Neisseria, Flavobacterium, Alcali-genes, которые образуют колонии, не отличимые от колоний моракселл.
В литературе приведены различные схемы идентификации моракселл. Основные ключевые признаки моракселл позволяют дифференцировать их от многих имитирующих их родов и видов: грамположительной микрофлоры (путем включения в среды кристаллического фиолетового) — от многочисленных представителей семейств Еп-terobacteriaceae, Vibrionaceae, большей части исевдомонад, A. calcoaceticus, многих видов рода Flavobacterium и часто обнаруживаемых в верхних дыхательных путях нейссерий (по отсутствию роста в анаэробных условиях и оксидации глюкозы). На практике эти два признака определяют в среде О/Ф Хыо и Лейфсона. Однако применение этого широко распространенного метода может привести (и, вероятно, приводит)
к ошибочным результатам. Моракселлы I груп^ пы, как и многие ферментирующие сахаролиты, не растут в (на) этой среде. Отрицательные результаты могут быть обусловлены отсутствием роста микроорганизмов, который может, однако, наблюдаться в условиях повышенного питания. Введение в состав среды 5—10% сыворотки крови позволяет повысить чувствительность исследований. Неферментирующие несахаролиты, часто встречающиеся в верхних дыхательных путях и в мочеполовом тракте (N. flavescens, N. cinerea, N. elongata, Р. alcaligenes, Р. pseudo-alcaligenes, Р. testosteroni, Р. diminuta, F. breve, F. meningosepticum, F. odoratum, A. faecalis, A. denitrificans subsp. denitrificans, Acinetobacter lwoffi), могут быть дифференцированы по по# движности (Pseudomonas, Alcaligenes), жела~ тиназоактивности, по разжижению желатина на среде без прибавления сыворотки и по отсутст- , вию гемолитической активности (Flavobacterium), по отрицательной реакции цнтохромоксида-зы (А. lwoffi). Четкие отличия моракселл 16 и По групп от несахаролитических нейссерий дает продукция свободного азота при редукции солей азотистой кислоты, а от М. urethralis, также редуцирующей нитриты до выделения свободного азота, — по наличию у последней способности утилизировать бутират натрия. И, наконец, в пределах II группы моракселл реакция фенилаланин-деаминазы и способность к росту на средах с 1 % желчных солей дифференцируют М. phenylpyruvica, М. atlantae и М. osloen-si>s (табл. 4).
В последнее время большие успехи достигну- А ты в разработке комплексных диагностических ■ сред, на которых возможно определять 2—3 и больше признаков. Блокировать отдельные те-
сты можно и при идентификации моракселл. Так, в нашей лаборатории используется среда, позволяющая оценить три основных ключевых признака — оксидацию глюкозы, подвижность и реакцию цитохромоксидазы. Теоретически могут быть объединены также реакция желатиназы и ^ гемолиз в среде для определения желатиназной активности при введении в нее 5 % крови, а также добавление в среду для определения фе-нилаланин-деаминазы 1 % желчных солей, что позволяет дифференцировать три вида моракселл.
Можно надеяться, что приведенные в статье теоретические обоснования будут способствовать разработке эффективных, простых и ускоренных
методов выделения, количественного учета и
идентификации моракселл.
Литература
1. Калина Г. П., Трихина Г. /И.//Жури, микробиол. — 1986. —№ 10. —С. 99—107.
2. Калина Г. П. //Там же. — 1987. — № 5. — С. 3—9.
3. Калина Г. П., Тру хина Г. М. //Там же.— 1987. — № 2, —С. 93—102.
4. Калина Г. П., Трухина Г. Л1.//Там же.— 1988. — № 1, —С. 80—88.
5. Шендеров Б. А., Серкова Г. П. //Там же.— 1979. — № 3. —С. 14—20.
6. Brooks I. // Drugs. — 1986. — Vol. 31, Suppl. 3. — P. 97— 102.
7. Van Hare G„ Shurin P. // Pediat. infect. Dis. J. — 1987. — Vol. 6. — P. 92—94.
Поступила 10.11.87
УДК 614.31:579.852.083.12:579.672
Ю. П. Пивоваров, Л. С. Зиневич, Г. Г. Калина, А. Д. Дериглазов
МЕТОДИКА ИЗУЧЕНИЯ АНАЭРОБНОЙ МИКРОФЛОРЫ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
II ММ-И им. Н. И. Пирогова
Охрана здоровья населения и рациональное использование пищевых ресурсов страны — основные задачи санитарной микробиологии. В связи с этим изучение бактериальной обсеме-ненности пищевых продуктов и установление характера микрофлоры составляют неотъемлемую часть санитарно-гигиенической экспертизы продуктов. Серьезной проблемой при проведении микробиологических исследований является выбор эффективных методов обнаружения и идентификации микроорганизмов. В настоящее время основные усилия микробиологов направлены на разработку ускоренных и упрощенных мето-* дов идентификации микроорганизмов [1].
До недавнего времени микрофлора пищевых продуктов изучалась в основном целенаправленно с использованием сред обогащения и методик, направленных на выделение определенных видов микроорганизмов. В то же время весь микробный фон, а также сочетания микроорганизмов, встречающихся одновременно в продуктах и обусловливающих общий уровень обсеменения, изучались мало. Работа по определению общей микробной обсемененности продуктов питания, проводимая на кафедре гигиены II ММИ им. Н. И. Пирогова в течение ряда лет, позволила установить целый ряд закономерностей и методических особенностей, которые привели к разработке различных схем дифференциации микроорганизмов, выделяющихся из продуктов питания [3]. В основу схем положены показатели, характеризующие морфологические, культурные и биохимические свойства микроорганизмов, приведенные в современной международной номенклатуре [2, 4], литературные сведения об от-
дельных группах микроорганизмов и результаты исследований, выполненных сотрудниками кафедры. Данные схемы позволяют обнаружить наибольшее число микроорганизмов, определяющих общую микробную обсемененность, идентифицировать классические и наиболее часто встречающиеся варианты родов Bacillus, Clostridium, Pseudomonas, Vibrio, Aeromonas, Xantomonas, Flavobacterium, Staphylococcus, Streptococcus и др.
Анаэробная микрофлора пищевых продуктов может быть представлена анаэробными палочковидными микроорганизмами и кокками. Анаэробные палочки различаются прежде всего способностью образовывать или не образовывать споры. К спорообразующим относятся представители двух родов: Clostridium и Desulfotomaculum (семейство Bacillaceae). Неспорообразуюшие анаэробные палочки (схема 1) для удобства описания целесообразно разделить на следующие группы: а) неспорообразующие грамполо-жительные палочки (представители родов Eubac-terium, Lactobacillus, Propionibacterium, Bifidobacterium); б) неспорообразующие грамотрица-тельные палочки (представители родов Fuso-bacterium, Bacteroides, Leptotrichia). Анаэробные кокки по способности роста при pH 2,0—2,5 можно разделить на 2 большие группы (схема 2): 1-я группа — микробы рода Sarcina, дающие рост при указанных значениях pH, 2-я — представители родов Ruminococcus, Peptococcus и Peptostreptococcus, дифференциация которых в основном проводится по их биохимическим свойствам.
