CC BY
5
сты можно и при идентификации моракселл. Так, в нашей лаборатории используется среда, позволяющая оценить три основных ключевых признака — оксидацию глюкозы, подвижность и реакцию цитохромоксидазы. Теоретически могут быть объединены также реакция желатиназы и ^ гемолиз в среде для определения желатиназной активности при введении в нее 5 % крови, а также добавление в среду для определения фе-нилаланин-деаминазы 1 % желчных солей, что позволяет дифференцировать три вида моракселл.
Можно надеяться, что приведенные в статье теоретические обоснования будут способствовать разработке эффективных, простых и ускоренных
методов выделения, количественного учета и
идентификации моракселл.
Литература
1. Калина Г. П., Трихина Г. М. //Жури, микробмол. — 1986. —№ 10. —С. 99—107.
2. Калина Г. П. //Там же. — 1987. — № 5. — С. 3—9.
3. Калина Г. П., Тру хина Г. М. //Там же.— 1987. — № 2, —С. 93—102.
4. Калина Г. П., Трухина Г. М. //Там же.— 1988. — № 1, —С. 80—88.
5. Шендеров Б. А., Серкова Г. П. //Там же.— 1979. — № 3. —С. 14—20.
6. Brooks I. // Drugs. — 1986. — Vol. 31, Suppl. 3. — P. 97— 102.
7. Van Hare G„ Shurin P. // Pediat. infect. Dis. J. — 1987. — Vol. 6. — P. 92—94.
Поступила 10.11.87
УДК 614.31:579.852.083.12:579.672
Ю. П. Пивоваров, Л. С. Зиневич, Г. Г. Калина, А. Д. Дериглазов
МЕТОДИКА ИЗУЧЕНИЯ АНАЭРОБНОЙ МИКРОФЛОРЫ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
II ММ-И им. Н. И. Пирогова
Охрана здоровья населения и рациональное использование пищевых ресурсов страны — основные задачи санитарной микробиологии. В связи с этим изучение бактериальной обсеме-ненности пищевых продуктов и установление характера микрофлоры составляют неотъемлемую часть санитарно-гигиенической экспертизы продуктов. Серьезной проблемой при проведении микробиологических исследований является выбор эффективных методов обнаружения и идентификации микроорганизмов. В настоящее время основные усилия микробиологов направлены на разработку ускоренных и упрощенных мето-* дов идентификации микроорганизмов [1].
До недавнего времени микрофлора пищевых продуктов изучалась в основном целенаправленно с использованием сред обогащения и методик, направленных на выделение определенных видов микроорганизмов. В то же время весь микробный фон, а также сочетания микроорганизмов, встречающихся одновременно в продуктах и обусловливающих общий уровень обсеменения, изучались мало. Работа по определению общей микробной обсемененности продуктов питания, проводимая на кафедре гигиены II ММИ им. Н. И. Пирогова в течение ряда лет, позволила установить целый ряд закономерностей и методических особенностей, которые привели к разработке различных схем дифференциации микроорганизмов, выделяющихся из продуктов питания [3]. В основу схем положены показатели, характеризующие морфологические, культурные и биохимические свойства микроорганизмов, приведенные в современной международной номенклатуре [2, 4], литературные сведения об от-
дельных группах микроорганизмов и результаты исследований, выполненных сотрудниками кафедры. Данные схемы позволяют обнаружить наибольшее число микроорганизмов, определяющих общую микробную обсемененность, идентифицировать классические и наиболее часто встречающиеся варианты родов Bacillus, Clostridium, Pseudomonas, Vibrio, Aeromonas, Xantomonas, Flavobacterium, Staphylococcus, Streptococcus и др.
Анаэробная микрофлора пищевых продуктов может быть представлена анаэробными палочковидными микроорганизмами и кокками. Анаэробные палочки различаются прежде всего способностью образовывать или не образовывать споры. К спорообразующим относятся представители двух родов: Clostridium и Desulfotomaculum (семейство Bacillaceae). Неспорообразующие анаэробные палочки (схема 1) для удобства описания целесообразно разделить на следующие группы: а) неспорообразующие грамполо-жительные палочки (представители родов Eubac-terium, Lactobacillus, Propionibacterium, Bifidobacterium); б) неспорообразующие грамотрица-тельные палочки (представители родов Fuso-bacterium, Bacteroides, Leptotrichia). Анаэробные кокки по способности роста при pH 2,0—2,5 можно разделить на 2 большие группы (схема 2): 1-я группа — микробы рода Sarcina, дающие рост при указанных значениях pH, 2-я — представители родов Ruminococcus, Peptococcus и Peptostreptococcus, дифференциация которых в основном проводится по их биохимическим свойствам.
Окраска по фаму
Подвижность
Рснриноза
Желатин
Фруктоза
Эскулин
Инозит
Арабиноэа
Сорбит
Маннит
Манноза
Инулин
Зритритол
Салицин.
Г1
X
I
II
3
+Н-1
Схема 1
— Коя для дифференциации неспорообразуго-щих анаэробных палочек.
4
II
I
€4
Отбор проб продуктов и их подготовку для бактериологического исследования проводили по общепринятым методикам. Схема исследования пищевых продуктов с целью обнаружения ана-
Схема 2
Код для дифференциации анаэробных кокков.
Рост при рН2,0-2£
Целлобиоза
/азообраэобание на средах
/люкоза
Фруктоза
Сахароза
Индол
Для дифференциации этих микроорганизмов необходимо проводить тест на образование масляной кислоты при расщеплении пептона.
эробных микроорганизмов может быть представлена следующим образом: 1-й день—посев исходного (0,1 г) и двух последующих десятикратных разведений продукта (0,01 и 0,001 г) на кровяной или сахарно-кровяной агар. Инкубация посевов в течение 24 ч при 37 °С в анаэро- ^ стате с разрежением 0,4—0,6 атм; 2-й день—-описание морфологии выросших колоний. Снятие колоний и пересев на предварительно регенерированную среду Китта — Тароцци с добавлением 0,5% раствора глюкозы (2 пробирки). Определение грампринадлежности экспресс-методом [5]. Для определения спорообразования анаэробных палочек одна из засеянных пробирок оставляется при комнатной температуре на 3 сут, второй посев инкубируют при 37 °С в те2 чение 24 ч с последующим ежедневным пересевом до 5-го дня (для определения подвижности и установки биохимических реакций); 3-й день — пересев культур анаэробных кокков в мясопептонный бульон (МПБ) с рН 2,0—2,5 для определения способности микроорганизмов к росту. Пересев культур анаэробных палочек в среду Китта — Тароцци; 4-й день — пересев культур, не давших роста при рН 2,0—2,5, в бульон Хоттингера для определения индолообразования и на среды, содержащие целлюлозу, глюкозу,
фруктозу, для определения биохимической активности. Пересев культур анаэробных палочек в среду Китта — Тароцци; 5-й день — для культур анаэробных палочек: окраска спор по методу Пешкова. Окончательная идентификация спо-рообразующих палочек. Определение подвижности неспорообразующих палочек. Пересев части культур (подвижные грамположительные палочки) на среды, содержащие сорбит, маннозу, са-1 лицин, или (неподвижные грамотрицательные палочки) на среды с рафинозой, эскулином, инозитом, арабинозой и др., определение способности расщеплять желатин. Постановка реакции расщепления пептона с образованием масляной кислоты — для неподвижных грамотрицательных палочек. Для культур анаэробных кокков: постановка реакции индолообразования; учет результатов на средах, содержащих целлюлозу, глюкозу, фруктозу. Окончательная идентификация анаэробных кокков; 6-й день — учет поставленных накануне реакций. Окончательная идентификация неспорообразующих анаэробных па-^ лочек.
• Из схемы 1 видно, что определяющими для окончательной идентификации анаэробных палочек являются 5-й и 6-й дни исследования. Так, на 5-й день можно четко разграничить споро- и неспорообразующие палочки на основании теста спорообразования, а с учетом окраски по Граму внутри 1-й группы идентифицировать представителей родов Clostridium (грамположительные) и Desulfotomaculum (грамотрицательные). Для неспорообразующих микроорганизмов обязательным является определение подвижности. Известно, что в то время как представители родов Propionibacterium и Bifidobacterium всегда неподвижны, у микроорганизмов рода Eubacterium этот признак вариабелен, а у Lactobacillus в редких случаях встречаются подвижные виды.
Ä В связи с этим при обнаружении неспорообразующих грам положительных подвижных палочек следует провести дополнительные исследования ферментации Сахаров и прежде всего сорбита. В случае положительной реакции удается окончательно идентифицировать микроорганизмы рода Eubacterium. Сорбитнегатнвные культуры подвергают дальнейшим исследованиям с другими сахарами — маннозой и салицином. Расщепление маннозы и салицина в данном случае позволяет установить присутствие подвижных представителей рода Lactobacillus. Что касается неподвижных вариантов родов Eubacterium и Lactobacillus, то их следует дифференцировать от других грамположительных неподвижных бактерий (Propionibacterium и Bifidobacterium). С этой целью требуется постановка дополнительных тестов, предусмотренных схемой (расщепление рафинозы, эскулина, инозита, разжижение желатина и др.). Возможная вариабельность биохимических свойств в схеме учтена.
Выделение неспорообразующих грамотрицательных микроорганизмов чрезвычайно затруднено, так как они отличаются плохим ростом на обычных питательных средах и требуют соблюдения строгого анаэробиоза. Дифференциация их также весьма сложна из-за идентичности биохимических свойств. Надежных тестов для идентификации представителей 3 представленных в схеме 1 родов нет. В качестве основного теста для выделения микроорганизмов рода Fusobac-terium можно использовать образование масляной кислоты при расщеплении пептона. В связи с трудностями разделения неспорообразующих грамотрицательных палочек исследования можно закончить на стадии определения группы Fuso-bacterium — Bacteroides.
Из схемы 2 видно, что окончательная идентификация культур анаэробных кокков проводится на 5-й день исследования. На 3-й день исключаются сарцины, растущие в МПБ с рН 2,0— 2,5. Дальнейшая идентификация анаэробных кокков, не растущих при таких значениях рН (Ruminococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus), ведется путем определения способности сбраживать целлюлозу, ферментировать глюкозу, фруктозу и образовывать индол. Штаммы, сбраживающие целлобиозу, относятся к роду Ruminococcus. У штаммов, не сбраживающих этот углевод, определяют ферментативную способность в отношении глюкозы и фруктозы. Штаммы, ферментирующие глюкозу, но не ферментирующие фруктозу, относятся к роду Peptostreptococcus. Культуры, ферментирующие эти сахара и дающие индолообразование, идентифицируются как Peptococcus.
Описанные выше тесты проводили по общепринятым методикам [4]. С целью ускоренного выявления грампринадлежности выделенных штаммов используется методика [5], суть которой состоит в следующем. 1—2 капли 3 % раствора КОН наносят на предметное стекло. Колонию или несколько маленьких колоний, снятых с поверхности плотной среды петлей, зносят в каплю 3 % раствора КОН, тщательно перемешивают 5—10 с, затем петлю осторожно поднимают над каплей. Если раствор КОН становится вязким, за петлей тянется нить длиной 0,5— 2 см и более, которая лучше заметна на темном фоне стола. Слизеобразование считается надежным признаком грамотрицательных бактерий и связано с тем, что 3 % раствор КОН разрушает тонкую структуру грамотрицательных бактерий и освобождает ДНК, которая является вязким соединением. Грамположительные бактерии не образуют слизи.
Литература
1. Калина Г. П.//Гигиенические аспекты охраны здоровья населения в условиях интенсивного развития народного хозяйства, —М., 1982.— С. 97—102.
2. Краткий определитель бактерий Берги: Пер. с англ.— М„ 1980.
3. Пивоваров Ю. П., Лапенков М. И., Мерешок Г. В. Определитель санитарно-значимых микроорганизмов. — Кишинев, 1982.
4. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М. О. Биргера.— М., 1982.
5. Gregerson Т. // Europ. J. appl. Microbiol. — 1978. — Vol. 5,— P. 123—127.
Поступила 16.11.87
УДК 614.777: [Г>79.68:Г579.842.11.578.81 ] .083.12
Т. В. Доскина, Л. А. Мышляева
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ КОЛИФАГА ИЗ СЛАБОЗАГРЯЗНЕННЫХ ВОД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЕСТЕСТВЕННЫХ МИНЕРАЛЬНЫХ СОРБЕНТОВ
НИИ общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва
В настоящее время особую актуальность приобретает проблема разработки косвенных показателей микробного загрязнения питьевой воды, что обусловлено частым несоответствием между существующими бактериальными показателями качества воды и содержанием в ней энтеровиру-сов. Обоснование возможности использования колифага для оценки эпидемической безопасности воды в значительной степени затруднено отсутствием чувствительных количественных методов индикации.
Анализ существующих методов выделения ко-лифагов — сорбция на положительно заряженных фильтрах [2, 4], осаждение при низкочастотном центрифугировании [3], флоккуляции использованием А^(ОН)2 [5], сорбция на естественных минеральных сорбентах [1] показал, что наиболее простым и эффективным является последний из вышеуказанных методов. Однако существенным недостатком этого метода является его низкая чувствительность при выделении ДНК-содержащих колифагов, которые превалируют в популяции колифагов природных вод.
Задача настоящей работы — усовершенствование метода выделения колифагов при использовании естественных минеральных сорбентов с целью расширения спектра выделяемых колифагов (т. е. определение как РНК-, так и ДНК-содержащих колифагов). Теоретической основой для экспериментальных исследований явилось сообщение [6] о возможности выделения вирусов, сорбированных на частицах ила без их предварительной элюции.
Исследования проводили в экспериментальных условиях на водопроводной воде при комнатной температуре с использованием в качестве естественного минерального сорбента каолинита.
В предварительных исследованиях была выявлена принципиальная возможность использования для выделения колифагов из слабозагряз-ненных вод комплекса сорбент — колифаг. С этой целью 50 мл стерильной водопроводной воды контаминировали ДНК-содержащим колифа-гом Т, в концентрации 103 БОЕ/л (рН воды 4,0—4,5, количество сорбента 12,5 мг). После 30-
минутного контакта пробу • центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 мин. Осадок суспендировали в дистиллированной воде. Колифаг выделяли путем высева полученной суспензии методом двухслойных агаровых слоев на газоне Е. coli В. Установлено, что колифаг, адсорбированный на частицах каолинита, способен образовывать негативные колонии на газоне Е. coli В - i без элюции в раствор, что позволяет определять его концентрацию в исследуемой воде.
В последующих сериях экспериментов были установлены оптимальные условия для индикации колифагов на основе комплекса сорбент — колифаг из больших объемов слабозагрязненных вод. В процессе этих исследований выявлено, что эффективность выделения колифага методом прямого высева суспензии колифага, сорбированного на каолините, зависит от концентрации колифага в воде. В частности, по мере снижения концентрации колифага в воде (от 104 до единичных БОЕ/л) повышается эффективность выделения колифага из воды.
В результате исследований нами усовершенствован метод выделения колифага из слабоза- — грязненных вод с использованием естественных ^ природных минеральных сорбентов.
Усовершенствование заключается в следую- ^ щем. В исследуемую воду вносят сорбент из расчета 250 мг на 1 л воды, устанавливают pH в пределах 4,0—4,5 (температура воды 18— 20 °С). После 30-минутного контакта пробу центрифугируют в течение 20 мин при 4000 об/мин. Супернатант сливают, в осадок вносят 4 мл физиологического раствора. Полученную суспензию высевают методом двухслойных агаровых пластин, негативные колонии колифага учитывают через 16—18 ч инкубации при 37 °С. Индекс колифага определяют путем суммирования числа выросших колоний. В экспериментальных условиях эффективность метода достигала 90 %.
Метод апробирован в натурных условиях. Полученные данные показали, что метод дает ста- ' бильные, воспроизводимые результаты и доступен практическим лабораториям санэпидслужбы.
