CC BY
74лучения, а также излучения в диапазоне УФ-С от естественных источников.
Следует также отметить, при санитарно-эпидемиологической экспертизе оборудования, являющегося источником УФИ, должны контролироваться также такие показатели, определяющие безопасность оборудования, как интенсивность теплового излучения, яркость источников света, шум, электромагнитные поля, возможное выделение озона, эргономические параметры и т. п. Эти и другие характеристики подобных приборов должны быть максимально приняты во внимание при разработке нормативно-методического документа по проведению их гигиенической оценки, необходимость которого представляется обоснованной. При этом для обеспечения эффективного контроля оборудования необходимыми являются: разработка классификации источников УФИ, предназначенных для воздействия на потребителей по степени их опасности, решение вопросов регламентации воздействий УФИ с учетом индивидуальных факторов риска, организация метрологического обеспечения измерений, а также разработка требований безопасной эксплуатации оборудования.
З а к л ю ч е н и е. следует подчеркнуть необходимость контроля оборудования, используемого для загара. Если лечебно-профилактические облучательные установки эксплуатируются под наблюдением медицинского персонала и по назначению врача, то использование соляриев происходит практически бесконтрольно. Услуги соляриев не лицензируются, и проверка знаний обслуживающего персонала не осуществляется. В то же время для того чтобы не навредить потребителям, уровень подготовки работников, определяющих программу проведения процедур в солярии, должен быть не ниже, чем у врачей-косметологов,
УДК 575.853
поскольку, возможный вред для здоровья пользователей слишком велик и необходим индивидуальный подход при принятии решения о режимах воздействия. Отсутствие документа, в котором была бы представлена всесторонняя оценка особенностей биологического действия УФИ различных диапазонов на организм человека и содержались бы четкие указания, как обеспечить безопасное и эффективное применение приборов-источников УФИ, предназначенных для воздействия на человека, делает их эксплуатацию потенциально опасной для потребителей.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. ГОСТ Р МЭК 60335-2-27—2000 «Безопасность
бытовых и аналогичных электрических приборов. Дополнительные требования к приборам ультрафиолетового и инфракрасного излучений для ухода за кожей и методы испытаний». — М.: ИПК Изд-во стандартов, 2000.
2. Методические указания «Профилактическое ультрафиолетовое облучение людей (с применением искусственных источников ультрафиолетового излучения)», Методические указания (проект) // Светотехника. —
1989. — № 5. — С. 1—5.
3. МСанПиН 001 — 96 «Санитарные нормы допустимых уровней физических факторов при применении товаров народного потребления в бытовых условиях». Межгосударственные санитарные правила и нормы. — М.: Инф.-изд. центр Минздрава России, 1997.
4. СН 4557—88 «Санитарные нормы ультрафиолетового излучения в производственных помещениях». — М.:
МЗ СССР, 1988.
5. International Standard IEC 60335-2-27, ed. 4.2 2007-04 «Household and similar electrical appliances Safety. — Part 2-27: Particular requirements for appliances for skin exposure to ultraviolet and infrared radiation».
Поступила 06.06.08
А.В. Ткач, Л.А. Иванова, Ю.В. Стаценко
МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ АПОПТОЗА
(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
ГУ НИИ медицины труда РАМН, Москва
Ключевые слова: апоптоз, методы, количественная оценка.
A.V. Tkatch, L.A. Ivanova, Yu.V. Statsenko. Methods of detection and quantitative evaluation of apoptosis (review of literature).
Key words: apoptosis, methods, quantitative evaluation.
Термин «апоптоз» был впервые предложен в 1972 г. для обозначения морфологически обособленной разновидности клеточной смерти, происходящей в живых тканях [36]. Основной морфологической особенностью апоптоза является сморщивание клетки, сопровождающееся конденсацией хроматина и образованием ограниченных мембранами фрагментов клетки при сохранении основных структур органелл.
Развитие и жизнедеятельность многоклеточных организмов напрямую связаны с постоянной необходимостью количественного контроля отдельных клеточных популяций. Поддержание баланса между пролиферацией клеток и их элиминацией является основой сохранения структурной и функциональной организации многоклеточного организма. Биологический механизм, реализующий функцию элиминации клеток, — апоптоз. В последнее время изучение нарушений апоптоза как ключевого фактора во многих патологических процессах привлекает внимание значительного числа ученых всего мира. Этому вопросу посвящено огромное и все увеличивающееся количество публикаций в ведущих журналах, однако многие аспекты проблемы остаются неизученными.
Апоптоз является важнейшим механизмом регуляции количественного и качественного состава всех клеточных популяций организма. Возникновение и развитие патологических процессов может быть обусловлено как усилением, так и ослаблением апоптоза различных групп клеток. Учитывая это, задача обнаружения и количественной оценки изменений апоптоза как отдельных клеток, так и клеточных популяций является актуальной для научных исследований и в перспективе для клинической практики, в том числе профпатологии. В настоящей работе предпринята попытка систематизировать известные методы обнаружения апоптозных клеток и их подсчета. Мы надеемся, что эта статья поможет исследователям и практикам сориентироваться при выборе методов, наилучшим образом отвечающих стоящим перед ними задачам.
Для определения апоптоза используются методы, направленные на обнаружение ключевых признаков — изменений клетки в процессе апоптоза, таких, как: экспрессия специфических рецепторов Fas-R (CD95); изменения клеточной мембраны — транслокация фосфатидилсе-рина на наружную сторону мембраны; активация протеаз — каспаз; изменения митохондрий — снижение трансмембранного потенциала, освобождение цитохрома С, фрагментация ДНК.
Основные признаки, фиксируемые различными методами, представлены далее.
Морфология и структура клеточной мембраны:
Морфология мембраны;
Проницаемость мембраны для красителей: непроникающих — PI, проникающих красителей ДНК — DAPI, Hoechst;
Экстернализация фосфатидилсеринов — присоединение Annexin V.
События в ядре и деградация ДНК:
Морфология ядра — сегментация хроматина;
Расщепление ДНК — образование крупных фрагментов, интрануклеосомальное расщепление;
Расщепление ДНК in situ — детекция разрывов цепочек;
In Situ Nick Translation (ISNT);
TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL);
Антитела к одноцепочечной ДНК;
In Situ Oligo Ligation (ISOL).
Расщепление клетки — апоптические тельца.
Биохимические события в цитоплазме:
Активность каспаз;
Продукты каспаз.
Функции и целостность митохондрий:
Проницаемость для витальных красителей;
Митохондриальные антигены — их доступность;
Метаболическая активность;
Высвобождение цитохрома С.
Для подсчета клеток в апоптозе применяются различные анализаторы, в зависимости от типа клеток, степени их агрегации и выбранного метода выявления [15, 16, 18, 34, 55, 60, 66, 73, 79].
Морфология мембраны.
Апоптоз клетки характеризуется возникновением изменений клеточной мембраны. Морфологические изменения на определенной стадии могут быть непосредственно наблюдаемы исследователем при помощи различных вариантов микроскопии — световой и электронной. Эти изменения — образование пузырьков, волн мембраны и.т. д., как правило, скоротечны и не всегда могут быть зафиксированы исследователем [1, 43, 70]. Кроме того, такой метод оценки не вполне специфичен в отношении апоптоза, применяется преимущественно в исследованиях кинетики апоптоза отдельных клеток.
Проницаемость мембраны для красителей: непроникающих — PI, проникающих красителей ДНК — DAPI, Hoechst.
Изменение проницаемости клеточной мембраны для красителей при апоптозе является важным признаком, позволяющим детерминировать апоптические клетки [54]. Красители, имеющие большую молекулярную массу, такие, как пропидия иодид (PI), не могут проникать в интактную клетку из-за больших размеров молекул, но могут маркировать некротическую клетку, мембрана которой стала проницаемой. В то же время красители, имеющие маленькие размеры молекул, особенно способные связываться с ДНК, например Hoechst 33342, акридиновый оранжевый (АО), могут проникать как в интактную, так и в апоптическую и некротическую клетку и метить ее. Интенсивность окрашивания клетки ДНК — красителями зависит от состояния хроматина, что позволяет отличить интактные клетки от апоптических по содержанию ДНК. Содержание ДНК в апоптической клетке, как правило, меньше из-за потери с апоптическими тельцами, чем в интактной, что проявляется уменьшением интенсивности флюоресценции окрашенной клетки. Таким образом, при анализе клетки, помеченные только Hoechst 33342 или АО со сниженным содержанием ДНК, считаются апоптическими, клетки, помеченные PI и Hoechst 33342 или АО, — некротическими.
Для анализа (подсчета) клеток используется люминесцентная микроскопия — хорошо визуализируется морфология ядра — или проточная цитометрия, в зависимости от задач и материала исследования.
Достоинства метода, выявляющего изменения проницаемости клеточной мембраны, — относительная простота реализации и анализа, возможность различать мертвые и живые клетки. Основной недостаток — субъективность, так как нет четких критериев отличия апоптических клеток от интактных, ясные морфологические отличия ядра появляются относительно поздно.
Экстернализация фосфатидилсеринов — присоединение Annexin V.
Экстернализация фосфатидилсеринов (PS) — важный маркер изменений клеточной мембраны при апоптозе [7, 59, 68]. В неизмененной клетке мембрана характеризуется наличием структурной асимметрии локализации различных фосфолипидов по отношению к внутренней и внешней сторонам мембраны. Фосфатидилхолин и сфингомиелин располагаются на наружной поверхности, а фосфатидилсерин преимущественно на внутренней, обращенной к цитозолю поверхности. Изменения мембраны в процессе апоптоза приводят к нарушениям структуры, что
проявляется, в том числе, экспрессией фосфати-дилсерина на наружной поверхности клетки.
Метод детекции апоптоза основан на способности протеина Annexin V, принадлежащего к группе аннексинов, избирательно связываться с фосфатидилсерином в присутствии ионов кальция [6, 7, 48, 68]. В неповрежденную клетку Annexin V не проникает. Утрата мембраной асимметрии предшествует другим наблюдаемым изменениям клетки — нарушению целостности мембраны, фрагментации ДНК и конденсации хроматина и может служить ранним маркером апоптоза [59]. Для анализа клеток используют Annexin V конъюгированный с различными флюорохромами, например флюоресцеином (FITC), фикоэритрином (PE) и другими. Поскольку при нарушении целостности мембраны PS, локализованный на внутренней стороне мембраны, становится доступным для связывания с Annexin V, для выявления и исключения некротических / разрушенных клеток в анализируемую систему вводят дополнительный краситель, не проникающий через целую мембрану, например пропидия иодид (PI) или 7-аминоактиномицин D (7-AAD). Таким образом, при анализе клетки, не помеченные ни Annexin V, ни PI или 7-AAD, считаются ин-тактными. Клетки, помеченные только Annexin V, — апоптическими. Клетки, помеченные Annexin V и PI или 7-AAD, — некротическими. Для анализа используется проточная цитометрия или люминесцентная микроскопия
[28, 41, 45, 71, 77].
Достоинства метода — простота и быстрота исполнения, возможность выделить интактные, апоптические и мертвые клетки, совместимость с одновременным маркированием поверхностных антигенов. Среди отмечаемых недостатков — недостаточная универсальность — не все популяции клеток экспрессируют PS в апоптозе, неприменимость к срезам тканей, возможность получения искаженных результатов при неосторожном обращении с клетками (повреждается мембрана).
Прогрессирующая деградация ДНК является ключевым событием апоптоза [74].
Деградация ДНК в апоптической клетке сопровождается возникновением морфологических изменений ядерных структур, которые могут быть обнаружены и использованы для детекции апоптоза. Основные морфологические критерии апоптоза — пикноз ядра, конденсация хроматина могут быть выявлены с применением любых методов окраски, позволяющих хорошо визуализировать структуру ядра [58, 65]. Ис-
пользуется окраска по Романовскому—Гимзе, витальные ДНК-красители — акридиновый оранжевый, Hoechst 33342, так же DAPI при условии предшествующей пермеабилизации. В сочетании с невитальными красителями (PI, этидиум бромид) позволяет отличить мертвые клетки. Для анализа образцов применяется световая микроскопия, в том числе люминесцентная. Достоинства метода — простота и дешевизна, допускает одновременное маркирование поверхностных антигенов. Недостатки — субъективность, трудность проведения количественной оценки апоптоза в клеточной популяции из-за нечеткой выявляемости критериев.
Определение фрагментации ДНК, происходящей в апоптических клетках при участии Ca, Mg-зависимой эндонуклеазы, избирательно расщепляющей межнуклеосомальные линкерные участки, может применяться для анализа показателей апоптоза в клеточной популяции [8].
Для анализа состояния ДНК клетки применяется электрофорез в агарозном геле, когда образовавшиеся фрагменты ДНК апоптических клеток распределяются в геле с формированием «лестницы». Для качественной и/или количественной оценки апоптоза в популяции используется разделение образовавшихся фрагментов ДНК на фракции с низкой (LMW) и высокой (HMW) молекулярной массой. В апоптических клетках содержание LMW ДНК увеличивается, а содержание HMW ДНК уменьшается. Для разделения выделенную ДНК подвергают центрифугированию. Далее проводятся электрофорез в геле и проявка фореграммы бромистым этидием. Признаком апоптоза клеток считают обнаружение участков, соответствующих моно-и олигонуклеотидам. Введение в исследование дополнительного этапа с предварительным маркированием ДНК изучаемой клеточной популяции (при условии пролиферации in vitro) радиоизотопами ([3Н]-тимидином) или аналогом нуклеотидов 5-бромо-2'-дезоксиуридином (BrdU) позволяет избирательно отследить явления апоптоза в смешанных клеточных популяциях. Метод с применением радиоизотопов относительно чувствительный, позволяет проводить количественную оценку апоптоза. Однако необходимость предварительного маркирования клеток ограничивает применимость метода клетками, пролиферирующими in vitro. Кроме того, использование радиоактивных материалов нежелательно.
Существует также метод, выявляющий фрагментацию ДНК, основанный на применении ИФА (ELISA). Для оценки апоптоза клетки
лизируются, при этом из них высвобождаются фрагменты ДНК в комплексе с гистонами. Центрифугированием отделяют супернатант, содержащий ДНК-гистоновые фрагменты. Далее переносят супернатант в лунки планшета, покрытые стрептавидином. Нуклеосомы суперна-танта связываются антителами — антигистоно-выми с биотином и анти-ДНК с пероксидазой. Инкубируют с субстратом пероксидазы. Содержание окрашенного продукта в лунках планшета определяют спектрофотометрически. Метод не требует предварительного маркирования клеток, чувствителен, не требует использования радиоизотопов, позволяет отличить апоптоз от некроза.
В процессе деградации ДНК образуются разрывы ее цепочек. Эти разрывы могут быть обнаружены маркированием образующихся свободных 3'—ОН концов, посредством присоединения модифицированных нуклеотидов. Процесс является энзиматическим, происходит при участии ДНК-полимеразы (трансляция концов) и концевой дезоксинуклеотидил трансферазы (присоединение меченых фрагментов). ДНК-полимераза I катализирует субстрат-зависимое присоединение нуклеотидов при одноцепочечном разрыве ДНК. Метод с применением такой реакции называется In Situ Nick Translation, ISNT [30—40]. Концевая дезоксинуклеотидил транс-фераза (TdT) способна субстрат-независимо метить свободные концы двухцепочечных разрывов ДНК. Такой метод называется TdT-mediated X-dUTP nick end labeling, TUNEL [13, 29, 42, 52, 69]. Метод TUNEL чувствительнее и быстрее в исполнении, чем ISNT. Эксперименты показывают, что TUNEL помечает в основном клетки, находящиеся в апоптозе, в то время как ISNT идентифицирует некротические клетки, то есть клетки с более глубокими, поздними изменениями. Теоретически одновременное применение обоих методов позволит отличить апоптические клетки от некротических. Методически оба метода включают предварительную пермеабилизацию клеток, что позволяет экзогенным ферментам попасть в клетку, и фиксацию, исключающую возможность потери ДНК пермеабилизированной клеткой. В случае когда 3' концы ДНК были помечены dUTP-biotin, требуется дополнительная стадия инкубации со стрептавидином, конъюгированным с маркерной молекулой, например флюоресцеином (FITC). Образующиеся комплексы могут быть легко обнаружены. Возможно использование dUTP — FITC, что позволяет избежать дополнительной стадии «проявления». Кроме того,
использование прямого маркирования создает меньше неспецифического фона, при этом сохраняется тот же уровень чувствительности, что и при непрямом маркировании.
Детекция результатов может производиться с использованием люминесцентной микроскопии или проточной цитометрии. Так же возможна доработка методики для использования колориметрических способов детекции.
Среди достоинств метода TUNEL можно выделить относительно высокую чувствительность, применимость метода в отношении тканевых срезов, хорошую визуализацию морфологии апоптоза, возможность использования со многими типами клеток. К недостаткам следует отнести относительную трудоемкость, многоэ-тапность, высокую требовательность к соблюдению технических условий постановки реакций, длительность процесса, возможность детекции некротических клеток — неспецифичность, а также выявление апоптоза в поздней стадии.
Разрывы ДНК с образованием одноцепо-чечных фрагментов, происходящие при апопто-зе, могут быть обнаружены при помощи антител к одноцепочечной ДНК (ssDNA-MAb) [24—26, 51]. Один из вариантов такого метода детекции основан на явлении повышения чувствительности ДНК апоптических клеток к денатурации при нагревании в присутствии формамида. Нагревание клеток до 56 — 75 °С в присутствии формамида приводит к избирательной денатурации ДНК апоптических клеток с образованием одноцепочечных разрывов (ssDNA) [25], позволяющих присоединиться антителам к ssDNA. Денатурация ДНК некротических клеток в описанных условиях приводит преимущественно к образованию двух-цепочечных разрывов ДНК, не связывающих ssDNA-MAb. Для детерминации результатов используют принцип ИФА. Метод допускает исследование фиксированных формалином препаратов, обеспечивает высокую чувствительность и специфичность.
In Situ Oligo Ligation (ISOL).
Метод основан на способности фермента Т-4 ДНК лигазы избирательно соединять комплементарные концы двухцепочечной ДНК [20— 22]. Соединяемыми являются концы геномной ДНК клетки и концы синтетического конъюги-рованного с биотином олигонуклеотида. Синтетические олигонуклеотиды содержат две комплементарные последовательности оснований, формирующие линейный двухнитевой сегмент. Один из полюсов двухнитевого сегмента имеет 3' и 5' концы. Эти концы могут быть «тупыми»
или образовывать «выступ», в зависимости от наличия удлинения 3' на одно основание. На противоположном полюсе двухнитевого сегмента формируется петля шпильки — вторичная структура. Внутри этой петли находится био-тин. Для присоединения описанной синтетической нуклеотидной структуры в присутствии T-4 ДНК лигазы геномная ДНК исследуемой клетки должна содержать «тупые» фосфорили-рованные 5'-концы и короткие «выступающие» З'-концы. ДНК с такими характеристиками наиболее характерна для ядра апоптической клетки. ISOL не метит одноцепочечные разрывы, одноцепочечную ДНК, «утопленные» З'-концы или «выступающие» З'-концы длиннее одного основания, что отличает ISOL от других методов выявления изменений хроматина, таких, как ISNT, TUNEL. Для детекции результатов исследования применяется стрептавидин-пероксидазный комплекс, связывающийся с биотином. Добавление субстрата пероксидазы диаминобензидина приводит к появлению окрашенного продукта реакции. Результат оценивают при помощи светового микроскопа. Метод высоко специфичен для апоптоза, может использоваться с разнообразными типами клеток и тканей, однако относительно сложен в исполнении, требует предварительной пробопод-готовки и отработки методики под различные типы клеток.
Активность каспаз.
Каспазами (caspase — cysteinil-aspartic acid protease) называется группа протеаз из семейства ICE (Interleu^n-ta Converting Enzyme). В настоящее время у человека известно 14 каспаз. В интактной клетке каспазы синтезируются в виде неактивных предшественников — прокаспаз. При вхождении клетки в апоптоз прокаспазы протеолитически активируются регуляторными протеазами (каспазы-2, -8, -9, -10 способны активироваться, взаимодействуя с элементами рецепторов Fas-R, TNFR-1, DR и являются регуляторными) или автокаталитически. Про-теолитическая активность каспаз является ключевым исполнительным механизмом апоптоза. Основными мишенями каспаз в клетке являются протеины цитоплазмы и ядра, такие как кератин 18, поли-АДФ-рибозополимераза (PARP), ламины и др.
Измерение энзиматической активности каспаз основано на флюориметрическом или колориметрическом определении расщепления специфических пептидных субстратов [4, 5, 23, 30, 38, 40, 56, 62, 63, 67]. Каспазы расщепляют белковые субстраты по аспартатному
фрагменту последовательности. Три или четыре аминокислоты, предшествующие аспартату в пептидной последовательности, определяют специфичность каспаз. Эти особенности взаимодействия каспаз с субстратами создают возможность для разработки тест-систем активности каспаз, основанных на введении искусственных меченых пептидов, специфически расщепляемых исследуемыми каспазами. Например, активность каспазы 3 может быть оценена при помощи пептида Asp-Glu-Val-Asp, конъюгированного с флюорохромом AFC (7-amino-4-trifluoromethyl coumarin). Будучи связанным с пептидом, этот флюорохром светится в голубой части спектра (~ 400 нм). При расщеплении каспазой 3 пептида AFC освобождается и в свободном виде спектр излучения AFC смещается в зелено-желтую область (~ 505 нм), что может быть обнаружено с помощью спектрофлюориметра или флюоресцентного планшет-ридера [5, 63]. Сравнение флюоресценции AFC в исследуемом образце с контрольным образцом позволяет оценить активность каспазы 3. Также возможно обнаружение каспаз при помощи соответствующих моноклональных антител.
Продукты активности каспаз.
В настоящее время исследование активности каспаз для оценки апоптоза в клеточных популяциях представляется перспективным методом, обладающим высокой специфичностью. В исследовательской практике нашли свое применение методы, основанные на обнаружении специфических продуктов активности каспаз, например цитокератина-18, PARP [12, 44, 46, 76, 78]. Применение антител к цитокератину-18 (антитело М30) позволяет выявлять в некоторых типах клеток этот продукт [12, 46]. PARP — Poly (ADPRibose) Polymerase — ядерный протеин, активирующийся при разрывах цепочек ДНК при апоптозе. PARP принимает участие в репарации и репликации ДНК. В процессе апоптоза каспазы-3 и -7 расщепляют PARP на фрагменты, которые могут быть обнаружены с применением соответствующих антител [17, 44]. Методы выявления продуктов активности каспаз чувствительны, специфичны для апоп-тоза, могут быть использованы для детекции апоптоза клеток различных типов в суспензиях и агрегатах.
Функции и целостность митохондрий.
Процесс апоптоза включает характерные явления в митохондриях, которые могут быть обнаружены [17, 31, 47, 75]. Эти явления — снижение трансмембранного потенциала митохондрий (Ау) и увеличение проницаемо-
сти мембраны митохондрий (PT, permeability transition) — могут быть выявлены в клетках при использовании красителей, таких как JC-1 [75]. Этот липофильный краситель, несущий положительный заряд, легко проникает в клетку и далее в отрицательно заряженные митохондрии, где образует агрегаты, флюоресцирующие красным. При апоптозе Ду снижается, JC-1 покидает митохондрии и в цитоплазме мономеризуется, после чего флюоресцирует зеленым. Детекция производится с использованием флюориметрии или люминесцентной микроскопии. Помимо снижения Ду и возникновения РТ, при апоптозе происходит выделение цитохрома С из митохондрий в цитоплазму. Цитохром С в интактной клетке находится в митохондриях, и не доступен для связывания с соответствующими моноклональными антителами. Выход цитохрома С в цитоплазму при апоптозе делает возможным его обнаружение при помощи антител [9, 33, 72].
В ы в о д ы. 1. К настоящему времени разработано множество методов обнаружения апоптоза клеток и его количественной оценки. Эти методы основаны на выявлении морфологических и биохимических изменений, происходящих в клетке при апоп-тозе. Практически методы реализованы с применением лабораторных измерительных приборов, построенных на различных физических принципах и различающихся уровнем автоматизации измерений. 2. К сожалению, все описанные методы обнаружения и количественной оценки апоптоза несвободны от недостатков [10, 13, 27, 45]. К основным, наиболее значимым недостаткам, ограничивающим применимость методов, относятся низкая чувствительность, сложность выполнения методик, неприменимость по отношению к исследуемому типу клеток, субъективность некоторых способов измерения. К косвенным недостаткам следует отнести малую доступность некоторого оборудования или реактивов, специальные требования к организации лаборатории и т. д. 3. Выбор конкретного метода должен основываться на детальном анализе объекта исследования (типа клеток, ткани) и оценке соответствия предполагаемого метода задачам и условиям планируемого исследования. Кроме того, учитывая недостатки существующих методов, зачастую целесообразно параллельное, то есть одновременное использование нескольких методов, выявляющих апоптоз по различным признакам.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Allen R.T., Hunter W.J., Agrawal D.K. // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. — 1997. — 37. — P. 215—228.
2. Ansari B, Coates B.D., Greenstein B.D., Hall P.A. // J. Pathol. — 1993. — 170. — P. 1—8.
3. Attanasio A, Schiffer D. // Ibid. —1995. — 176. — P. 27—35.
4. Bedner E., Smolewski P., Amstad P., Darzynkiewicz Z. // Exp. Cell Res. — 2000. — 260. — P. 308— 313.
5. Belloc F., Belaund-Rotureau M.A., Lavignolle V. et al. // Cytometry. — 2000. — 40. — P. 151—160.
6. Boersma A.W., Nooter K., Oostrum R.G., Stoter G. // Ibid. — 1996. — 24. — P. 123—130.
7. Bratton D.L., Fadok V.A., Richter D.A. et al. // J. Biol. Chem. — 1997. — 272. — P. 26159—26165.
8. Brown D.G., Sun X.M., Cohen G.M. // Ibid. — 1993. — 268. — P. 3037—3039.
9. Bursch W., Paffe S., Barthel G., Schulte-Harmann R. // Biochem. Cell Biol. — 1990. — 68. — P. 1071— 1074.
10. Bussolati O., Belletti S., Uggeri J., Gatti R., // Exp. Cell Res. — 1995. — 220. — P. 283—291.
11. Castedo M., Hirsch T., Susin S.A. et al. // J. Immunol. — 1996. — 157. — P. 512—521.
12. Caulin C., Salveson G.S., Oshima R.G. // J. Cell Biol. —1997. — 138. — P. 1379—1394.
13. Chapman R., Chresta C.M., Herberg A.A. et al. // Cytometry. — 1995. — 20. — P. 245—256.
14. Collins J.A., Schandl C.A., Young K.K. et al. // J. Histochem. Cytochem. — 1997. — 45. — P. 923— 934.
15. Darzynkiewicz Z., Bedner E., Traganos F., Murakami T. // Hum. Cell. — 1998. — 11. — P. 3—12.
16. Darzynkiewicz Z., Juan G., Li X. et al. // Cytometry. — 1997. — 27. — P. 1—20.
17. Davis R.E., Mysore V., Browning J.C., Hsieh J.C., // J. Histochem. Cytochem. — 1998. — 46. — P. 1279—1289.
18. Del Bino G., Darzynkiewicz Z., Degraef C. et al. // Cell Prolif. —1999. — 32. — P. 25—37.
19. Deng G. and Wu R. // Methods in Enzymol. — 1983. — 65. — P. 43—62.
20. Didenko V.V. and Hornsby P.J. // J. Cell Biol. — 1996. — 135. — P. 1369—1376.
21. Didenko V.V., Tunstead J.R., Hornsby P.J. // Amer. J. Pathol. — 1998. — 152. — P. 897—902.
22. Didenko V.V., Hornsby P.J. // U.S. Patent Application. — 1996. — Ser. No. 08/758,027.
23. Earnshaw W.C., Martins L.M., Kaufmann, S.H. // Annu. Rev. Biochem. — 1999 — 68. — P. 383— 424.
24. Ferlini C., Kunkl A., Scambia G., Fattorossi A. // J. Immunol. Methods. — 1997. — 205. — P. 95—101.
25. Frankfurt O.S., Robb JA, Sugarbaker E.V., Villa L. // Exp. Cell Res. — 1996a. — 226. — P. 387— 397.
26. Frankfurt O.S., Robb JA, Sugarbaker E.V., Villa L. // Anticancer Res. — 1996b. — 16. — P. 1979—1988.
27. Fujita K., Ohyama H., Yamada T. // Histochem. J. — 1997. — 29. — P. 823—830.
28. Gatti R., Belletti S, Orlandini G. et al. // J. Histochem. Cytochem. — 1998. — 46. — P. 895 — 900.
29. Gavrieli Y., Sherman Y., Ben-Sasson S.A. // J. Cell Biol. — 1992. — 119. — P. 493—501.
30. Gorman A.M., Hirt U.A., Zhivotovsky B. et al. // J. Immunol. Meth. — 1999. — 226. — P. 43—48.
31. Green D.R., Reed, J.C. // Science. — 1998. — 281. — P. 1309—1312.
32. Hikim A.O., Lue Y., Swerdloff R.S. // Tissue Cell. — 1997. — 29. — P. 487—493.
33. Jemmerson R., Liu J., Hausauer D. et al. // Biochemistry. — 1999. — 38. — P. 3599—3609.
34. Kamentsky L.A., Burger D.E., Gershman R.J. et al. // Acta Cytol. — 1997. — 41. — P. 123—143.
35. Kashima K., Yokoyama S., Daa T. et al. // Virchows Arch. — 1997. — 430. — P. 333—338.
36. Kerr J.F., Wyllie A.H., Currie A.R. // Brit. J. Cancer. — 1972. — 26 (4). — P. 239—257.
37. Kockx M.M., Muhring J., Knaapen M.W.M., de Meyer G.R.Y. // Amer. J. Pathol. — 1998. — 152. — P. 885—888.
38. Koester S.K., Bolton W.E. // Methods Cell Biol. — 2001. — 63. — P. 487—504.
39. Koester S.K., Roth P., Mikulka W.R. et al. // Cytometry. — 1997. — 29. — P. 306—312.
40. Komoriya A., Packard B.Z., Brown M.J. et al. // J. Exp. Med. — 2000. — 191. — P. 1819—1828.
41. Koopman G., Reutelingsperger C.P., Kuijten G.A. et al. // Blood. — 1994. — 84. — P. 1415—1420.
42. Labat-Moleur F., Guillermet C., Lorimer P. et al. // J. Histochem. Cytochem. — 1998. — 46. — P. 327—334.
43. Laster S.M., Mackenzie J.M. // Microsc. Res. Tech. — 1996. — 34. — P. 272—280.
44. Lazebnik Y., Kaufmann S.H., Desnoyers S. et al. // Nature. — 1994. — 371. — P. 346—347.
45. Lecoeur H., Ledru E., Prevost M.C., Pougeon M.L. // J. Immunol. Methods. — 1997. — 209. — P. 111—123.
46. Leers M.P., Kolgen W, Bjorklund V. et al. // J. Pathol. — 1999. — 187. — P. 567—572.
47. Lemasters J.J., Nieminen A.L., Qian T. et al. // Biochim. Biophys. Acta. — 1998. — 1366. — P. 177— 196.
48. Martin S.J., Reutelingsperger C.P., McGahon A.J. et al. // J. Exp. Med. —1995. — 182. — P. 1545—1556.
49. Modak S.P., Bollum F.J. // Exp. Cell Res. — 1972. — 75. — P. 307—313.
50. Nakamura M, Yagi H, Ishii T. et al. // Europ. J. Immunol. — 1997. — 27. — P. 999—1004.
51. Naruse I., Keino H., Kawarada Y. // Histochemistry.
— 1994. — 101. — P. 73—78.
52. Negoescu A., Lorimier P., Labat-Moleur F. et al. // J. Histochem. Cytochem. — 1996. — 44. — P. 959—968.
53. O'Brien I.E., Reutelingsperger C.P., Holdaway K.M. // Cytometry. — 1997. — 29. — P. 28—33.
54. Ormerod M.G, Sun X.-M, Snowden R.T. et al. // Ibid. — 1993. — 14. — P. 595—602.
55. Overbeek R., Yildirim M., Reutelingsperger C., Haanen C. // Apoptosis. — 1998. — 3. — P. 115—120.
56. Packard B.Z., Komoriya A., Brotz T.M., Henkart P.A. // J. Immunol. — 2001. — 167. — P. 5061— 5066.
57. Packard B.Z., Topygin D.D., Komoriya A., Brand L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1996. — 93. — P. 11,640—11,645.
58. Pulkkinen J.O., Elomaa L., Joensuu H. et al. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. — 1996. — 122. — P. 214—218.
59. Rimon G., Bazenet C.E., Philpott K.L., Rubin L.L. // J. Neurosci. Res. — 1997. — 48. — P. 563—570.
60. Sanders E.J. // Histol. Histopathol. — 1997. — 12. — P. 1169—1177.
61. Schulze-Osthoff K., Walczak H, Droge W, Krammer P.H. // J. Cell Biol. — 1994. — 127. — P. 15—20.
62. Smolewski P., Bedner E., Du L. et al. // Cytometry.
— 2001. — 44. — P. 73—82.
63. Srinivasan A., Roth K.A., Sayers R.O. et al. // Cell Death Differ. — 1998 — 5. — P. 1004—1016.
64. Tateyama H., Tada T., Hattori H. et al. // Arch. Pathol. Lab. Med. — 1998. — 122. — P. 252—255.
65. Tatton N.A., Maclean-Fraser A., Tatton W.G. et al. // Ann. Neurol. — 1998. — 44. — P. S142—148.
66. Telford W.G., King L.E., Fraker P.J. // J. Immunol. — 1994. — 172. — P. 1 — 16.
67. Telford W.G., Komoriya A., Packard B.Z. // Cytometry. — 2002. — 47. — P. 81—88.
68. Tkach A., Ivanova L., Stacenko J. // 28-th International Congress on Occupational Health. — Milan,
Italy, 2006. — P. 573.
69. Tornusciolo D., Schmidt R.E., Roth K.A. // BioTechniques. — 1995 — 19. — P. 800—805.
70. van Engeland M., Kuijpers H.J.K., Ramaekers F.C.S. et al. // Exp. Cell Res. — 1997. — 235. — P. 421—430.
71. Van Engeland M., Nieland L.J., Ramaekers F.C. et al. // Cytometry. — 1998. — 31. — P. 1—9.
72. Varkey J., Chen P., Jemmerson R., Abrams J.M. // J. Cell Biol. — 1999. — 144. — P. 701—710.
73. Vermes I., Haanen C., Reutelingsperger C. // J. Immunol. Methods. — 2000. — 243. — P. 167—190.
74. Wyllie A.H., Beattie G.J., Hargreaves A.D. // Histochem. J. — 1981. — 13. — P. 681—692.
75. Xu X., Gerald A.L., Huang B.C. et al. // Nucleic Acids Res. — 1998. — 26. — P. 2034—2035.
76. Yang F., Sun X., Beech W. et al. // Amer. J. Pathol. — 1998. — 152. — P. 379—389.
77. Zhang G., Gurtu V., Kain S.R., Yan G. // Biotechniques. — 1997. — 23. — P. 525—531.
78. Zhang C., Ao Z., Seth A., Schlossman S.F. // J. Immunol. —1996. — 157. — P. 3980—3987.
79. Zhu L., Chun J. Apoptosis Detection and Assay Methods / Natick M.A. — Biotechniques Books, Eaton Publishing, 1998.
Поступила 09.02.07
